CC BY
77
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
УДК 616.12-008.31-089.843-032:[615.361:611-013.85]:[612.171.172.741.62] © Н.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин, 2008
Н.Ш. Загидуллин, Ш.З. Загидуллин ВОЗМОЖНОСТИ КОНСТРУКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВОДИТЕЛЕЙ РИТМА СЕРДЦА ПРИ ПОРАЖЕНИИ СИНУСОВОГО УЗЛА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ С СОБСТВЕННЫМИ ИССЛЕДОВАНИЯМИ)
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Существующие электрические кардиостимуляторы обладают некоторыми серьезными недостатками, и они, возможно, в будущем могут найти замену в лице биологических пейсмекеров, созданных на основе генов ИСК2, доставленных непосредственно в кардиомиоциты, или на основе трансплантированных генетически модифицированных мезенхимальных клеток и эмбриональных стволовых клетках, обладающих спонтанной пейсмекерной активностью. Экспрессирование человеческого натрийуретического пептида в эмбриональных стволовых клетках мышей позволяет по морфологическим признакам идентифицировать пейсмекероподобные клетки, а их культивирование с эндотелином-1 способно увеличить концентрацию подобных клеток для последующего использования в качестве биологического пейсмекера.
Ключевые слова: биологические пейсмекеры, ИСК-канал, эмбриональные стволовые клетки.
N.Sh. Zagidullin, Sh.Z. Zagidullin THE OPPORTUNITIES OF BIOLOGICAL PACEMAKERS CONSTRUCTION BY SINUS NODE IMPAIREMENT
Existing electrical cardiostimulators have several serious lacks and could be in future replaced with biological pacemakers created by transfecting cardyomyocytes with hyperpolarisation-activated HCN2 channels, or by transplanting genetically modified mesenchymal cells or spontaneous active stem cells. Human natriuretic peptide expression in embryonal stem cells enables to identify pacemaker-like cells by their morphology, and endothelin-1 promotes the development of human natriuretic peptide expressing cardiomyocytes to a pacemaker phenotype for the use as a biological pacemaker.
Key words: biological pacemaker, HCN channel, embryonal stem cells.
Электрические кардиостимуляторы (ЭКС), как известно, устанавливаются в сердце при поражении синоатриального (СА) узла и/или нарушениях атриовентрикулярной проводимости. Помимо непосредственно самой операции установки ЭКС требуется регулярное наблюдение за больными, замена батареек и электродов. Важным отрицательным моментом использования устройств является отсутствие модуляции импульсной активности при физической и/или психической нагрузке. Более того, последние исследования показывают, что ЭКС способны увеличивать риск сердечной недостаточности 1. Особые проблемы вызывает ЭКС у детей, так как в процессе их взросления требуется постоянное изменение параметров стимуляции.
Биологический пейсмекер (БП) - это органическая конструкция, способная вырабатывать спонтанный ритм из места имплантации в сердце. БП благодаря автономному функционированию, модуляции ритма при физической и психической нагрузках потенциально могут решить многие проблемы, связанные с работой ЭКС. Принципиальными направлениями создания БП являются увели-
чение частоты сокращений пейсмекера, который является слишком медленным, или индукция активности в новом очаге миокарда2. Так как инициация импульсной активности нативного пейсмекера зависит от баланса между числом ионных каналов и транспортеров, многие из которых модулируются гормонами, то существуют вариативные способы создания БП.
