CC BY
33
а
(19) 2006
УДК 612.821.3:616-097-092.4
ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГРАНЗИМ 5-СОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ИММУННЫХ ОРГАНАХ КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ СТРЕССЕ
М.Ю. Капитонова, А.И. Краюшкин, Н.А. Мураева, О.В. Федорова, А.А. Нестерова
Кафедра гистологии, эмбриологиии цитологии; кафедра анатомии человека ВолГМУ
В статье анализируется влияние хронического стресса на распределение NK-клеток в компартментах селезенки и лимфатических узлов экспериментальных животных в различные возрастные периоды раннего постна-тального онтогенеза. Показана динамика стресс-ассоциированных изменений иммунных параметров, относящихся к врожденному иммунитету.
Ключевые слова: хронический стресс, иммунитет врожденный, NK-клетки, гранзим Б, селезенка, лимфатические узлы, ранний постнатальный онтогенез.
AGE-RELATED DISTRIBUTION OF GRANZYME B-POSITIVE
CELLS IN THE RAT PERIPHERAL IMMUNE ORGANS UNDER CHRONIC STRESS CONDITIONS
M.Yu. Kapitonova, A.I. Krayushkin, N.A. Muraeva, O.V. Fedorova, A.A. Nesterova
Abstract. Impact of the chronic stress on the NK cells distribution in the spleen and lymph node compartments of the experimental animals is under evaluation. Age-related dynamics of the stress-associated changes of the innate immune parameters is presented in the paper.
Key words: chronic stress, innate immunity, NK-cells, granzyme B, spleen, lymph nodes, early postnatal ontogenesis.
Стресс оказывает мощное воздействие на иммунный статус организма, влияя на разные звенья иммунного ответа, однако, несмотря на многочисленность исследований в области ней-роиммуноэндокринологии в последние годы, до сих пор единого понимания характера и направленности стресс-ассоциированных иммуномоду-ляционных сдвигов не достигнуто [1, 2]. Сохраняются противоречия в интерпретации результатов воздействия разных видов стресса на врожденный иммунитет. Так, одни исследователи показывают, что острый стресс стимулирует врожденный иммунный ответ, влияя на активность нейтрофилов, макрофагов и ЫК-клеток, а хронический стресс оказывает дифференцированное действие на разные звенья иммунного ответа: тормозящее - на нейтрофилы и активирующее - на 1МК-клетки [10]. Другие исследователи демонстрируют снижение активности ЫК-кле-ток и их числа, а также антиген-презентирующей способности моноцитов в селезенке, что связывают с повышенным уровнем кортикостероидов [4, 17]. В противоположность этому другими авторами показано увеличение числа !МК-клеток в селезенке при стрессе [6] с одновременным снижением их активности [12]. Вопреки всему этому было продемонстрировано, что количество МК-клеток в селезенке при остром иммобилиза-ционном стрессе не меняется, несмотря на то, что они содержат рецепторы и к глюкокорти-
коидам^, и к опиоидам, уровень которых при действии стрессоров значительно возрастает, и pea-, гируют на стимуляцию симпатической нервной системы, активируемой при стрессе [7].
NK-клетки являются основным компонентом врожденного иммунитета, однако они регулируют и адаптационный иммунный ответ. Они осуществляют ранний контроль репликации вируса с помощью перфорин-опосредованного механизма, имеют возможность мигрировать в очаг инфекции и гибнуть апоптозом вскоре после инфицирования. Главная функция NK-клеток - это секреция цитокинов и прямая цитотоксичность. Гранулы цитоплазмы активированных NK-клеток и цито-токсических лимфоцитов содержат порообра-зующий белок перфорин и несколько гомологичных серин-протеаз (гранзимов) [8]. Данные о влиянии стресса на иммунный ответ растущего организма в литературе единичны и выполнены в основном с применением иммунологических методов исследования, не позволяющих оценить иммуно-модуляционные изменения с учетом компар-тментализации иммунных органов [7, 9, 18].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияние хронического стресса на динамику гранзим Б-содержащих клеток, связанных с естественным иммуногенезом, в компартментах селезенки растущих экспериментальных животных.
