CC BY
138
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИНИНА
УДК 612.17:612.014.42
ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАРДИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ИЗОФОРМ 1{ КАНАЛА
Науфаль Шамилевич Загидуллин 12, Шамиль Зарифович Загидуллин1
1 Кафедра пропедевтики внутренних болезней (зав. — проф. Ш.З. Загидуллин) Башкирского государственного медицинского университета Росздрава, г.Уфа, 2клиника внутренних болезней IIIКельнской университетской клиники, Германия,
е-таИ: nau36@ufanet.ru
Реферат
Кардиальный ионный ток I., определяющий пейс-мекерную функцию синоатриальных клеток, кодируется 3 генами-изоформами: HCN1, HCN2, HCN4. Констатировано, что HCN1 ток обладает наиболее быстрой кинетикой активации, а HCN4 — самой медленной. При этом HCN2 ток имел наибольшее сходство с нативным I. током, что является основанием для использования этой изоформы при создании биологического пейсмекера. Повышение концентрации ионов калия во внеклеточном растворе привело к увеличению плотности тока и сдвигу кривой активации в негативную сторону в изоформах HCN1 и, в особенности, в HCN4, что может быть причиной остановки сердца в диастоле при гиперкалиемии.
Ключевые слова: кардиальный ионный ток I., гены изоформы HCN1, HCN2, ЖМ4, овариальные клетки, кинетика активации.
В основе функционирования пейсме-керных клеток лежит активность ионного тока I., активирующегося при деполяризации и инициирующего спонтанную активность данных клеток. I. ток обнаружен во многих типах возбуждаемых клеток, включая ретинальные фоторецепторы, кардиальные пейсмекерные клетки, нейроны периферической и центральной нервной систем [8]. Важнейшим шагом вперед в понимании молекулярных свойств I. канала и механизмов контроля пейсмекерной функции сердца в начале 1990-х годов стало клонирование генов трех НеК каналов — НеШ, НеК2, ^N4, комбинация которых и формирует данный ток [9]. Н€№ изоформы существенно различаются в своих электрофизиологи-ческих характеристиках — плотностью тока, проводимостью и кинетикой активации [8]. Несколько фундаментальных исследований, характеризующих электро-физиологические свойства Н€№ изоформ и их параметров, показали, что они весьма вариабельны. Например, для Н€№2 канала напряжение в точке полуактивации
172
(V ) находилось в диапазоне от -73 [4] до -91 [11] и -106 мВ [5]. Аналогичной была и кинетика активации (т).
В последнее время достаточно интенсивно изучается возможность создания биологических пейсмекеров (БП), и одним из его вариантов является имплантация генетически модифицированных клеток, например мезенхимальных, трансфицированных генами, способными создавать пейсмекерный ток в клетке [1, 2]. Для определения гена-кандидата, наиболее близкого If току, при трансфекции трансплантируемых клеток необходима электрофизиологическая характеристика тока кардиоспецифических изоформ.
Широко известна способность повышенной концентрации ионов калия в крови или при перфузии гиперкалиево-го раствора через изолированное сердце в эксперименте замедлять ритм сердца, а при более высоких концентрациях — и останавливать его в диастоле [12, 13]. В клинической практике нередки случаи почечной недостаточности с повышением концентрации данного иона, а также передозировки лекарственных средств, содержащих калий [10]. Использование модели гиперкалиемии во внеклеточном растворе в эксперименте позволяет изучить влияние высокого содержания калия на электрофизиологические свойства ионных токов HCN изоформ.
Целью исследования являлось изучение электрофизиологических свойств HCN1, HCN2 и HCN4 изоформ по данным метода patch clamp (фиксации потенциала) в модификации whole cell («вся клетка») в физиологическом и гиперкалиевом растворах при экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков (ОККХ) для определения гена-кандидата при создании биологического пейсмекера.