Для понимания возможностей создания БП необходимо рассмотреть механизмы спонтанной активности пейсмекерных клеток в СА-узле. В клетках СА-узла напряжение мембраны клетки в конце потенциала действия (ПД) снижается до -60 —70мВ (гипердеполяризация). При этом вольтаж не стабилизируется, а, как известно, постепенно увеличивается, чтобы достижением порога для нового потенциала действия и продуцирования ритмических сокращений. Период между двумя ПД, названный диастолической деполяризацией (ДД), выполняет 2 задачи: генерирует спонтанную активность СА-узла и регулирует частоту сердечных сокращений (ЧСС). Свойства ДД обуславливают натрийзависимый фоновый, медленный Т-кальциевый, входя-
щий выпрямляющий (ректифицирующий) калиевый и Ка+/Са+2 обменный и другие каналы мембраны кардиомиоцитов. Однако решающую роль в данном периоде, а также в генерации спонтанной активности пейсмекер-ных клеток играет так называемый К-канал3,4,5,6, или канал, активирующийся при гиперполяризации (рис.1). Пейсмекерные
свойства К -канала были подтверждены прямой корреляцией между степенью экспрессии пейсмекерных каналов и ЧСС7 и, наоборот, развитием брадикардии при его блокаде6,8. На внутриклеточной стороне пейсмекерного канала находится нуклеотидсвязывающий участок, ответственный за взаимодействие с циклическим аденозинмонофосфатом -цАМФ7, и который обеспечивает эффект адренергической и холинергической стимуляций. Канал кодируется генами ИСК 1-4, каждый из которых при экспрессии в клеточных системах создает различные по своим элек-трофизиологическим свойствам изоформы, при комбинации которых в клетке и возникает ток 119,10. Логическая предпосылка использования К-тока для конструирования БП состоит в следующем. Во-первых, так как ток действует только в диастолу, то он не изменяет форму ПД и, соответственно, у него отсутствует проаритмогенный эффект. Во-вторых, канал регулируется циклическим аденозин-монофосфатом и, следовательно, обеспечивает модуляцию ритма симпатической и вегетативной нервной системой. Свойства нативного тока К наиболее близки к ИСК2, что может быть следствием воздействия Р-субъединицы канала! 1 и других причин. Поэтому изоформа
HCN2 и является наиболее используемой при попытке создания БП.
Рис. 1. Потенциал действия СА-клеток, зарегистрированный с помощью микроэлектродной техники.
Стрелками показан диапазон воздействия К-тока (период диастолической деполяризации).
В настоящее время существуют 3 основных возможности создания БП: трансфекция кардиомицитов генами, имплантация спонтанно сокращающихся (пейсмекеропо-добных) и генетически модифицированных клеток12 (рис.2). В первом случае гены для создания пейсмекера или усиления спонтанной активности имеющихся клеток доставляются напрямую в миокардиальные клетки, во втором - спонтанно сокращающиеся клетки имплантируются в миокард для создания зоны автоматизма. В последнем случае трансплантируемые клетки генетически модифицируются таким образом, чтобы после имплантации инициировать ПД в соседних клетках.
Биологические пейсм ейкеры
с
Трансфекция геное
1. Sbcipecci я р-ре це ITCpOl
2.Падэмеме Кгтон
3. Адеюыдо не N2
плантация пеисмеикероподобьых клеток
1. Ни лэиэцш ЭСК иСАуала 1 Нилаиацм з oi ал ы ыл теле ц.
зс
Имплантация генетически модифицированных клеток
Г Челомчесие везет валы ь*? клеш, 1 1 траюф! Ц1 potai 1 ые с ю к> щью пе ■
Рис.2. Классификация биологических пейсмейкеров. ЭСК - эмбриональные стволовые клетки, кл. - клетки, ЭТ - эмбриональное тело, СА - синоатриальный (узел).
Первым подходом к созданию БП было экспрессирование р2-адренергических рецепторов в кардиомиоцитах для усиления пейс-мекерной активности или создания пейсмеке-ра de novo. Для этого гены, кодирующие Р2-адренергические рецепторы, с помощью аденовируса были введены в кардиомиоциты правого предсердия у мышей 13 и свиней14. В обоих случаях базальный уровень ЧСС уве-
личился на 40-50%, однако новый очаг пейс-мекерной активности в миокардиальной ткани создать не удалось.
Еще одним вариантом увеличения ЧСС было использование доминантной негативной конструкции для уменьшения входящего ректифицирующего (выпрямляющего) калиевого тока, который сдвигает потенциал покоя в более позитивную сторону, увеличивая тем
самым ЧСС 15. В данном случае, однако, большой проблемой оказалось уширение ПД, что потенциально может привести к удлинению интервала QT и соответствующему про-аритмогенному эффекту.
