CC BY
80
DOI: 10.23868/201707020
перспективы создания биологического пейсмейкера с использованием современных технологий
С.А. Байрамова 1, А.Г. Стрельников 1, А.Б. Романов 1, А.А. Якубов 1, Д.В. Лосик1, С.В. Павлова 2, К.И. Агладзе 3, Е.А. Покушалов 1
1 Сибирский федеральный биомедицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия
2 Федеральный исследовательский центр институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
3 Московский физико-технический институт (государственный университет), Москва, Россия
The prospects of creating a pacemaker cardiac tissue using modern technologies
SA. Bayramova 1, A.G. Strelnikov1, A.B. Romanov1, A.A. Yakubov1, D.V. Losik 1, S.V. Pavlova 2, K.I. Agladze 3, E.A. Pokushalov1
1 E.N. Meshalkin Siberian Federal Biomedical Research Center, Novosibirsk, Russia
2 Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk, Russia
3 Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Moscow, Russia
В настоящее время существует множество имплантируемых электрокардиостимулирующих систем, способных замещать функцию физиологических пейсмейкеров (синусового и атриовентрикулярного узлов). Данные системы на сегодняшний день имеют ряд ограничений и являются несовершенными, т.к. они требуют постоянного мониторинга и обслуживания в связи с ограниченным сроком службы батареи; существуют риски инфицирования системы кардиостимуляции, которые могут привести к необходимости ре-имплантации водителя ритма; имплантируемые устройства порой несовместимы с другими электрическими приборами (металлодетекторами и магнитами, магнитно-резонансными томографами, линиями электропередач), которые могут влиять на работу электрокардиостимуляторов; электроды не всегда удается расположить физиологично, что в свою очередь может привести к развитию сердечной недостаточности и дополнительным симптомам, ухудшающим качество жизни пациента. Данная статья посвящена обзору методов создания биологических пейсмейкеров, рассмотрению достоинств и недостатков имеющихся современных стратегий получения пейсмейкерной ткани, которые базируются на использовании ключевых генов-модификаторов, регулирующих эмбриональное развитие вентрикулярных, атриальных и пейсмейкерных кардиомиоцитов. Наряду с этим, показано, что технологии получения индуцированных пациент специфических плюрипотентных клеток (ИПСК) и последующее развитие протоколов направленной дифференцировки в кардиальном направлении открывают новые подходы для разработки биологических пейсмейке-ров. Эта стратегия заключается в получении и трансплантации пациент специфических пейсмейкерных кардиоми-оцитов. Также кратко описаны перспективы использования современных материалов для развития тканевой инженерии.
Ключевые слова: атрио-вентрикулярная блокада, проводящая система сердца,синусовый узел, биологический пейсмейкер, генная терапия, электрокардиостимулятор, ионные каналы, клеточная терапия, индуцированные плю-рипотентные стволовые клетки, тканевая инженерия.
Бведение
Более двух тысяч лет назад китайский врач PienCh'io впервые описал изменения, происходящие при полной атрио-вентрикулярной блокаде, как разрушительная и неизлечимая аритмия. Позже итальянский исследователь Д.Б. Морганьи описал состояние, которое стало называться приступом Мор-ганьи-Адамса-Стокса и в XIX в., независимо друг от друга ирландцы Роберт Адамс (1827) [1] и Уильям
e-mail: seven_712@mail.ru
At the present time there are a lot of implantable pacemakers, which are able to replace the function of physiological pacemakers (sinoatrial and atrioventricular nodes). These systems are currently imperfect and have a number of limitations. They require constant monitoring and maintenance due to limited battery life. There are risks of infection of pacemakers system, which may cause a pacemaker reimplantation. Implantable devices are often incompatible with other electric devices (metal detectors and magnets in MRI scanners, as well as power lines), which may affect the operation of pacemakers. Sometimes the electrodes can not be physiologically positioned, which may lead to heart failure and additional symptoms worsen the patient>s quality of life. This article is devoted to a review of methods for creating biological pacemakers, considering advantages and disadvantages of the available modern strategies for obtaining pacemaker tissue, which is based on the using of key modifier genes regulating the embryonic development of ventricular, atrial and pacemaker cardiomyocytes. Furthermore the technologies for creating induced patient specific pluripotent cells (IPSC) and the subsequent development of directional differentiation protocols in the cardial direction discover new approaches for the development of biological pacemakers. Also briefly described the prospects for using modern materials for the development of tissue engineering.
Keywords: atrioventricular block, cardiac conduction system, sinus node, biological pacemaker, gene therapy, cardiac pacing, ion channels, cell therapy, induced pluripotent stem cells, tissue engineering.