Для исследования электрофизиологи-ческих свойств HCN изоформ нами была выбрана клеточная система овариальных клеток китайских хомячков, достаточно хорошо зарекомендовавшая себя в экспериментах с экспрессией калиевых и других каналов и последующими микро-электродными исследованиями [14, 15]. Для трансфекции были использованы плазмиды pAdCGI-HCN1, pAdCGI-HCN2, pAdCGI-HCN4, содержащие соответственно гены HCN1, HCN2 и HCN4, а также усиленный зеленый флюоресцирующий белок (УЗФБ). За 24 часа до трансфекции ОККХ линии K1 были посеяны на чашки Петри с плотностью 2,0*105 на каждые 35 мм чашки в 10% среде DMEM (Dialbeco modified essential medium), содержащей необходимые эссенциальные аминокислоты, антибиотик (пенициллин) и др. Клетки были трансфицированы соответствующей HCN плазмидой с плотностью 0,25 мкг/чашка с помощью молекулярно-биологической системы «Липо-фектамин Плюс» (липофектамин, США) по рекомендациям производителя. Трансфицированные клетки выявлялись под микроскопом Lieca Mycrosystems (США) как клетки с зеленым излучением с помощью ксеноновой лампы при длине волны 488/530 нм (возбуждение/эмиссия).
Электрофизиологические исследования проводились при физиологических концентрациях ионов внеклеточного раствора и гиперкалиевого раствора (табл.1).
воздуха производили разрыв мембраны клетки. При потенциале покоя -35 мВ проводилась подача тестовых импульсов с напряжением от -30 до -150 мВ с шагом -10 мВ и записывался ток через мембрану клетки. В гиперкалиевом растворе максимальные значения не достигали «плато» при тестовых потенциалах до -150 мВ, и для получения сигмоидальной кривой активации тока при нормализованных значениях протокол исследования был модифицирован с повышением напряжения до -170 мВ. Для характеристики электрофизиологических свойств клеток из полученных кривых тока клеток определялись следующие параметры: амплитуда и плотность тока, константа кинетики активации (время от начала тока до достижения 66,6% максимума амплитуды тока). После нормализации плотности тока и создания кривой сигмоидальной регрессии соотношения плотность тока/напряжение по формуле Больцмана вычисляли фактор уклона кривой активации (к) и точку полуакти-вации (V ). Электрофизиологическое исследование проводилось в 6 группах: при физиологических концентрациях калия для изоформ нат, нага, нам (п=9, 11 и 10 соответственно) и в высококалиевом растворе (п=18, 11 и 12).
Статистический анализ производился с помощью парного критерия Стьюдента.
Микроэлектродные электрофизиологические исследования позволили устано-
Таблица 1
Состав внеклеточной жидкости в экспериментах по изучению электрофизиологических свойств HCN изоформ
Типы внеклеточной жидкости KCI NaCI CaCI2 Глюкоза MgCI2 HEPES
Физиологический раствор, ммоль/л 5 135 2 10 1 10
Высококалиевый раствор, ммоль/л 100 40 2 10 1 10
Интрацеллюлярный состав был постоянен и содержал (в ммоль/л) K-глютамат 130, KCI 15, NaCI 5, MgCI2 1, HEPES 10 и Mg-АТФ 5; pH был отрегулирован KOH до 7,3.
Электрофизиологические свойства клеток были исследованы с помощью стандартного микроэлектродного метода patch clamp в модификации whole cell. При контакте тонкой стеклянной пипетки с электродом внутри с клеткой в месте контакта путем подсасывания
вить, что при активации тока тестовыми потенциалами от -30 до -150 мВ наиболее быстро активировался ток изоформы НОШ, далее НОЮ, и самой медленной скоростью активации отличалась изоформа Н€№4 (рис.1). При попарном сравнении между HCN1-HCN2, HCN2-HCN4 и HCN1-HCN4 разница в параметрах константы активации т определялась при всех потенциалах тока (р<0,01 и р<0,001). В то же время разница в плотности тока, вычисляемая как отношение силы тока к
173
Рис.1. Кривые тока изоформ НСШ (слева) и НСШ (справа), полученные при последовательных тестовых импульсах от -30 до -150 мВ с продолжительностью импульса от 3 до 2,45 с и последующим реполяриза-ционным импульсом +5 мВ.