Самым эффективным вариантом создания БП оказалась трансфекция гена ИСК2 в кардиомиоциты с помощью аденовируса. Его экспрессия в неонатальных и «взрослых» кар-диомиоцитах крысы увеличила ток К и, соответственно, базальный уровень частоты сокращений клеток с 48 до 88 уд/мин12,16. При этом Р-адреномиметик изопренолол увеличивал частоту сокращений, а М-холинолитик карбомилхолин, соответственно, уменьшал, что явилось показателем чувствительности созданных конструкций к воздействию вегетативной и симпатической нервной системы. В другой работе данный аденовирус был введен в миокард правого предсердия16 и левую ножку пучка Гиса сердца собак17. Затем путем стимуляции вагуса, подавлялся собственный ритм из СА-узла, что приводило к появлению в первом случае предсердного, а во втором - правожелудочкового выскальзывающего ритма. Еще в одном эксперименте, при сочетании инъекция аденовируса в область правой ножки пучка Гиса с искусственно вызванной АВ-блокадой и установкой ЭКС с фиксированной частотой 45 уд./мин18 при действии Р-миметика идиовентрикулярный ритм сердца возрос с 56 до 86 уд/мин.
Несколько групп исследователей сообщили о возможностях трансплантации человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)19,20 и клеток, изолированных из области СА-узла плода на 14-18 недели прерванной беременности21.
В первом случае человеческие ЭСК культивировались в виде эмбриональных телец (ЭТ) до тех пор, пока не появлялись спонтанно сокращающиеся клетки, которые были инъецированы в стенку левого желудочка подопытного животного с последующей искусственно вызванной блокадой АВ-узла. В одном из исследований стабильный желудочковый ритм в месте инъекции наблюдался у 6 из 13 животных19. Полученный ритм был чувствителен к действию Р-миметиков, увеличивая ЧСС с 59 до 94 уд/мин при воздействии изопротеринола. Похожий эксперимент с имплантацией БП в сердце морских свинок, но уже при его извлечении из грудной клетки, также показал наличие спонтанно сокращающегося пейсмекерного участка в месте инъекции ЭТ и его достаточно высокую чувстви-
тельность к агентам симпатической и автономной нервной системы20.
Второй подход заключается в трансплантации спонтанно сокращающихся клеток из области СА-узла клеток человеческих плодов, полученных при проведении абортов, в стенку левого желудочка21. Имплантации клеток СА-узла плода и последующая аблация AB-узла сердца свиньи привели к стабильному желудочковому ритму у 4 из 5 изучаемых животных, частота которого оказалась достоверно выше, чем в контроле (86 против 30 уд/мин). Кроме того, в опытной группе в сравнении с контролем при внутривенном введении изопретеренола рост ЧСС был гораздо значительнее. Однако следует признать, что аутоиммунные и электрофизиологические параметры человеческих фетальных клеток не были изучены достаточно подробно.
Исследования последних лет показали возможность трансплантационной пересадки в миокард пейсмекероподобных кардиомио-цитов, полученных из ЭСК22,23. Такие клетки из ЭСК экспрессируют ток If и ритмично сокращаются22. Трансплантируемые эмбриональные тельца, используемые в вышеупомянутых стратегиях, содержат предшественники всех тканей организма, и поэтому для получения только предшественников пейсмекерных клеток необходимо выделение из ЭТ-клеток с соответствующим фенотипом.
В наших исследованиях, проведенных совместно с лабораторией клинической и клеточной кардиоэлектрофизиологии и молекулярной биологии Кельнской университетской клиники, был создан вектор-плазмида, содержащий в качестве промотора ген предсердного натрийуретического пептида (ПНУП), играющего важную роль в развитии предсердий, и ген усиленного зеленного флюоресцирующего протеина24 (УЗФБ). Затем плазмида была электропорирована в мышиные ЭСК. УЗФБ-позитивные ЭСК культивировались в висящих каплях в течение 2-х дней, в результате чего появлялись ЭТ, которые были пересеяны на культуральные чашки, где они прикреплялись к поверхности и начинали спонтанно сокращаться и флюоресцировать. Сокращающиеся флюоресцирующиеся участки были рассечены и выделены с помощью трипсина. Кардиальная природа данных клеток была подтверждена с помощью антител против а-актинина, тропонина I и коннексинов 40 и 43. Пейсмекерный ток If и ПД были записаны с помощью микроэлектродной техники (whole-cell patch clamp, вариант «вся клетка»).