Стокс (1846) [2], детально описывали симптомы, имеющиеся у данных пациентов. Однако лечение этого заболевания не имело успеха, ввиду существовавшей на тот момент ограниченной информации о структуре и функционировании проводящей системы человеческого сердца. Структура и механизм функционирования синусового узла как главного водителя ритма были раскрыты лишь в начале XX в. А. Keith и М. Flack (1907) [3] и исследователем
Т. Lewisc соавт. (1910) [4]. Понимание механизма проведения импульса в атрио-вентрикулярном соединении было заложено в работах W. His в 1893 г. [5] и S. Tawara с соавт. в 1906 г. [6]. По мере понимания работы синусового и атрио-вентрикулярного узлов млекопитающих развивались и методы электрической кардиостимуляции. Полагают, что первым исследователем, стимулировавшим сердце млекопитающих был J.A. McWilliam (1889) [7]. Современная эра в кардиостимуляции была открыта независимо друг от друга А. Hopps (1950) с соавт. [8] и P.M. Zoll (1952) [9], чьи устройства были использованы в 1950-е годы для чрескожной кардиостимуляции. Первые имплантируемые водители ритма осуществляли стимуляцию с фиксированной частотой и имели большие размеры, однако они спасали жизни. И только в 1957 г. E.E. Bakken изготовил первый портативный внешний кардиостимулятор. К 1970-м годам батарея, электроды и программное обеспечение кардиостимуляторов были значительно улучшены в сравнении с первичной моделью устройства [10, 11].
В наше время мы, казалось бы, практически достигли совершенства в эре кардиостимуляции: последовательная предсердно-желудочковая стимуляция, благодаря которой сохраняется синхронное сокращение предсердий и желудочков у пациентов с нормальным синусовым узлом, но имеющих атрио-вентрикулярную блокаду; коронарный синус, позволяющий иметь доступ к перикардиальным венам для бивентрикулярной стимуляции у пациентов с сердечной недостаточностью [12]; кардиовертеры-де-фибрилляторы, детектирующие жизнеугрожающие аритмии, при которых они воздействуют с помощью электрического шока и производят стимуляцию для спасения жизни при злокачественных желудочковых нарушениях ритма. Существуют программы, адаптирующие частоту сердечных сокращений под физическую активность пациента [13], безэлектродные кардиостимуляторы, позволяющие осуществлять стимуляцию без использования катетеров. Среди такого разнообразия функций и разновидностей кардиостимуляторов, невольно возникает вопрос: имеем ли мы в настоящее время реальные проблемы с системой электрической кардиостимуляции и есть ли необходимость в создании более совершенных систем? И ответ на этот вопрос положительный. Несмотря на совершенствование системы электрической кардиостимуляции, на сегодняшний день она имеет ряд ограничений: 1) невосприимчивость к вегетативной нервной системе (потребностям при физической и эмоциональной нагрузкам), т.е. в настоящее время адекватной замены автономной нервной системы не создано [14]; 2) потребность в мониторинге и обслуживании системы кардиостимуляции из-за ограниченного срока службы батареи кардиостимулятора и необходимости замены электродов; 3) риск инфицирования системы кардиостимуляции, в результате которого требуется имплантация нового водителя ритма; 4) помехи, создаваемые другими электрическими приборами (металлодетекторами и магнитами МРТ-томографов, а также линиями электропередач), которые могут влиять на работу электрокардиостимуляторов; 5) риск развития сердечной недостаточности в результате верхушечной правожелудочковой стимуляции: несмотря на имеющиеся доступы к эпикарду и эндокарду, для имплантации электрода необходимо выбрать оптимальную
позицию, при которой электрод имел бы стабильную фиксацию и хорошие электрофизиологические параметры; 6) педиатрические проблемы, связанные с необходимостью адаптации системы кардиостимуляции к росту и развитию ребенка [15, 16].
Даже несмотря на значительный прогресс в области конструирования устройств для кардиостимуляции, в настоящее время данные недостатки системы кардиостимуляции всё еще не решены, в связи с чем, встает вопрос о создании альтернативных средств стимуляции, таких как биологические пейсмейке-ры. Требования, предъявляемые к альтернативным методам стимуляции, состоят в следующем: 1) они должны быть конкурентоспособны по отношению к традиционным электрокардиостимуляторам, т.е. в идеальных условиях не иметь батареи питания, не иметь электродов, которые необходимо было бы имплантировать в организм, не требовать замены, и не только создавать физиологичный стабильный ритм в течение жизни, но и обеспечивать адекватный ответ изменениям автономной нервной системы (в результате физической и эмоциональной нагрузок);
2) они не должны создавать риска инфицирования;
3) должна быть возможность их имплантации в тот участок миокарда, в котором была бы оптимизирована желудочковая активация, такая как сократительная способность и сердечный выброс; 4) они не должны обладать проаритмогенным и неопластическим эффектами [17, 18]. Иными словами, они должны давать лечебный, а не паллиативный эффект.
Принимая во внимание все изложенные факты, данными свойствами могут обладать биологические пейсмейкеры, не имеющие ни батареи питания, ни электродов, ни программного обеспечения.
Молекулярные и электрофизиологические
характеристики кардиальных пейсмейкеров
синоатриального узла
Структурой, служащей образцом создания био-пейсмейкера, является синусовый узел, функцию и физиологию которого мы пытаемся воспроизвести. Основная функция кардиальных пейсмейкер-ных клеток заключается в автоматическом и циклическом генерировании потенциалов действия, которые передаются атриальным и вентрикулярным кардиомиоцитам и вызывают их электрическое возбуждение и механическое сокращение. Потенциал действия — это изменение заряда внутренней поверхности мембраны, который можно представить в виде графика зависимости величины заряда внутренней стороны мембраны от времени (рис. 1). Пики на графиках соответствуют фазе сокращения или систоле, участки между пиками — диастоле.На стадии деполяризации происходит повышение заряда мембраны кардиомиоцита, реполяризации — снижение заряда мембраны. Снижение заряда ниже порогового уровня соответствует гиперполяризации внутренней поверхности мембраны.