емкости клетки (пА/пФ), при сравнении всех трех изоформ оказалась несколько менее существенной, чем при сравнении кинетики их активации. Так, разница в плотности тока в паре НСШ-НСШ была достоверной только в самом начале ги-перполяризационного протокола (от -40 до -90 мВ, р<0,05). В паре НСШ-НСШ, наоборот, плотность тока достоверно различалась при более отрицательных потенциалах — от -100 до -150 мВ (р<0,05 и р<0,01), что, очевидно, связано с более быстрым достижением плато (насыщением) у НСШ в сравнении с другими изоформами. И лишь при сравнении потенциалов в паре НСШ-НСШ значения различались при всех тестовых потенци-
Электрофизиологические параметры HCN изоформ
Рис.2. Нормализованное соотношение плотность тока/ напряжение по плотности тока в изоформах НСШ (квадраты), НСШ (треугольники) и НСШ (круги).
При нормализации кривых тока по максимальному значению с последующим построением сигмоидальной регрессии по уравнению Больцмана изоформа НСШ обладала минимальным среди всех изоформ показателем полуактивации — У1/2=-90,03±4,4 мВ (табл.2, рис. 2). Изоформа НСШ, несмотря на то что имела показатель полуактивации чуть меньший, чем у изоформы НСШ (-106,92±2,2 мВ против -108,82±1,8 мВ; р>0,05), обладала наименьшим фактором уклона (кНСШ=10,18 против кНСШ=10,18±0,59; р>0,05 и проТаблица 2
в физиологическом и высококалиевом растворах
Параметры НСШ НСШ НСШ
К+ 5 К+ 100 К+ 5 К+ 100 К+ 5 К+ 100
п 9 18 11 11 10 12
Плотность тока (-140 мВ) 37,2±7,8 83,8±14,1** 30,5±3,4 72,8±15,8tt 18,2±2,2 26,91±4,1ф
т (-140 мВ) 54,62±7,6 69,5±9,3 153±12 172,0±26,4 540,2±2,3 1300,6±212фф
Фактор уклона (к) 13,88±2,4 17,68±2,2 10,18±0,6 14,26±2 13,55±0,7 13,8±0,8
В м -90,±4,4 -108,8±4,8* -106,92±2,2 -104,63±4,4 -108,82±0,7 -152,96±3,1ффф
Активация тока, мВ -30 - -40 -40 - -50 -30 - -40 -30 - -40 -50 - -60 -70 - -80
Примечание. Достоверность различий при попарном сравнении для каждой из изоформ в высококалиевом/физиологическом растворе: * в изоформе НСШ, t в НСШ, ф в НСШ, *,^$ р<0,05, **,Ц\ФФ р<0,01, ***,Ц1', ффф р<0,001.
алах, при которых ток вообще регистрировался (р<0,001). При этом активация тока изоформы НСШ начиналась значительно позже, чем у двух других изоформ (от -50- до -60 мВ против -40 мВ). Вместе с тем ток изоформы НСШ значительно быстрее достигал максимальных значений (плато) начиная с -130 мВ, в то время как у НСШ и НСШ данная кривая тока переходила в пологую часть начиная с -150 мВ.
174
тив кНСШ=13,55±0,67; р<0,05), т.е. имела самую вертикальную кривую активации (табл.2, рис.2,).
При сравнении электрофизиологичес-ких параметров НС№ токов в высококалиевом растворе с физиологическим определялись следующие закономерности: во всех изоформах примерно в 2-3 раза возрастала плотность тока. При этом достоверность различий увеличивалась с ростом напряжения тестового сигнала и была
Напряжение (мВ)
Напряжение (мВ)
Рис.З. Нормализованное по плотности тока соотношение плотность тока/напряжение для изоформы НСШ в высоко-/низкокалиевом растворах.
максимальной в изоформе НСШ (р<0,01). При нормализации плотности тока по максимальному значению угол наклона кривой активации во всех изоформах достоверно не изменялся (табл.2).
