CC BY
45
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ДИФФУЗИОННО-УПОРЯДОЧЕННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ ПУЛЛУЛАНОВ
Н.Е. Кузьмина, С.В. Моисеев, В.И. Крылов, В.А. Яшкир, В.А. Меркулов
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва MoiseevSV@expmed.ru
Резюме: В статье показана возможность применения метода диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР для изучения молекулярно-массового распределения и количественной оценки средневесовой молекулярной массы по-лидисперсных пуллуланов в широком диапазоне молекулярных масс. Получено регрессионное уравнение зависимости между величинами среневесовых молекулярных масс и коэффициентов самодиффузии пуллуланов, которое можно использовать в качестве калибровочного при количественной оценке среднемассовой молекулярной массы этих полисахаридов.
Ключевые слова: диффузионно-упорядоченная спектроскопия ЯМР, коэффициент самодиффузии, средневесовая молекулярная масса, пуллуланы.
THE POSSIBILITY OF USING DIFFUSION-ORDERED NMR SPECTROSCOPY FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF PULLULAN AVERAGE MOLECULAR WEIGHT N.E. Kuzmina, S.V. Moiseev, V.I. Krylov, V.A. Yashkir, V.A. Merkulov
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Abstract: The article describes a possibility of using diffusion-ordered NMR spectroscopy technique for the investigation of molecular weight distribution and for quantitative analysis of the weight-average molecular weight of polydispersepullulans in a wide range of molecular weights. The regression equation of the relationship between the values of weight-average molecular weights and pullulan self-diffusion coefficient has been derived. It can be used for calibration in quantitative analysis of the weight-average molecular weight of these polysaccharides.
Key words: diffusion-ordered NMR spectroscopy, diffusion coefficient, weight-average molecular weight, pullulans.
Одно из важных мест в фармакотерапии многих заболеваний инфекционной и неинфекционной природы занимают лекарственные средства на основе полисахаридов. Установлено, что полисахариды стимулируют кроветворение и иммуногенез, а также неспецифическую резистентность к инфекции, интоксикации и лучевым поражениям, оказывают положительное влияние на течение воспалительного процесса, повышают устойчивость клеточных мембран и усиливают регенерацию тканей, активируют гипофизадреналовую систему [1]. В последнее время способность корректировать гемодинамические нарушения и активировать факторы иммунологической устойчивости организма была выявлена у пуллуланов — полисахаридов, продуцируемых в ходе микробиологического синтеза бактериями АетЬа^шт рШапа рЫЫат. Было установлено, что изоволеми-ческое возмещение пуллуланами кровопотери при геморрагическом шоке способствует быстрому устранению гипотензивной реакции и стабилизации системного артериального давления [2]. Радиационнохимическая модификация этих биополимеров при-
дает лекарственным средствам на их основе свойства направленной стимуляции гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, комплемента и интер-фероногенеза [3, 4].
Важной характеристикой пуллуланов, непосредственно влияющей на их физико-химические свойства, метаболизм и экскрецию, является средняя молекулярная масса. Количественное определение этого параметра у полимеров — достаточно сложная задача, которая в настоящее время решается с использованием различных физико-химических методов: осмометрии, вискозиметрии, ультрацентрифугирования, лазерной фотометрии светорассеяния и эксклюзи-онной гель-проникающей хроматографии (ГПХ). Новым и перспективным методом определения средней молекулярнорй массы полимеров является метод диффузионно-упорядоченной спектроскопии ЯМР (Diffusion Ordered Spectroscopy, DOSY). Метод DOSY ЯМР позволяет измерить диффузию различных молекулярных объектов (молекул, макромолекул, молекулярных комплексов, супрамолекулярных систем) под действием градиента магнитного поля [5—7].
Диффузную информацию можно использовать для количественной оценки размера молекулярного объекта и, соответственно, его молекулярной массы. Исследования последних лет показали, что метод DOSY ЯМР обладает большим потенциалом в исследовании средних молекулярных масс полимеров [8—10]. Цель данной работы — изучить зависимость диффузии макромолекул пуллуланов под действием градиента магнитного поля от их молекулярной массы и показать возможность применения метода DOSY ЯМР для количественной оценки средней молекулярной массы пуллуланов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования использовали стандартные образцы пуллуланов производства компании Shodex (Япония), серия Р-82 со средними молекулярными массами М 1 5,9 кДа, 9,6 кДа, 21,1 кДа, 47,1 кДа, 107,0 кДа, 200 ¿Да, 344 кДа, 708,0 кДа. Регистрацию спектров Н и Н- DOSY проводили на ЯМР спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 при температуре 300 К. Анализируемые образцы в количестве 5 мг растворяли в 0,5 мл D2O (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.), полученные растворы разбавляли в 10 раз и переносили в ЯМР-ампулы Shigemi со стеклянным плунжером для минимизации эффектов конвекции и неоднородности импульсов градиента магнитного поля. Для измерения коэффициентов самодиффузии использовалась последовательность DBPPSTE (DOSY Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo). Кривые диффузионного затухания получали при последовательном 15-шаговом линейном увеличении амплитуды импульса градиента магнитного поля в интервале от 1,8 до 53 Гс/см при фиксированных значениях времени диффузии А (285 мс), длительности градиентного импульса б (2,0 мс) и времени релаксации d1 (5с). Математическую обработку результатов осуществляли методом DISCRETE (Discrete Sum of Exponential Decays). Вывод корреляционного уравнения осуществляли с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярная структура пуллуланов представляет собой полидисперсный линейный полимер глюкозы, состоящий из мальтотриозных единиц, соединенных а (1^6) — связями (рис. 1).