После выделения клеток и изучения морфологии выделенных из ЭСК клеток у всех веретенообразных ПНУП-УЗФБ-
экспрессирующих клеток был определен фенотип пейсмекерных клеток (п=22): они сокращались с частотой 173±14 сокр/мин и генерировали спонтанный синусонодальный потенциал действия синхронно с сокращениями клеток (потенциал покоя -45,5±2,2мсек). 58% тре/многоугольных клеток (п=77) были звездчатыми со значительно меньшей частотой сокращений (-62±3 сокр/мин, р<0,001). Все треугольные клетки показывали потенциал действия предсердных клеток с более негативным потенциалом покоя (-68,7±2,1мВ). В соответствии с этими различиями в частоте сокращений и потенциале действия все веретенообразные клетки характеризовались значительно большей плотностью К-тока (34,5±2,4 пА/пФ при -150 мВ), его более ранней активацией (-50 - -60мВ) и более быстрой кинетикой активации (1аи 395,3±30,7мсек при -150мВ) в сравнении с треугольным и многоугольными клетками (12,8±0,7 пА/пФ при -150мВ; активация от -80 до -90мВ; 1аи 681,1±30,3 мсек при -150мВ; р<0,001). Эти различные свойства К тока подтверждают пейсмекероподобный фенотип веретенообразных клеток.
Показано, что сосудистый цитокин эн-дотелин-1 (ЭТ-1) индуцирует дифференци-ровку кардиомиоцитов в нити Пуркинье в эн-дотелин-рецепторзависимой манере25. Для тестирования эффектов ЭТ-1 на ЭСК мы культивировали ПНУП-УЗФБ-
экспрессирующие эмбриональные тельца вместе с ЭТ-1 (10-7 ммоль/л) и ЭТ-1 совместно с селективным антагонистом рецептора эндотелина-1 BQ123 (10-6 ммоль/л)24. В результате этого процесса ЭТ-1 существенно увеличил процент веретенообразных клеток от 18,3±1,7% до 30,3±2,1%; р<0,001, (рис.3), уменьшая, в то же время процент треугольных и многоугольных клеток от 60,3±4,2 до 39,2±3,5 (р<0,001). Данный эффект ЭТ-1 на дифференцировку ЭСК нивелировался селективным антагонистом рецептора эндотелина-1 BQ123.
Таким образом, ПНУН-УЗФБ-
экспрессия в ЭСК позволяет идентифицировать и представить характеристику кардио-миоцитов, полученных из предсердий и имеющих определенные морфологические и электрофизиологические параметры. Мы смогли идентифицировать подлинию клеток веретенообразной формы, характеризующейся пейсмекероподобным фенотипом. Кроме
того, наши результаты показывают, что ЭТ-1 может также индуцировать дифференциацию мышиных ПНУП-УЗФБ-экспрессирующих
клеток: экспозиция с ЭТ-1 приводила к сдвигу в пользу увеличения концентрации веретенообразных клеток с пейсмекероподобными электрофизиологическими характеристиками. Таким образом, уже только по морфологическим критериям возможно идентифицировать пейсмекероподобные клетки, а с помощью ЭТ-1 повысить их концентрацию для последующего использования в качестве БП.
контроль + ЭТ-1 +ЭТ-1+В0123
Рис. 3. Процент пейсмейкероподобных клеток в контроле, при культивировании с эндотелином-1 и с эндотелином-1+антагонистом рецепторов эндотелина BQ123. * - p<0,05.