У пейсмейкерных кардиомиоцитов существует очень важная стадия формирования потенциала действия — диастолическая деполяризация мембраны (рис. 1). Именно в этот период происходят основные события, необходимые для формирования периодического самопроизвольного возбуждения пейсмей-кера. «Пороговое» значение заряда мембраны пейс-мейкера при реполяризации составляет примерно
-50 мВ и далее происходит гиперполяризация мембраны до -60 мВ (-70 мВ у человека), в результате чего активируются специфические ионные каналы HCN4 (hyperpolarization-activatedcyclicnucleotide-gatedchannel 4), которые вызывают раннюю стадию диастолической деполяризации мембраны за счет поступления ионов натрия внутрь клетки. Поток ионов через канал HCN4 называют пейсмейкерный или «funny» ток (If). На стадии поздней диастолической деполяризации увеличение заряда мембраны до порогового уровня происходит в результате поступления ионов кальция внутрь клетки через каналы Т-типа (которые характерны для пейсмейкерных клеток, ICaT ток) и активации каналов натриево-каль-циевого обмена NCX (Na+/Ca2+exchangerINCX). Через эти каналы происходит удаление одного иона Ca2+ из клетки и введение трех ионов Na + , за счет которых и увеличивается заряд на внутренней поверхности мембраны. При достижении порогового уровня заряда мембраны около -50 мВ закрываются кальциевые каналы Т-типа и включаются каналы L-типа (L . ток),
CaL
которые способствуют более интенсивному перемещению ионов Ca2^ клетку, деполяризации мембраны и формированию потенциала действия (рис. 1).
Механизм диастолической деполяризации мембраны за счет специфических потенциал-зависимых каналов наружной мембраны является ключевым для самопроизвольной генерации потенциала действия пейсмейкерными клетками. Также, помимо «мембранного» механизма автоматии или «М-часов»,
существует внутреклеточный механизм осцилляции ионов кальция из саркоплазматического ретикулума или «кальциевые часы» (рис. 1). Механизм Ca2+-часов работает на стадии поздней диастолической деполяризации и заключается в циклических выбросах небольших порций ионов кальция из саркоплаз-матического ретикулума (LCR, localcalciumrelease), которые активируют поступление ионов натрия извне, через NCX каналы, вызывая деполяризацию мембраны. Повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме при активации каналов L-типа стимулирует массивный выброс внутриклеточного запаса ионов кальция из цитоплазматического ретикулума (CICR, calcium-inducedcalciumrelease) через каналы RyR2 (Ryanodinereceptor 2), который необходим для работы сократительного аппарата кардиомиоцита. Реабсорбция ионов кальция в цистерны сарколазматического ретикулума происходит за счет АТФ зависимого насоса SERCA (Sarco/ Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase [19-23].
Частота генерации потенциала действия пейс-мейкерной клетки регулируется симпатической и парасимпатической нервными системами путем сокращения или удлинения фазы диастолической деполяризации соответственно. Медиаторы симпатической нервной системы эпинефрин и норэпинеф-рин связываются с p-рецепторами и активируют аде-нилатциклазу, которая конвертирует АТФ в цАМФ. Молекулы цАМФ активируют работу каналов HCN4, увеличивая входящий ток ионов натрия. Также цАМФ
Рис. 1. Формирования потенциала действия пейсмейкерных кардиомиоцитов.
На схеме отражено взаимодействие мембранного и кальциевого механизмов формирования фазы диастолической деполяризации мембраны (по [19] с изм.): МйР — минимальный диастолический потенциал; йй — диастолическая деполяризация; С11РС — кальций-индуцированное высвобождение кальция (оа!с1ит-1пЬисеЬса!с1итге!еаБе); Б1Р — саркоплазматический ретикулум; Са„-с!оск — механизм «кальциевых часов» автоматии
активирует протеинкиназу А, которая фосфорилиру-ет определенные белки, что приводит к увеличению поступления ионов кальция через L-каналы, активации RYR2 и SERCA и усилению осцилляции ионов кальция между саркоплазматическим ретикулумом и цитоплазмой. В результате уменьшается период диастолической поляризации и увеличивается частота генерирования потенциала действия за счет взаимосвязанных процессов регуляции «мембранных» и «кальциевых» механизмов. Медиатор парасимпатической системы ацетилхолин связывается с мускариновым рецептором и инактивирует адени-латциклазу, вызывая обратные эффекты, которые приводят к снижению частоты генерирования потенциала действия [20].
Несмотря на интенсивные исследования пейс-мейкерных клеток, окончательный механизм циклического автоматического генерирования потенциала действия неясен. Например, HCN4 каналы отсутствуют у спонтанно сокращающихся неонатальных кардиомиоцитов или присутствуют лишь в 1—10% кардиомиоцитов, полученных в результате диф-ференцировки плюрипотеннтных клеток (ПК). При изучении неонатальных и дифференцированных из ПК кардиомиоцитов было показано, что митохондрии также участвуют в обмене ионов кальция с цитоплазмой, что на стадии диастолической деполяризации является критичным для достижения порогового уровня ионов в цитоплазме, запускающих процесс CICR из саркоплазматического ретикулума и сокращения [22—24] Возникает вопрос — могут ли спонтанно сокращающиеся незрелые кардиоимоци-ты, полученные путем дифференцировки ПК, быть «биологическим пейсмейкером»? Скорее всего, нет. Дело в том, что пороговое значение мембранного потенциала кадиомиоцитов, дифференцированных из ПК, составляет около -35 мВ, что значительно облегчает генерирование спонтанного потенциала действия in vitro. Однако при интеграции в миокард они будут находиться в контакте с клетками, мембранный потенциал которых составляет -90 мВ. В отсутствие гиперполяризационно активирующихся каналов HCN4, их мембранный потенциал выровняется, и клетки не смогут спонтанно генерировать потенциал действия. Т.е. каналы HCN4 выполняют функцию электрического инсулятора и позволяют мембранному потенциалу пейсмейкерной клетки оставаться в пределах, необходимых для инициации деполяризации мембраны и формированию потенциала действия [25].