Вследствие полидисперсности любой образец пуллулана является набором макромолекул разной длины и разной массы, который описывают молекулярно-массовым распределением (ММР). Поэтому молекулярная масса полидисперсного полимера — среднестатистическая величина, зависящая от ММР и способа определения (т. е. типа усреднения). В химии полимеров различают среднечисловую (Mn) и
Рис. 1. Молекулярная структура мальтотриозной единицы пуллулана
среднемассовую (Мщ) молекулярные массы. Мп получают усреднением по числу макромолекул в полимере, Мщ — усреднением по массе макромолекул в полимере. Различные экспериментальные методы позволяют измерить молекулярные массы разной степени усреднения. Так, Мп определяют методами эбулиографии, паровой и мембранной осмометрии, криоскопии, методами определения концевых групп; методами светорассеяния, седиментации и диффузии. Поскольку метод БОБУ-ЯМР, аналогично методу ГПХ, основан на учете диффузионных эффектов, он позволяет определять Мщ.
Количественной характеристикой диффузии молекулярного объекта под действием градиента магнитного поля является его коэффициент самодиффу-зии (Б). Для оценки значения Б молекулярных объектов в растворах в приближении диффузии твердой сферической частицы в изотропной континуальной среде применяют уравнение Стокса-Энштейна [9]:
Б=к ■ Т/6лцЯк, (I)
где к — постоянная Больцмана (Дж • К-1), Т — абсолютная температура (К), п — вязкость раствора (Н • с • м-2), Як — гидродинамический радиус (м).
Для полимеров зависимость гидродинамических радиусов макромолекул от молекулярной массы хорошо описывается скейлинговым соотношением Флори[9]:
Я„ ~ Ма, (II)
где а — параметр, определяемый формой исследуемого объекта.
Отсюда следует, что при постоянных температуре, растворителе и концентрации раствора количественная зависимость молекулярной массы пуллуланов от коэффициента самодиффузии будет описываться степенной функцией: М= сБ-а, где с и а — числовые константы, определяемые формой макромолекулы пуллулана.
При определении числовых констант корреляционного уравнения Мщ=сБ- а мы измеряли диффузионные характеристики растворов пуллуланов при фиксированных параметрах БОБУ ЯМР эксперимента
1 М — молекулярная масса в максимуме пика при определении средней молекулярной массы полимера методом ГПХ
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Ведомости НЦЭСМП
0.53 0.1В 0.41 0.40 0.35 0.33 0.2В 0.34 €.20 0.16 0.13 О.Ой 0.04 0.00 -0.01 -0.09 О
Рис. 2. Коэффициенты самодиффузий (В) различных молекулярных фракций стандартном образце пуллулана Р-200
900
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Рр*10-10, м2/ с
Рис. 3. Зависимость между экспериментальными значениями молекулярных масс Мр и коэффициентов самодиффузии Вр стандартных образцов пуллуланов
(А и д). Значения этих параметров подбирали таким образом, чтобы воспроизвести литературное значение коэффициента самодиффузии воды в растворах полисахаридов (20,2x10 -10м2с -1 [10]) и обеспечить эффективное затухание сигнала спинового эха в течение действия импульсной последовательности.
Каждый стандартный образец пуллулана пред-
ставляет собой смесь молекулярных фракций в достаточно узком диапазоне молекулярных масс. Поэтому результатом проведения ВОБУ-ЯМР эксперимента с использованием одного стандартного образца является набор близких по значению величин В, характеризующих способность к диффузии каждой конкретной молекулярной фракции этого полимера. Например, на рис. 2 представлена диаграмма распределения В в стандартном образце пуллулана Р-200, которая отражает молекулярно-массовое распределение в нем.
Из рис. 2 видно, что при подобранных условиях проведения ВОБУ-ЯМР эксперимента (с = 1 мг/ мл, I = 300 °К, А = 285 мс, б = 2 мс, интервал амплитуды импульса градиента магнитного поля 1,8^53 Гс/ см) можно разделить смесь гомополимеров пуллулана и оценить количественно вклад каждой молекулярной фракции.
Максимальному пику на диаграмме распределения коэффициентов самодиффузии (Вр) соответствует фракция с молекулярной массой М. Экспериментальные значения В р * р пуллуланов и В воды водных растворов различных стандартных образцов пуллуланов представлены в табл. 1.