Для создания автономного очага пейс-мекерной импульсации не обязательно требуются клетки, сами продуцирующие ПД. Достаточно того, если они будут обладать достаточной силой тока If и будут электрически соединены с окружающими клетками26. Обычно трансплантированные клетки обладают меньшим потенциалом покоя, чем сами кардиомиоциты, и если между клетками существует электрическое соединение, то разница в мембранных потенциалах приведет в пересаженной клетке к активации If-тока, который, в свою очередь, сможет вызвать в окружающих кардиомиоцитах ПД. В качестве носителя для данной технологии были выбраны мезенхимальные клетки человека, полученные из костной ткани из-за их способности к последующей дифференцировке и иммунокомпетентности к собственным тканям, а гена для трансфекции - изоформа HCN2. Эффективную трансфекцию или насыщение мезенхимальных клеток геном HCN2 in vitro можно получить с помощью электропорации - молекулярно-биологической процедуры, при которой ДНК гена проникает в клетки при воздействии сильного электрического разряда. В одном из исследований человеческие мезенхи-
мальные стволовые клетки, трансфицированные изоформой ИСК2, были имплантированы в миокард желудочков собак26. При последующей вагальной стимуляции у 5 из 6 животных появлялся левожелудочковый выскальзывающий ритм. Идиовентрикулярный ритм у животных с трансплантированными клетками был 61 уд/мин в сравнении с ритмом 45 уд/мин в контроле. Следует отметить, что в течение времени наблюдения (42 дня) ни у одного животного не отмечалось признаков клеточного или гуморального отторжений трансплантированной ткани27.
Создав БП, необходимо доставить его непосредственно к месту действия. Для этого предложены несколько вариантов: доставка генов непосредственно к кардиомиоцитам, трансфекция генов с помощью вируса. Сама ДНК плохо захватывается клетками и действует лишь короткое время. Вектора с вирусом более эффективны, но могут вызывать аллергические реакции или даже опухолевые процессы. Использование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, более безопасно, но требует трансфекции ЭСК ИСК2 геном. Полученный безопасный и стабильный БП необходимо доставить в определенную зону миокарда. Решением данной проблемы может быть использование либо специальных эндокардиальных кате-торов и игл, либо «выращивание» клеток на матриксе с последующей «склейкой» его с миокардом. Какой бы подход не был использован, чтобы предотвратить серьезные побочные эффекты, необходимо контролировать
этот процесс, чтобы трансплантированные клетки-пейсмекеры не удалялись от пейсме-керного очага. Даже если будут решены данные проблемы, не факт, что со временем пейсмекерная активность в клетках не угаснет и что не потребуется повторная имплантация.
В некоторых экспериментальных исследованиях было изучено использование БП совместно с ЭКС. Подобное сочетание потенциально обладает дополнительными преимуществами перед их изолированным применением: БП будет модулировать ЧСС в зависимости от физической и психоэмоциональной нагрузок, в то время как электрический компонент сможет «подстраховать» ритм сердца в случае «выключения» БП. Такой тандем является более физиологичным для организма и увеличит срок службы батареек ЭКС.
Заключение
Таким образом, в перспективе существуют реальные возможности для создания биологических пейсмекеров, полученных при трансфекции миокардиальных клеток ИСК генами и с использованием генетически модифицированных человеческих мезенхимальных стволовых клеток. Наши исследования показывают возможности идентификации пейсмекероподобных клеток в ростках эмбриональных стволовых клеток, а также использования факторов дифференцировки, таких как эндотелин-1, для увеличения концентрации этих клеток в целях их дальнейшего применения в качестве биологических пейс-мекеров.
Принята к печати 12.02.2008
ЛИТЕРАТУРА
1. Freudenberger RS., Wolson AC., Lawrence-Nelson J. et al. Permanent pacing is a risk factor for the development of heart failure. Am J Cardiol.2005;95:671-674.
2. Cohen I., Brink P., Robinson B., Rosen M. The why, what, how and when of biological pacemaker. Nature clinical practice. 2005;8:374-375.
3. Thollon C., Cambarrat C., Vian J. et al. Electrophysiological effects of s16257, a novel sino-atrial node modulator, on rabbit and guinea pigs cardiac preparations: comparison with UL-FS 49. Br. J. Pharmacol. 1994;112: 37-4.
4. Bois P., Bescond J., Renaudon B., Lenfant J. Mode of action of bradycardic agent, S 16257, on ionic currents of rabbit sinoatrial cells. Br J Pharmacol. 1996;188:1051-1057.
5. Bucchi A., Baruscotti M, DiFRancesco D. Current-dependent Block of Sinoartreal Node If Channels by Ivabradine. J. Gen. Physiol. 2002;120:1-13.
6. DiFrancesco D. Cardiac pacemaker If current and its inhibition by heart rate reducing agents. 2005. Current medical research and opinion. 2005; 21: 7, 1115-1122.