Таким образом, идеальным биологическим пейс-мейкером может быть клетка, которая способна к ди-астолической деполяризации мембраны. Основным медиатором этого процесса будут ионы Са2+, которые поступают через наружную мембрану (М-механизм), или из саркоплазматического ретикулума (кальциевый механизм) и митохондрий. Ионы Са2+ запускают каналы кальций-натриевого обмена NCX, вызывающих деполяризацию мембраны. Биологический пейсмейкер должен регулировать скорость процесса диастолической деполяризации в ответ на действия вегетативной нервной системы. В мембране потенциального пейсмейкера должны присутствовать каналы HCN4, активирующиеся при гиперполяризации мембраны, которые будут служить электрическим инсулятором, защищающим от электроотрицательного влияния соседства сократительных кардиоми-оцитов. Для распространения потенциала действия
от пейсмекера к сократительным кардиомиоцитам, в мембране должны присутствовать специфические коннексины — белки межклеточного взаимодействия [21, 25].
создание биологического пейсмейкера
с использованием методов генетической
инженерии
Первые попытки создать пейсмейкер из зрелых сократительных кардиомиоцитов заключались в модуляции мембранных ионных токов путем внесения дополнительной копии гена HCN4, ответственного за пейсмейкерный ток If [26], или внесения мутантного гена Kir2 для уменьшения реполяризирующего тока Ik, [27]. Также было изучено влияние симпатической нервной системы на сократительные кардиомиоциты с дополнительной копией ß-адренергического рецептора (b2 AR) [28] В результате этих экспериментов определенные изменения в физиологии химерных кардиомиоцитов были выявлены, однако модификаций клеток на уровне мембранных каналов оказалось недостаточно для формирования всего комплекса пейсмейкерных свойств.
Современная стратегия разработки биологического пейсмейкера базируется на использовании ключевых генов-модификаторов, регулирующих эмбриональное развитие вентрикулрных, атриальных и пейсмейкерных кардиомиоцитов. Известно, что миокард желудочков сердца развивается из клеток первичного кардиального поля, миокард предсердий — из клеток первичного и вторичного кардиальных полей, экспрессирующих ключевой транскрипционный фактор Nkx2.5, запускающий программу формирования сократительных кардиомиоцитов.
Синоатриальный узел (SAN), прилегающий миокард предсердия и венозный синус дифференцируются de novo из мезенхимальных предшественников каудально вентролатеральной части входящего тракта (начиная с E9-E9.5 дня развития у мыши), экспрессирующих транскрипционный фактор Tbx18. Из этих клеток формируются полые вены, миокард правого предсердия и SAN (рис. 2А). Пейсмейкерные кардио-миоциты развиваются из клеток «линии» Tbx18, в которых экспрессируетсятранскрипционный фактор Shox2. Фактор Shox2 активирует комплекс генов (в том числе, Isl1 и Tbx3), которые регулируют синтез белков HCN4 каналов, Т-каналов, белков межклеточного взаимодействия коннексинов Сх30.2 и т.д., обеспечивающих генерирование и распространение потенциала действия [29—33] (рис. 2Б).
Таким образом, основными «мишенями» генной терапии для перепрограммирования вентрикулярных кардиомиоцитов в пейсмейкерные являются гены транскрипционных факторов Tbx18, Tbx5, Shox2, Tbx3 и каналов HCN4. Влияние сверхэкспрессии этих генов на появление пейсмейкерных свойств изучали на неонатальных кардиомиоцитах электрофизиологическими и молекулярными методами [34—37] Было показано, что эктопически активный Tbx3 фактор не способствует формированию раннего деполяризующего тока If, но влияет на кальциевый механизм автоматии — частота спонтанных сокращений неонатальных кардиомиоцитов увеличивалась. Эктопическая экспрессия гена Tbx3, запускаемая в зрелых кардиомиоцитах тамоксифеном в трансгенных мышах, изменяла профиль экспрессии генов в направлении, характерном для пейсмейкеров,
однако приводила к замедлению частоты сердечных сокращений, что авторы объясняют нарушением контактных взаимодействий между модифицированными кардиомиоцитами[38].