ааетаош зэасгшу
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовано 36 экспериментальных животных - белых крыс породы Sprague Dawley трех возрастных групп: грудного, подсосного и инфантного периодов (14, 21 и 30 дней от роду соответственно) по 12 животных в группе. Каждая возрастная группа подразделялась на 2 подгруппы: экспериментальную и контрольную по 6 животных в подгруппе. Экспериментальные животные подвергались действию хронического иммерсионно-иммобилизационного стресса [16] на протяжении 7 дней по 5 часов ежедневно. По окончании последнего сеанса стресса животных забивали под эфирным наркозом, извлекали, взвешивали и фиксировали формалином органы иммунной и эндокринной систем (селезенку, тимус, надпочечники), макроскопически оценивали также состояние слизистой оболочки желудка. Парафиновые срезы органов окрашивали гематоксилином и эозином. Дополнительно серийные срезы селезенки окрашивали иммуногистохими-чески мышиными противокрысиными антителами к CD3 (clone 1F4, "Serotec"), мышиными противокрысиными антителами к CD8 (клон MRC 0X8, "Serotec"), мышиными антителами к гранзиму Б (клон GB7, "Serotec"). Распределение гранзим Б-иммунореактивных клеток оценивали с помощью имидж-анализа с применением программы "Image Рго+" (микроскоп "NIKON Eclipse Е200", камера "Nikon Coolpix 995", Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование показало, что у всех экспериментальных животных трех возрастных групп отмечаются: акцидентальная инволюция тимуса и селезенки, гипертрофия надпочечников и эрозивные повреждения слизистой оболочки желудка. Микроскопически в селезенке выявлены характерные для хронического стресса инволютивные изменения, проявляющиеся в гипоплазии белой пульпы: уменьшении ее объема, снижении числа лимфоидных узелков, практически полном исчезновении герминативных центров, сужении внутренней и наружной зоны периартериальных лимфоидных влагалищ (ПАЯВ), увеличении частоты апоптозов лимфоидных клеток не только в лимфоидных узелках, но и ПАЯВ, сужении маргинальной зоны (рис. 1). В лимфатических узлах экспериментальных животных отмечалось сужение коркового вещества и пара-кортикальной зоны, уменьшение их клеточности, уменьшение числа и деформация лимфоидных узелков и герминативных центров (последнее справедливо для старшей возрастной группы), увеличение числа апоптозов как в лимфоидных фолликулах, так и в паракортикальной зоне (рис. 2).
CD8+ иммунореактивные клетки присутствовали у контрольных животных всех возрастных
(19) 2006
групп преимущественно в ПАЯВ селезенки и паракортикальной зоне лимфатических узлов (рис. 3, 4). Известно, что данный маркер экспрес-сируют не только цитолитические лимфоциты, двойные позитивные лимфоциты, но и примерно половина NK-клeтoк [13], хотя последние, в отличие от цитотоксических лимфоцитов, не экспрес-сируют Т-клеточный маркер СЭЗ+ [3, 5,]. Гранзим Б-позитивные клетки у контрольных животных присутствовали как в красной и белой пульпе, так и маргинальной зоне селезенки (рис. 5, 6). В лимфатических узлах контрольных животных их число было чрезвычайно мало. Стресс значительно изменял количество и распределение гранзим Б-позитивных клеток в селезенке, и это изменение имело свою специфику в различных возрастных группах (рис. 7, 8).
Так, в младшей возрастной группе гранзим В-клетки практически полностью исчезали из маргинальной зоны и белой пульпы, однако сохранялись мелкими конгломератами или рассеянными в красной пульпе. В средней возрастной группе в маргинальной зоне иммунореактивные клетки также практически отсутствовали, однако единичные клетки сохранялись в белой пульпе -в крупных ПАЯВ, а именно в наружной их зоне на границе с маргинальной зоной. В красной пульпе число гранзим Б-позитивных клеток также заметно снижалось. В старшей возрастной группе уменьшение числа иммунореактивных клеток не столь выражено, как в младшей и средней группах. Сохранялись единичные гранзим Б-пози-тивные клетки в маргинальной зоне, в крупных и средних ПАЯВ, в то время как красной пульпе число их уменьшалось незначительно по сравнению с контролем. При этом и у экспериментальных, и у контрольных животных всех возрастных групп число С08+ и СРЗ+ клеток было в несколько раз ниже, чем число иммуногистохими-чески выявляемых гранзим Б-позитивных клеток.