7. Wainger BJ. Degennaro M., Santoro B. et al. Molecular mechanism of cAMP modulation of HCN pacemaker channels. Nature. 2001;411:805-10.
8. Van Bogaert P., Goethals M. Pharmacological influence of specific bradycardic events on the pacemaker current of ship cardiac Purkihje fibers. A comparison between free different molecules. Eur Heart J. 1987; 8 (Suppl.):35-2.
9. Moosmang S., Stieber J, Zong X. et al. Cellular expression and functional characterization of four hyperpolarization-activated pacemaker channels in cardiac and neuronal tissues. Eur. J Biochem. 2001;268:1646-1652.
10. Santoro B., Tibbs G. The HCN gene family: molecular basis of the hyperpolarization-activated pacemaker channels. In: Molecular and functional diversity of ion channels and receptors. Ann. NY Acad. Sci. 1999;868:741-764.
11. Yu H., Wu J., Potapova I. et al. MinK-related protein 1: A p subunit for the HCN ion channel subunit family enhances expression and speeds activation. Circ. Res. 2001;88:e84-7.
12. Barbutti A., Baruscotti M., DiFrancesco D. The pacemaker current: from basic to the clinics. J Cardiovasc Electrphysiol. 2007;18:342-347.
13. Edelberg J.M., Aird W.C., Rosenberg R.D. Enhancement of murine cardiac chronotrpy by the moleclar transfer of the human beta2 adrenergic receptor cDNA. J Clin Invest. 1998; 101(2):337-343.
14. Edelberg J.M., Huang D.T., Jodephson M.E., Rosenberg R.D. Molecular enhancement of porcine cardiac chronotrphy. Heart 2001;86(5):559-562.
15. Miake J., Marban E., Nuss H.B. Gene therapy: biological pacemaker created by gene transfer. Nature 2002;419(6903):132-3.
16. Qu J., Barbutti A., Protas L. et al. HCN-overexpression in newborn and adult ventricular myocytes: distinct effects on gating and excitability. Circ. Res. 2001;89:e8-e14.
17. Qu J., Plotnikov A.N., Danilo P.J. et al. Expression and function of a biological pacemaker in canine heart. Circulation.2003;108(8):1106-9.
18. Plotnikov A.N., Sosunov E.A., Qu J. et al. Biological pacemaker implanted in canine left bundle branch provides ventricular escape rhythms that have physiologically acceptable rates. Circulation. 2004;109:506-12.
19. Plotnikov A.N., Shlapakova I.N., Kryukova Y. et al. Comparison of mHCN2 and mHCN2-E324A genes as biological pacemakers. Circulation 2005;112:II-126 (abstract).
20. Kehat I., Khimovich L., Caspi O. et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2004;22(10): 1282-9.
21. Xue T., Cho H.C., Akar F.G. et al. Fuctional integration of electrically active cardiac derivates from genetically engineered human embryonic stem cells with quiescent recipient ventricular cardiomyocytes: insights into the development of cell-based pacemakers. Circulation. 2005;111(1): 11-20.
22. Lin G., Cal J., Jiang H. et al. Biological pacemaker created by fetal cardiomyocyte transplantation. J.Biomed Sci. 2005;l12(3):513-9.
23. Satin J., Kehat., Caspo O. et al. Mechanism of spontaneous excitability in human embryonic stem cells derived cardyomyocytes. J.Physiol. 2004;559:479-496.
24. Min J., Yang Y., Converso K. et al. Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in postinfarcted rats. J. Appl. Physiol. 2002;92:288-296.
25. Gassanov N., Er F., Zagidullin N., Hoppe UC. Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype. FASEB J. 2004;18(14):1710-2.
26. Gordie R.G., Wei Y., Kim D. Endotheli-induced conversion of embryonic heart muscle cells into impulse-conducting Purkinje fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998;95:6815-6818.
27. Robinson R., Brink P., Cohen I., Rosen M. If and the biological pacemaker. Pharm Res. 2006;53:407-415.
28. Plotnikov A.N., Shlapakova I.N., Szabolcs M.J. et al. Adult human mesenchymal stem cells carrying HCN2 gene perform biological pacemaker function with no overt rejection for 6 weeks in canine heart. Circulation. 2005;112:II-221(abstract).