Другая группа исследователей изучала способность перепрограммировать к пейсмейкерному состоянию неонатальные кардиомиоциты крысы при помощи сверхактивации гена ТЬх18. Авторы показали, что в результате действия фактора ТЬх18 в не-онатальных кардиомиоцитах происходят изменения на транскрипционном, эпигенетическом и электрофизиологическом уровнях — активируется мембранный (регистрируется деполяризующий ток !г) и Са2 + механизма втоматии. В экспериментах invivo транс-дукция кардиомиоцитов морской свинки аденовирусами, содержащими ген ТЬх18, вызывала эктопиче-
скую пейсмейкерную активность [34]. В дальнейших экспериментах на модели свиньи с полной блокадой сердца, эктопическая электрическая активность в результате действия ТЬх18-индуцированных пейс-мейкеров поддерживала деятельность сердца в течение двух недель [39]. Однако, другая группа исследователей не смогла обнаружить эктопическую электрическую активность при сверхактивации гена ТЬх18 в сократительных кардиомиоцитах эмбриональных мышей. Хотя авторы наблюдали общее снижение активности генов, отвечающих за развитие сократительных кардиомиоцитов, экспрессия генов, кодирующих белки Н1\1С каналов, не индуцировалась [36]. Таким образом, несмотря на успешное перепрограммирование с помощью индуцированной экспрессии гена ТЬх18 сократительных кардиомиоцитов
мезенхима Tbx18+ Nkx2-5+ Сх40+ Сх43+ Нсп4" СУ ТЬхЗ+ Нсп4+
Nkx2-5+ венозный синус Tbx18+Hcn4+ — — — Клеточная линия
Nkx2-5" Сх40"
Рис. 2А. Развитие венозного синуса и синусового узла. Профиль экспрессии генов и клеточных линий
в эмбриональном развитии до E9.5 (слева), между E9.5 и E14.5 (в середине) и после E14.5 (справа).
Тонкая пунктирная линия представляет границу области клеток, экспрессирующих Pitx2c или их потомков;
толстая пунктирная линия — граница клеток, экспрессирующих Tbx18 или их потомков. Место локализации
мезенхимальных клеток изображено темно-зеленым цветом, остальные цвета — миокард и сосуды.
УЛП — ушко левого предсердия; ЛВ — легочная вена; УПП — ушко правого предсердия; ВК — венозные клапаны;
ПГ — пограничный гребень; МПП — межпредсердная перегородка; ПВК — правый венозный клапан;
SAN — синоатриальный узел; ВПВ — верхняя полая вена; Ish/КС — правый синусовый рог/коронарный синус;
rsh — правый синусовый рог; ПТ — приносящий тракт (по [29] с изм.)
Б
Втр4 <- ТЬх5
f ^ 1
Pitx2-1 Shox2 -► ТЬхЗ Tbx18
Г t Т
Isl1 Nkx2-5
; 1//
Пейсмейкерные Сократительные
кардиомиоциты кардиомиоциты
Cacnalg, Нсп4, Сх43, Сх40, Scn5a,
Gjb6, Сх30.2 и т.д. Nppa/Nppb и т.д.
Рис. 2Б. Схема взаимодействия транскрипционных факторов при формировании пейсмейкерных и сократительных кардиомиоцитов. Фактор ТЬх18 блокирует гены, отвечающие за формирование сократительного миокарда; фактор Р^х2 блокирует развитие пейсмекерных кардиомиоцитов даже если в клетке присутствует ТЬх18 (по [33] с изм.)
свиньи в функционирующие пейсмейкерные клетки, регулирующие работу всего сердца, необходимы дальнейшие усилия по изучению «видоспецифиче-ских» последствий такого подхода в создании искусственного пейсмейкера, а также особое внимание следует уделить «тонкой настройке» программы развития кардиомиоцита. Например, показано, что транскрипционные факторы Ыкх2.5 и БЬох2 имеют общие сайты связывания с генами-мишенями, определяющими сократительную/пейсмейкерную программу развития клетки [40]. Взаимодействие Ыкх2.5 с мишенями приводит к «активации» программы развития сократительного кардиомиоцита, тогда как связывание фактора БЬох2 блокирует ее и развивается пейсмейкер [40,41].
создание идеального биологического
пейсмейкера: кардиальная дифференцировка
плюрипотентных стволовых клеток
Технологии получения индуцированных пациент специфических плюрипотентных клеток (ИПСК) и последующее развитие протоколов направленной дифференцировки в кардиальном направлении открыли новые подходы для разработки биологических пейсмейкеров. Стратегия заключается в получении и трансплантации пациент специфических пейсмей-керных кардиомиоцитов, удовлетворяющих всем молекулярным (ТЬх3 + , НСЫ4+, Сх30.2) и электрофизиологическим показателям (наличие фазы диастолической деполяризации, наличие ионных каналов, активирующихся при гиперполяризации (№ ток), функциональные межклеточные контакты). Для создания идеального биологического пейс-мейкера следует решить, как минимум, две задачи: разработка эффективного протокола получения пейсмейкерных кардиомиоцитов и адекватной технологии трансплантации, при которой клетки будут хорошо интегрироваться, генерировать потенциал действия и контролировать работу сердца в ответ на нервные сигналы.
На данный момент существуют надежные и воспроизводимые протоколы получения кардиомио-цитов на основании последовательной активации и ингибирования WNT пути, однако доля клеток, относящихся к пейсмейкерам (ТЬх3 + , HCN4+) среди них составляет не более 1—10% [42,43]. Недавно было показано, что для дифференцировки ИПСК (ЭСК) человека в пейсмейкеры не нужно ингибировать WNT путь, а следует ингибировать АсШ1п/№Са!Д0Рр и ЬРЭР сигнальный путь в присутствии ретиноевой кислоты (активирует БЬох2 и ТЬх3 через ТЬх 5 [29]) и ВМР4 ростового фактора (увеличивает количество ТЬх18+ предшественников). При использовании такого протокола дифференцировки количество пейс-мейкеров (ТЬх3 + , HCN4+) достигает 35% от всех кардиомиоцитов и их качество соответствует всем необходимым критериям на молекулярном и электрофизиологическом уровнях. Полученные клетки способны вызывать эктопическую пейсмейкерную активность при трансплантации в миокард крысы [44].