Имидж-анализ в основном подтвердил данные, обнаруженные на качественном уровне, дополнив их некоторыми подробностями. Так, удельная площадь гранзим Б-иммунореактивных клеток у контрольных животных была 4,8+/—0,51, 4,6+/—0,43 и 5,4+/—0,55 % в младшей, средней и старшей группах соответственно. У экспериментальных животных всех возрастных групп имело место снижение удельной площади иммунореактивных клеток до 3,1+/-0,30 % у животных грудного возраста (р < 0,01), до 2,9+/—0,27 % у животных в период перехода на самостоятельное питание (р < 0,001) и до 4,0+/-0,38 % у перипу-бертатных особей (р < 0,05).
Таким образом, проведенное количественное иммуногистохимическое исследование показало наличие в селезенке крыс всех трех изученных возрастных групп наличие иммуносуппрес-сивных изменений, которые касались параметров естественного иммунитета - количества МК-клеток
ЗЗЗШЖШ ВсаиОШ7 lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
Рис. 1. Селезенка экспериментальной крысы в возрасте 27 дней:
1 - практически полное исчезновение маргинальной зоны и разрежение клеток в периартериальной зоне; 2 - резкое уменьшение объема белой пульпы; 3 - центральная артериола. Окр. гематоксилином и эозином. Ув. хЮО
_ 2
Рис. 2. Лимфатический узел экспериментальной крысы в возрасте 27 дней:
1 - увеличение числа апоптозов в лимфоидном фолликуле; 2- снижение клеточности коркового вещества; 3 - капсула; 4 - расширенный маргинальный синус. Окр. гематоксилином и эозином. Ув. х400
Рис. 3. Селезенка контрольной крысы в возрасте 36 дней:
1 - артерия белой пульпы; 2 - иммунореактивные клетки; 3 - маргинальная зона; 4- ПАЯВ. Окр. на CD8, докр. гематоксилином. Ув. х200
Рис. 4. Лимфатический узел контрольной крысы в возрасте 36 дней:
1 - паракортикальная зона; 2 - единичные клетки в корковом веществе; 3 - иммунореактивные клетки. Иммуногистохимическое окр. на CD8, докр. гематоксилином. Ув. х200
Шш
•'* - -Л
^2006
/I 4' #>**' * Т'
«V ■
*
«, «г # «ж ¿¡г 'г -'"в 'Ж . ^
£ » V — ;. „ о*?- -«V.
Рис. 5. Селезенка 27-дневного контрольного животного:
1 - терминальная артериола; 2 - мелкие ПАЛВ селезенки; 3 - иммунореактивные клетки. Иммуногисто-химическое окр. на гранзим Б, докр. гематоксилином. Ув. х400
Рис. 6. Селезенка 36-дневного контрольного животного:
1 - гранзим Б-позитивные клетки; 2 - селезеночные тяжи. Иммуногистохимическое окр. на гранзим Б, докр. гематоксилином. Ув. х400
Рис. 7. Снижение числа иммунореактивных клеток в белой пульпе селезенки животных после хронического водоиммерсионного стресса в возрасте 36 дней:
1 - иммунореактивные клетки; 2- красная пульпа; 3-терминальная артериола; 4 - ПАЛВ. Иммуногистохимическое окр. на гранзим Б, докр. гематоксилином. Ув. х200
Рис. 8. Резкое снижение числа иммунореактивных клеток в белой и красной пульпе селезенки животных после хронического водоиммерсионного стресса в возрасте 27 дней: 1 - капсула; 2- иммунореактивные клетки; 3- красная пульпа; 4 - ПАЛВ. Иммуногистохимическое окр. на гранзим Б, докр. гематоксилином. Ув. х200
(19)
200S
в периферических иммунных органах. Эти клетки выявлялись гистохимически с помощью моно-клональных антител против гранзима Б-содер-жимого гранул этих клеток. Помимо МК-клеток, гранзимы (серин-протеазы) содержатся в цито-литических Т-лимфоцитах (ЦТЛ), которые экс-прессируют маркеры Сй8+ и СОЗ+. Считается, что примерно половина ЫК-клеток также экс-прессирует маркер Сй8+ [13], однако наше исследование показало, что доля гранзим Б-поло-жительных клеток в селезенке крыс всех изученных возрастных групп значительно ниже, чем доля С08+ и СЭЗ+клеток; кроме того, из литературных данных известно, что у крыс в селезенке в отсутствие антигенной стимуляции ЦТЛ чрезвычайно малочисленны, и гранзим Б+ клетки -это, в основном, ЫК-клетки [3, 5].