Низкая неопределенность измерения Вр пуллуланов и стабильность воспроизведения литературного значения В воды свидетельствуют о корректности полученных результатов.
Графическая зависимость величин Мр от В, представленная на рис. 3, описывается степенной функцией Ж=9,4862Б -1,801.
^ р 5 р
Таблица 1
КОЭФФИЦИЕНТЫ САМОДИФФУЗИИ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ ПУЛЛУЛАНОВ, ОПРЕДЕЛЕННЫЕ МЕТОДОМ DOSY-ЯМР (с=1 мг/мл, 1=300К, б=2ше, А=285ше)
Пуллулан М пуллулана, kDa D пуллулана, 10-10 м2/с D воды, 10-10 м2/с
Р-5 5,9 1,31±0,001 20,2±0,1
Р-10 9,6 0,940±0,002 20,2±0,1
Р-20 21,1 0,642±0,004 20,2±0,1
Р-50 47,1 0,410±0,003 20,2±0,1
Р-100 107,0 0,279±0,003 20,2±0,1
Р-200 200,0 0,193±0,005 20,2±0,1
Р-400 344,0 0,135±0,002 20,2±0,1
Р-800 708,0 0,086±0,002 20,1±0,1
Высокий коэффициент детерминации (R2=0,9979) характеризует хорошее качество установленной регрессионной зависимости. Полученное уравнение можно использовать в качестве калибровочного при количественной оценке среднемассовой молекулярной массы пуллуланов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основе изучения распределения значений коэффициентов самодиффузии в различных стандартных образцах пуллуланов можно сделать следующий
ЛИТЕРАТУРА
1. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2004. 448 с.
2. Хлябич Г.Н. Основные направления исследований по созданию перспективных технологий производства кровезаменителей.//
Тез. докл. IV Всесоюзн. научн.-техн. конф. «Актуальные проблемы улучшения качества кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтических препаратов»
(24-25 сентября 1991 г.). М., 1991. C. 3-9.
3. Кривенко С.И., Кушнерова Г.И., Гапанович В.Н. и др. Влияние нового кровезаменителя на основе полисахарида пуллулана на пролиферативную активность кроветворных предшественников костного мозга человека и мыши in vitro // Тез. докл. Междунар. научн. конф. «Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов». Минск, 1998. C. 39-41.
4. Горецкая, И.С., Давыдов О.В., Петров П.Т. и др. Изучение в культурах клеток интерфероногенных свойств неорондекса // Тез. докл. Межд. научн. конф. «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника» (Минск, 14-16 ноября 2001 г). Минск, 2001.
С. 53-56.
вывод: метод ВОБУ-ЯМР спектроскопии можно использовать при определении молекулярно-массового распределения и количественной оценке средневесовой молекулярной массы полидисперсных пуллуланов в широком диапазоне молекулярных масс. Преимуществом этого метода является получение наряду с диффузной также традиционной спектральной информации (значения химических сдвигов, мульти-плетность сигналов), которая позволяет решать задачу определения строения полимера одновременно с задачей определения его средневесовой массы.
5. Morris K.F and Johnson Jr. C.S. Diffusion Ordered 2D-NMR Spectroscopy. //J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 3139-3141.
6. Price W.S. Pulsed-field gradient nuclear magnetic resonance as a tool for studying translational diffusion: part 1. Basic theory. //Concept. Magn. Reson. 1997. V.9. P. 299-336.
7. Price W. S. Pulse-Field Gradient Nuclear Magnetic Resonance as a Tool for Studying Translational Diffussion Part 2. Experimental Aspects. //Concept. Magn. Reson. 1998. V. 10. P. 197-237.
8. Weibin Li, Hoyong Chung, Chris Daeffler, Jeremiah A. Johnson, and Robert H. Grubbs Application of 1H DOSY for Facile Measurement of Polymer Molecular Weights. // Macromolecules. 2012 V. 45. № 24. P. 9595-9603.
9. Харламов С.В., Латыпов Ш.К. Современная диффузионноупорядоченная спектроскопия ЯМР в химии супрамолекулярных систем: возможности и ограничения. //Успехи химии. 2010. Т. 79. № 8. С. 699-719.
10. Viel S., Capitani D., Mannina L., and Segre A. Diffusion-Ordered NMR Spectroscopy: A Versatile Tool for the Molecular Weight Determination of Uncharged Polysaccharides. //Biomacromolecules. 2003 V.4. P. 1843-1847.
ІОДПИСНАЯ КАМПАНИЯ НА ПЕРВОЕ ПОЛУГОДИЕ 2014 ГОДА
с**" о-
c '»і**«
m
,v. f
подписку на журнал ОГО ЦЕНТРА ЭКСПЕРТИЗЫ СРЕДСТВ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ»
можно в любом почтовом отделении России.
Индекс издания в каталоге Агентства «Роспечать» «Газеты. Журналы» на первое полугодие 2014 года - 25122
Стоимость подписки на первое полугодие 2014 года
• два номера журнала - 400 руб.
• один номер журнала - 200 руб.
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