При разработке протоколов направленной диф-ференцировки в пейсмейкеры используют знания о развитии синоатриального узла в эмбриогенезе. Например, повысить долю пейсмейкерных кардиомиоцитов при дифференцировке ЭСК мыши до 60% удалось в результате трансдукции гена БЬох2 с по-
мощью стандартного протокола, и эти кардиомиоци-ты также обладали всеми необходимыми характеристиками [45]. Оригинальная модель биологического пейсмейкера была получена при кардиальной диф-ференцировке ЭСК мыши с конститутивной экспрессией копии гена NN04. Созданные «химерные» клетки имели черты сократительных кардиомиоцитов и функциональные каналы HNC4, которые участвовали в образовании № тока. При сокультивировании, квази-пейсмейкерные кардиоимоциты мыши обладали способностью задавать ритм вентрикулярным-кардиомиоцитам, дифференцированным из ИПСК человека [46].
Следует отметить, что дифференцированные из стволовых клеток кардиомиоциты скорее ближе по своим свойствам к эмбриональным или неонаталь-ным кардиомиоцитам: они обладают собственным механизмом автоматии, вероятно, основанным на механизме Са+-часов, или специфическими низкопороговыми каналами [25, 47] и непонятно, как они поведут себя после трансплантации, интеграции и созревании в миокарде. Однако на определенном этапе развития технологии создания биологического пейсмейкера, эти клетки безусловно полезны.
Трансплантация дифференцированных из ПК пейсмейкеров в миокард — отдельная задача, которую еще только предстоит решить. Известно, что синоатриальный узел содержит всего лишь около 10 000 пейсмейкеров. Генерируемый потенциал действия распространяется в ткани предсердия непосредственно между сократительными кардиомиоци-тами, без участия специализированных проводящих клеток. Т.е. для успешной работы биологического водителя ритма необходимо, чтобы трансплантированные пейсмейкеры корректно взаимодействовали между собой, а также с окружающими клетками «хозяина».
Идеальным вариантом будет создание т у^го «микроткани», в которой уже будут сформированы физиологические контакты пейсмейкерных клеток между собой. При проведении 3й кардиальной дифференцировки (в т.н. «бодиках») как раз и формируются такие естественные фрагменты «микроткани» [44, 46]. Для кардиомиоцитов, полученных при диф-ференцировке в монослое, необходимо формирование «микроткани» биологического пейсмейкера для последующей трансплантации в миокард.
Перспективы использования современных
материалов для развития тканевой инженерии
Тканевая инженерия — это современный подход к формированию организованной функциональной клеточной системы т у^го. Современные технологии тканевой инженерии дают возможность получать орган-специфичные структуры для регенеративной медицины [48, 49], а также позволяют контролировать процесс дифференцировки группы клеток в единую структуру, с функциональными возможностями той ткани, которая требуется исследователю. Клетки «засеваются» в трехмерные матрицы скаф-фолдных материалов для формирования живых тканевых продуктов, имеющие определенную структуру и функциональные свойства. Стремительное развитие тканевой инженерии за последние годы создает потребность создания материалов, которые могут помочь в конструировании тканей. Более того, высокоспециализированные клетки, такие как кар-
диомиоциты, являются наиболее требовательными к специфическим материалам тканевой инженерии, ввиду необходимости обеспечения функционального электрофизиологического единства клеток.
Использование полимеров на сегодняшний день является наиболее перспективным направлением в тканевой инженерии, ввиду их биосовместимости, способности к биологической деградации, а также благодаря надежным механическим свойствам [50]. Учитывая имеющиеся данные, наши будущие исследования будут связаны с созданием пейсмей-керных клеток человека и разработкой технологий имплантациии пейсмейкерных клеток путем применения полимерных нановолоконных матриц, что может послужить первым шагом к развитию кар-диальных тканей, которые требуются для регенеративной терапии.
заключение
Изучение процесса формирования автоматии-пейсмейкерных клеток в онтогенезе и эмбриогенезе показало, что это очень древняя и консервативная система, что выражается в высокой гомологии между ортологами ключевых генов, а также во взаимодействии факторов в эмбриогенезе. Таким образом, данные, полученные при изучении развития сино-атриального узла у грызунов являются актуальными для человека и других млекопитающих. В теме разработки биологического пейсмейкера наиболее сильные акценты расставлены на получение клеток в результате направленной кардиальной диффе-ренцировки индуцированных стволовых клеток с использованием ростовых факторов и активных низкомолекулярных соединений в соответствии с естественным ходом формирования пейсмейкеров-синоатриального узла в эмбриогенезе, либо попытке увеличить долю пейсмейкерных кардиомиоцитов, внося дополнительные копии гена Shox2 и повышая
ЛИТЕРАТУРА:
1. Adams R. Cases of diseases of the heart, accompanied with pathological observations. Hosp.Rep., Dublin; 1827.
2. Stokes W. Observations on some cases of permanently slow pulse. Dublin Q. J. Med. Sci., 1846; 2: 73-85.
3. Keith A., Flack M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. J. Anat. Physiol., 1907; 41: 172-89.
4. Lewis T., Oppenheimer B.S., Oppenheimer A. The site of origin of the mammalian heart-beat: the pacemaker in the dog. Heart 1910; 2: 147-69.