Проведенное исследование показало, что наиболее значительное снижение число ЫК-клеток отмечается в период перехода на самостоятельное питание. Известно, что ЫК-клетки проявляют цитотоксичность по отношению, прежде всего, к инфицированным вирусами и опухолевым клеткам, следовательно, именно в данные возрастные периоды опасность стресс-ассо-циированного снижения противовирусного и противоопухолевого иммунитетов особенно велика. При этом, прежде всего, хронический стресс вызывает содержание иммуногистохимически выявляемых МК-клеток в маргинальной зоне, в которой при развитии вирусной инфекции появляются первые инфицированные клетки [3, 5].
Полученные нами данные противоречат данным других исследователей относительно увеличения экспрессии гранзима Б, доли и активности МК-клеток при стрессе [6, 9, 10, 12] или относительно не зависящего от стресса количества ЫК-кпеток периферических иммунных органах [7], что может быть связано в различными методическими подходами, видами стресса и возрастом экспериментальных животных. Выделяют несколько механизмов снижения МК-клеточности в селезенке при стрессе: избыточная гибель и измененный траффик клеток под действием стресс-индуцированного повышения концентрации глюкокортикоидов, опиоидов и адренер-гической стимуляции (в связи с чем примене-
ние антагонистов-рецепторов к кортикостеро-дам и опиоидам, а также Р-адреноблокаторов способно восстановить сниженную цитотоксичность и численность NK-клеток) [11, 14, 18, 19].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные нами данные о возрастной динамике параметров врожденного иммунного ответа могут быть учтены при разработке лечебных тактик, предотвращающих развитие стресс-ассоцированной иммуносуппрессии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сапин М.Р., Никитюк Д.Б. Иммунная система, стресс и иммунодефицит. М.: Джангар, 2000. - 184 с.
2. Тендитник М.В., Шурлыгина А.В., Мельникова Е.В. и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. -2004.-Т. 90, № 12. - С. 1522-1529.
3. Amsen D., Blander J.М., Lee G.R., et al. // Cell. -2004. - Vol. 117. - № 4. - P. 515-526.
4. Dhabhar F.S., McEwen B.S. II J. Immunol. -1996. - Vol. 156. - № 7. - P. 2608-2615.
5. Dokun A.O., Chu D.T. Yang L, et al. // J. Immunol. - 2001. - Vol. 167, № 9. - P. 5286-5293.
6. Goebel M.U., Mills P.J. II Psychosom. Med. -200. - Vol. 62. - N5. - P. 664-670.
7. Kanemi O., Zhang X., Sakamoto Y., et al. II Clin. Exp. Immunol. - 2005. - Vol. 139, № 1. - P. 25-34.
8. Kummer J.A., Kamp A.M., Tadema T.M., et al. // Clin. Exp. Immunol. - 1995. - Vol. 100, № 1. - P. 164-172.
9. Nieman D.C., Pedersen B.K. II Sports Med. -1999.-Vol. 27, №2.-P. 73-80.
10. Nunez M.J., Balboa J., Rodrigo £., et al. // Neurosci. Lett. - 2006. - Vol. 396, № 3. - P. 247-251.
11. Oya H., Kawamura Т., Shimizu Т., et al. // Clin. Exp. Immunol.-2000.-Vol. 121, № 2. - P. 384-390.
12. Parslow T.G., Stites D.P., Terr A.I., et al. / Ed. by T.G. Parslow. - N.-Y.: Lange Medical Books, 2001.-814 p.
13. Sheridan J.F., Dobbs C., Jung J., et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1998. - Vol. 840. - P. 803-808.
14. Stefanski V., Engler H. II J. Neuroimmunol. -1999. - Vol. 94, № 1-2. - P. 144-152.
15. Takagi K., Kasuya Y., Watanabe К. II Chem. Pharm. Bull. - 1964. - Vol. 12. - P. 465-472.
16. Toft P., Dagnaes-Hansen F., Tonnesen E., et al. // Acta Anaesthesiol. Scand. - 2002. - Vol. 46, № 4. -P. 405-410.
17. Tseng R.J., Padgett D.A., Dhabhar F.S., et al. // Brain Behav. Immun.-2005.-Vol. 19, № 2.-P. 153-164.
18. Xia X., Pan Y„ Zhang W.Y., et al. // Biol. Pharm. Bull. - 2006. - Vol. 29, № 5. - P. 938-944.