В изоформе НСШ произошел достоверный сдвиг кривой активации влево, к более отрицательным значениям (V (К+5)= -90,03±4,4, Ví/2(K+100)= -108,8±4,75 (р<0,05). Соответственно и активация тока смещалась несколько левее — с- 30—40 до -40 —50 мВ (табл. 2, рис. 3). Повышение концентрации хлорида калия не сказалось на характере кривой активации изоформы НСШ — Ví/2(K+5)=-106,92±2,2, Ví/2(K+100)=-104,63±4,4 (р<0,05). Уклон
кривой активации и первая активация кривой также не изменялись в сравнении с таковыми в физиологическом растворе (р>0,05). В изоформе НСШ изменения кривой активации оказались наибольшими: произошел значительный (на -34 мВ) сдвиг влево — Ví/2K+5= -108,82±0,7, Ví/2K+100= -152,96±3,1; р<0,001 (табл.2, рис.4). Соответственно кривая активации тока смещалась к -70 — -80 мВ в сравнении с -50— -60мВ в контроле. В отличие от плотности тока, кинетика активации не была существенно изменена.
Таким образом, из трех изоформ НСШ показала самую быструю кинетику активации, далее следовала НСШ, и самой «медленной» изоформой оказалась НСШ. Кроме того, НСШ превосходила НСШ и, в особенности, НСШ в плотности тока. Ток НСШ активировался гораздо позже других изоформ (-50 -------60 мВ) и значи-
тельно раньше достигал порога насыще-
Рис.4. Нормализованное по плотности тока соотношение плотность тока/напряжение для изоформы НСШ в высоко-/низкокалиевом растворах.
ния (при -130 мВ). Полученные нами электрофизиологические характеристики изоформ в целом соответствуют данным литературы [4, 7, 11]. В то же время проведенные исследования позволили установить более выраженный сдвиг параметров Ví/2HCN2 (-106,92±2,21 мВ) и Ví/2HCN4 (-108,82±0,67 мВ) в сторону отрицательных показателей.
Согласно данным литературы [6], нативный 1( ток обладает средней кинетикой активации (т=-220 мс), активируется при -60 мВ, показатель полуактивации был равен -89,3±0,7 мВ, фактор уклона — 12,7±0,7 мВ. Сравнение этих данных с соответствующими параметрами изоформ HCN (табл.2) показало наибольшее сходство 1(. тока с изоформой НСШ, что позволяет считать её оптимальным кандидатом для создания биологического пейсмекера. Одним из вариантов его создания может быть трансгенная трансфекция мезенхимальных клеток геном изоформы НСШ с последующей имплантацией компетентных клеток в область синоатриального узла [2].
В высококалиевом экстрацеллюлярном растворе в сравнении с физиологическим значительно возрастала плотность тока, причем наиболее существенно в случае изоформы НСШ. В изоформе НСШ и еще больше в НСШ происходили значительные сдвиги кривой активации влево, т.е. к более отрицательным значениям. Кинетика активации во всех 3 изоформах не претерпевала существенных изменений. С учетом факта высоких концентраций изоформы НСШ в клетках синоатриаль-
ного узла [3] сдвиг кривой активации влево способен увеличить порог активации и время достижения следующего потенциала действия, что, в свою очередь, может замедлить ритм сердца вплоть до его остановки в диастоле.
ВЫВОДЫ
1. В микроэлектродных исследованиях при трансгенной экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков кардио-специфические изоформы HCN1, HCN2 и HCN4 показали различную кинетику активации тока с наиболее быстрой у HCN1 и медленной у HCN4.
2. Изоформа HCN2 по электрофизиоло-гическим параметрам наиболее близка к нативному If току, что позволяет рекомендовать её в качестве реального кандидата при создании биологического пейсмекера.
3. Повышенная концентрация калия во внеклеточном растворе приводит к увеличению плотности тока во всех изоформах и сдвигу активации тока изоформ HCN1 и HCN4 влево, являясь причиной при данных параметрах электролитного состава отрицательного хронотропного действия.
Исследование было выполнено при поддержке гранта Deutsche Herzstiftung.
ЛИТЕРАТУРА
1. Загидуллин Н.Ш., Загидуллин Ш.З. Возможности конструкции биологических водителей ритма при поражении синусового узла // Вестн. Военно-мед. акад. — 2007. — № 2 (18). — С.59-62.