5. His W. Die Tätigkeit des embryonalenHerzens und derenBedeutungfür die Lehre von der Herzbewegungbeim Erwachsenen Title. Arb. Med. Klin. Leipzig 1893; 14-49.
6. Tawara S., Fischer V. Das Reizleitungs system des Säugetierherzens-Einenatomisch pathlogische Studieüber das Atrioventrikularbündel und die Purkinjeschen Fäden. Jena, Germany; 1906.
7. McWilliam J.A. Electrical stimulation of the heart in man. Br. Med. J. 1889; 1: 348-50.
8. Bigelow W.G., Callaghan J.C., Hopps J.A. General hypothermia for experimental intracardiac surgery: the use of electrophrenic respirations, an artificial pacemaker for cardiac standstill, and radio-frequency rewarming in general hypothermia. Transactions of the Meeting of the American Surgical Association1950; 68: 211-9.
9. Zoll P.M. Resuscitation of the heart in ventricular standstill by external electric stimulation. N. Engl. J. Med. 1952; 247(20): 768-71.
10. Jeffrey K. The invention and reinvention of cardiac pacing. Cardiol. Clin. 1992; 10: 561-71.
11. Lidwell M.C. Cardiac disease in relation to anaesthesia. In: Proceedings of the Third SessionofAustralasian Medical Congress(British Medical Association); 1929 Sep 2-7; Sydney, Australia;1929. p.160.
12. Мареев Ю.В. Модуляция сердечной сократимости влечении пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Патология кровообращения и кардиохирургия 2014; 18(4): 158-63.
уровень транскрипционного фактора, который отвечает за программу развития пейсмейкера. Также отдельной темой исследований является модификация сократительных кардиомиоцитов в направлении «развития» пейсмейкерных свойств с помощью введения дополнительных копий генов Tbx18 или Ncn4. Однако данные, полученные в этих экспериментальных работах либо являются неоднозначными, как в случае с трансдукцией гена Tbx18 в сократительные кардиомиоциты, когда одна группа исследователей видела появление эктопической электрической активности на модели крысы, морской свинки и свиньи [34, 39], а другая группа исследователей не смогла повторить этот эксперимент на мышиной модели [36], либо не приводят к созданию всех необходимых компонентов для формирования и распространения потенциала действия, как в случае с трансдукцией дополнительной копии гена ^п4 эктопической экспрессии на «фоне» соматических клеток.
Развитие технологии получения биологических пейсмейкеров открывает достаточно широкие перспективы изучения генной и клеточной терапии, которые могут найти свое применение не только в кардиостимуляции, но и сопутствующих направлениях. За последние десятилетия были продемонстрированы достаточно интригующие результаты, протестированные на различных моделях. Результаты, базируемые на генных исследованиях, показали потенциальные преимущества биологического пейсмейкера по сравнению с электрической стимуляцией [51], но в будущем еще предстоит сделать достаточно много шагов для оптимизации постоянства функционирования данных клеток, методов их доставки и безопасности в долгосрочной перспективе.
Благодарности
Выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10322).
13. Alt E., Matula M., Theres H. et al. The basis for activity controlled rate variable cardiac pacemakers: an analysis of mechanical forces on the human body induced by exercise and environment. Pacing Clin. Electrophysiol. 1989; 12: 1667-80.
14. Стрельников А.Г., Якубов А.А., Сергеевичев Д.С. идр. Метод эндокардиальной инъекции ботулотоксина в ганглионарные сплетения автономной нервной системы сердца в целях снижения уязвимости к фибрилляции предсердий. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4): 99-107.
15. Rosen M.R. 15th annual GordonK. Moe Lecture. Heart Rhythm 2005; 2(4): 418-28.
16. Rosen M.R., Brink P.R., Cohen I.S. et al. Genes, stem cells and biological pacemakers. Cardiovasc. Res. 2004; 64(1): 12-23.
17. Kashiwakura Y., Cho H.C., Barth A.S. et al. Gene transfer of a synthetic pacemaker channel into the heart: a novel strategy for biological pacing. Circulation 2006; 114(16): 1682-6.
18. Kehat I., Khimovich L., Caspi O. et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2004; 22(10): 1282-9.
19. Lakatta E.G., Maltsev V.A., Vinogradova T.M. A Coupled SYSTEM of intracellular Ca2+ clocks and surface membrane voltage clocks controls the timekeeping mechanism of the heart's pacemaker. Circ. Res. 2010; 106(4): 659-73.
20. Yaniv Y., Ahmet I., Liu J. et al. Synchronization of sinoatrial node pacemaker cell clocks and its autonomic modulation impart complexity to heart beating intervals. Heart Rhythm2014; 11(7): 1210-9.
21. Yaniv Y., Lakatta E.G., Maltsev V.A. From two competing oscillators to one coupled-clock pacemaker cell system. Front. Physiol. 2015; 6(FEB): 1-8.
22. Yaniv Y., Spurgeon H.A., Lyashkov A.E. et al. Crosstalk between mitochondrial and sarcoplasmic reticulum Ca2+ cycling modulates cardiac pacemaker cell automaticity. PLoS One 2012; 7(5): e37582.
23. Maltsev V.A., Yaniv Y., Maltsev A.V. et al. Modern Perspectives on Numerical Modeling of Cardiac Pacemaker Cell. J. Pharmacol. Sci. 2014; 125(1): 6-38.
24. Zhang X.H., Wei H., Saric T. et al. Regionally diverse mitochondrial calcium signaling regulates spontaneous pacing in developing cardiomyocytes. Cell Calcium 2015; 57(5-6): 321-36.
25. Morad M., Zhang X.N. Mechanisms of spontaneous pacing: SA-nodal cells, neonatal cardiomyocytes, and human Stem cell derived cardiomyocytes. Can. J. Physiol. Pharmacol. 2017; 1-29.
26. Qu J., Barbuti A., Protas L. et al. HCN2 overexpression in newborn and adult ventricular myocytes: distinct effects on gating and excitability. Circ. Res. 2001; 89(1): E8-14.
27. Miake J., Marban E., Nuss H.B. Functional role of inward rectifier current in heart probed by Kir2.1 overexpression and dominant-negative suppression. J. Clin. Invest. 2003; 111(10): 1529-36.
28. Edelberg J.M., Aird W.C., Rosenberg R.D. Enhancement of murine cardiac chronotropy by the molecular transfer of the human 2 adrenergic receptor cDNA. J. Clin. Invest. 1998; 101(2): 337-43.
29. Christoffels V.M., Smits G.J., Kispert A. et al. Development of the pacemaker tissues of the heart. Circ. Res. 2010; 106(2): 240-54.
30. Vedantham V. New Approaches to Biological Pacemakers: Links to Sinoatrial Node Development. Trends Mol. Med. 2015; 21(12): 749-61.
31. Ye W., Song Y., Huang Z. et al. Genetic regulation of sinoatrial node development and pacemaker program in the venous pole. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2015; 2(4): 282-98.
32. Burkhard S., Eif V., Garric L. et al.On the Evolution of the cardiac pacemaker.J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2017; 4(2): 4.
33. Weerd J.H., Christoffels V.M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development 2016; 143(2): 197-210.
34. Kapoor N., Liang W., Marban E. et al. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat. Biotechnol. 2012; 31(1): 54-62.
35. Brand T. Tbx18 and the generation of a biological pacemaker. Are we there yet? J. Mol. Cell. Cardiol.2016; 97: 263-5.
36. Greulich F., Trowe M.O., Leffler A. et al.Misexpression of Tbx18 in cardiac chambers of fetal mice interferes with chamber-specific developmental programs but does not induce a pacemaker-like gene signature. J. Mol. Cell. Cardiol. 2016; 97: 140-9.
37. Yang M., Zhang G., Wang T. et al. TBX18 gene induces adipose-derived stem cells to differentiate into pacemaker-like cells in the myocardial microenvironment. Int. J. Mol. Med. 2016; 38(5): 1403-10.
38. Bakker M.L., Boink G.J., Boukens B.G. et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemakerlike cells. Cardiovasc. Res. 2012; 94(3): 439-49.
39. Hu Y.F., Dawkins J.F., Cho H.C. et al. Biological pacemaker created by minimally invasive somatic reprogramming in pigs with complete heart block. Sci. Transl. Med. 2014; 6(245): 245-94.
40. Ye W., Wang J., Song Y. et al. A common Shox2-Nkx2-5 antagonistic mechanism primes the pacemaking cell fate in the pulmonary vein myocardium and sinoatrial node. Development 2015; 142: 2521-32.
41. Espinoza-Lewis R.A., Yu L., He F. et al. Shox2 is essential for the differentiation of cardiac pacemaker cells by repressing Nkx2-5. Dev. Biol. 2009; 327(2): 376-85.
42. Burridge P.W., Matsa E., Shukla P. et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat. Methods 2014; 11(8): 855-60.
43. LianXiaojun S.P., Bao1 X., Zilberter M. et al. Chemically defined albumin-free human cardiomyocyte generation. Nat. Methods 2015; 12(7): 595-6.
44. Protze S.I., Liu J., Nussinovitch U. et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nat. Biotechnol. 2017; 35(1): 55-68.
45. lonta V., Liang W., Kim E.et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports 2015; 4(1): 129-42.
46. Saito Y., Nakamura K., Yoshida M. et al. Enhancement of spontaneous activity by hcn4 overexpression in mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes - a possible biological pacemaker. PLoS One 2015; 10(9): 1-16.
47. Du D.T.M., Hellen N., Kane C. et al. Action potential morphology of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes does not predict cardiac chamber specificity and is dependent on cell density. Biophys. J. 2015; 108(1): 1-4.
48. Isenberg W.J.Y. Building structure into engineered tissues. Mater. Today 2006; 12(9): 54-60.
49. Vacanti C.A. History of tissue engineering and a glimpse into its future. Tissue Eng. 2006; 12(5): 1137-42.
50. Orlova Y., Magome N., Liu L. et al.Electrospun nanofibers as a tool for architecture control in engineered cardiac tissue. Biomaterials 2011; 32(24): 5615-24.
51. Boink G.J., Christoffels V.M., Robinson R.B. et al. The past, present, and future of pacemaker therapies. TrendsCardiovasc. Med. 2015; 25(8): 661-73.
Поступила: 03.01.2017