2. Barbutti A., Baruscotti M., DiFrancesco D. The pacemaker current: from basic to the clinics// J. Cardiovasc. Electrophysiol. — 2007. — Vol. 18. — P. 342-347.
3. Biel M., Schneider A., Wahl C. Cardiac HCN channels: structure, function, and modulation// Trends Cardiovasc. Med. — 2002. — Vol. 12(5). — P. 206-212.
4. Chen J., Wang J., Siegelbaum S.A. Properties of hyperpolarization-activated pacemaker current defined by coassembly of HCN1 and HCN2 subunits and basal modulation by cyclic nucleotide. // J. Gen. Physiol. — 2001. — Vol. 117. — P. 491-504.
5. Er F., Ludwig A., Biel M. et al. Dominant-negative suppression of HCN channels markedly reduces the native pacemaker current I(f) and undermines beating of neonathal cardiomyocytes// Circulation. — 2003. — 107. — Vol. 485-489.
6. Hoppe U.C., Beuckelmann D.J. Characterization of the Hyperpolarization-activated Inward-Current (If) in Isolated Human atrial Myocytes//Cardiovasc. Res. —1998. — Vol. 38. — P. 788-801.
7. Ludwig A., Zong X., Jeglitsch M. et al. A family of hyperpolarization-activated mammalian cation channels// Nature. — 1998. — Vol. 393. — P. 587-591.
8. Moosmang S., Stieber J., Zong X. et al. Cellular expression and functional characterization of four hyperpolarization-activated pacemaker channels in cardiac and neuronal tissues// Eur. J Biochem. — 2001. — 268. — 1646-1652.
9. Santoro B., Tibbs G. The HCN gene family: molecular basis of the hyperpolarization-activated pacemaker channels. In: Molecular and functional diversity of ion channels and receptors// Ann. NY Acad. Sci. —1999. — Vol. 868. — P. 741-764.
10. Takaichi K., Takemoto F., Ubara Y., Mori Y. Analysis of factors causing hyperkalemia// Intern Med. — 2007. — Vol. 46 (12). — P. 823-829.
11. Ulens C., Tytgat J. Functional heteromultimerization of HCN1 and HCN2 pacemaker channels// J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276. — P.6069-6072.
12. Vuckovic K., Richlin D. Bradycardia induced by hyperkalemia //Am. Ass. Occupat. Heath Nuks. J. -2004. — Vol. 52 (5). — 186-187.
13. Walter R.B., Bachli E.B. Near-fatal arrhythmia caused by hyperkalaemia// Heart. — 2002. — Vol. 88 (6). — P. 578.
14. Whitaker G.M., Angoli D., Nazzari H. et al. HCN2 and HCN4 isoforms self-assemble and co-assemble with equal preference to form functional pacemaker channels// J. Biol. Chem. — 2007. — Vol. 282 (31). — P. 2900- 2909.
15. Yu H., Robinson I., Wymore B. et al. MinK-Related Peptide 1: A subunit for the Ion Channel Subunit Family Enhance Expression and Speeds Activation// Circ. Res. — 2001. — Vol. 88. — P. 84-87.
Поступила 07.04.08.
ELECTROPHYSIOLOGICAL CHARACTERIZATION
OF CARDIO SPECIFIC ISOFORMS OF THE IF CHANNEL
N.Sh. Zagidullin, Sh.Z. Zagidullin
Summary
Cardiac pacemaker ion current If, which determines the pacemaker function of sinoatrial cells is coded by 3 gens-isoforms - HCN1, HCN2 and HCN4. It is noted that HCN1 current has the fastest speed of activation and HCN4 -the slowest. HCN2 current showed greatest similarity to the native If channel and could potentially be used as a basis for creation of the biological pacemaker. The increase of potassium ion concentration in the extracellular bath solution led to an increase in current density and shifted the activation curve in the negative direction in isoforms HCN1 and especially in HCN4 which could possibly be the cause of cardiac arrest during diastole with hyperkalaemia.
Keywords: cardiac ion current If gen isoforms HCN1, HCN2 and HCN4; ovarian cells; activation kinetics.
