CC BY
19© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Х.Ф.Фам, Е.А.Боровикова, А.В.Сидоров, А.В.Каратаева, Т.П.Антонова, В.В.Зверев
ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДВУХСТУПЕНЧАТОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСОМ VARICELLA ZOSTER
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва
Цель. Показать возможность использования метода двухступенчатой ПЦР (nested PCR) для определения ДНК вируса Varicella Zoster (VZV) в клинических образцах периферической крови пациентов. Материалы и методы. В работе был использован материал от 35 больных с клиническими проявлениями опоясывающего герпеса и контрольной группы 20 здоровых доноров. Моноцитарную фракцию клеток венозной крови, предварительно обработанной гепарином, выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина, далее из клеток выделяли тотальную ДНК фенол-хлороформной экстракцией с последующим осаждением спиртом. Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклерах Терцик и TProfessional Gradient (Biometra), амплифицированную ДНК анализировали с помощью электрофореза на 1,6% агарозном геле в присутствии этидиум бромида. Результаты. Были получены данные по выявлению вирусной ДНК в моноцитах крови у 17 (49%) больных пациентов, а также у одного (из 20 в контрольной группе) практически здорового донора. В последнем случае обсуждается возможность субклинической реактивации вируса. Заключение. Показана возможность определения вирусной ДНК в моноцитах крови пациентов без использования дорогостоящего оборудования, что может найти применение в клинической практике, в особенности для диагностики больных с нехарактерными клиническими проявлениями, а также пациентов с субклиническими формами заболевания.
Журн. микррбиол., 2015, № 3, С. 25—30
Ключевые слова: вирус Varicella Zoster, ДНК, ПЦР, двухступенчатая ПЦР Kh.F.Fam, E.A.Borovikova, A.V.Sidorov, A.V.Karataeva, T.P.Antonova, V.V.Zverev
POSSIBILITY OF USING NESTED POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DIAGNOSTICS OF DISEASES CAUSED BY VARICELLA ZOSTER VIRUS
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Demonstrate the possibility of using nested PCR method for determination of Varicella Zoster virus (VZV) in clinical samples of peripheral blood of patients. Materials and methods. Material from 35 patients with clinical manifestations of herpes zoster and control group of 20 healthy donors was used in the study. Monocyte fraction of venous blood cells, pretreated with heparin, was isolated by centrifugation in ficoll-verografin density gradient, total DNA was then isolated from cells by phenol-chloroform extraction with subsequent precipitation with alcohol. Polymerase chain reaction was carried out in thermocyclers Tercyc and TProfessional Gradient (Biometra), amplified DNA was analyzed by electrophoresis on 1.6% agarose gel in the presence of ethidium bromide. Results. Data on detection of viral DNA in blood monocytes in 17 (49%) of ill patients, as well as in 1 (out of 20 in control group) practically healthy donor were obtained. A possibility of a subclinical reactivation of the virus is discussed in the latter case. Conclusion. A possibility of viral DNA determination in monocytes of patient blood without using expensive equipment is shown, that could find application in clinical practice, especially for diagnostics of patients with non-characteristic clinical manifestations, as well as patients with subclinical forms of the disease.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 3, P. 25—30
Key words: Varicella Zoster virus, DNA, PCR, nested PCR
ВВЕДЕНИЕ
Патогенный для человека вирус Varicella Zoster (VZV) относится к семейству гер-песвирусов и классифицируется как герпесвирус 3 типа [5]. К особенностям жизненного цикла следует отнести отсутствие природного «депо» (хозяином вируса является исключительно человек), а также способность переходить в латентное состояние после первичной инфекции. Считается, что у практически всех переболевших вирус в латентной форме персистирует в нервных узлах в течение неограниченного времени и сохраняет способность к реактивации, вызывая вторичную инфекцию. Характерными клиническими проявлениями VZV являются ветряная оспа (varicella, chickenpox) при первичном инфицировании или опоясывающий лишай (zoster, shingles) во время вторичной инфекции, вызванной либо диким вирусом, либо реактивацией латентной формы. Однако описаны случаи осложнений заболевания, не всегда сопровождающиеся высыпаниями, а также вирусассоциированные патологии и бессимптомное течение инфекции [3], что затрудняет диагностику. Цель работы — разработка способа определения ДНК вируса в клинических образцах с помощью двухступенчатой (nested) ПЦР (амплифицируя ДНК, выделенную из лейкоцитарной фракции периферической крови пациентов).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду, дополнительно деионизированную на колонке прибора Millipore Simplicity UV, удельное сопротивление воды составляло 18 мегаОм/см. В работе использовали Taq полимеразу производства «Синтол» и «Сибэнзим», а также высокоточную ДНК полимеразу Phusion (BioRad) для клонирования положительной контрольной ДНК VZV. Синтез и очистку праймеров заказывали на фирме «Синтол». Анализ нуклеотидных последовательностей, в том числе конструирование и анализ олигонуклеотидов, проводили, используя пакет программ Vector NTI.
Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови проводили путем центрифугирования гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколл-верографина [1]. Для выделения ДНК клетки лизировали с помощью инкубирования в течение часа при 55°С в 1% растворе додецилсульфата натрия и 300 мкл буфера, содержащего 40 mM трис-HCl (pH 7,5), 10mM ЭДТА и 100 mM NaCl, с добавлением протеиназы К в концентрации 0,02 мг/мл. В дальнейшем образцы ДНК выделяли из клеток либо фенол-хлороформной экстракцией [4] с последующим осаждением этанолом, либо с помощью набора DNA Prep 100 фирмы «Изоген».
При проведении ПЦР в качестве положительного контроля использовали фрагмент гена VZV, содержащий открытые рамки считывания 67 и 68, клонированный в плазмиде pGEM-T easy (Promega). Искомый клон получали с помощью амплификации ДНК вируса, выделенной фенол-хлороформной экстракцией из вакцины Varilrix (Бельгия), с использованием Phusion ДНК полимеразы (BioRad), прайме-ров ACAACAAGGATAAAACACGG (прямой) и TAAATTTACACGCTCGACGT (обратный) в условиях, рекомендованных производителем, с последующей обработкой ПЦР продукта Taq полимеразой, лигированием в плазмиду и трансформацией лиги-рующей смесью компетентных клеток СС001 (Евроген) с ампициллиновой и бело-голубой селекцией клонов. Последовательность вставки подтверждали сиквениро-ванием.
Анализ выделенных образцов ДНК проводили путем двухступенчатой ПЦР, амплифицируя фрагмент ДНК, кодирующий часть открытой рамки считывания 67, как показано на рис. 1. На первой стадии амплифицировали фрагмент ДНК длиной 677 пар нуклеотидов с помощью пары праймеров F1 и R1, полученные реакционные смеси использовали в качестве ДНК матриц во второй реакции с использованием пары праймеров F2 и R2, в результате которой получали ДНК длиной 446 пар ну-
клеотидов. ПЦР проводили в объеме 25 мкл в буфере фирмы-производителя Taq по-лимеразы с конечной концентрацией хлористого магния1,5 mM с добавлением 0,25 mM смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 mcM праймеров и 0,5 ед. фермента. Программа амплификации: 94°С — 10 мин; 30 циклов: 94°С — 1 мин, 60°С — 2 мин, 72°С — 2 мин; 72°С — 5 мин. [11]. Полученные ПЦР продукты анализировали с помощью электрофореза в 1,6% агарозном геле при добавлении этидиум бромида до конечной концентрации 0,2 мкг/мл.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В работе использовали клинический материал, полученный в московской инфекционной клинической больнице № 1 у двух групп пациентов. Первая группа состояла из 35 человек с клиническими проявлениями опоясывающего лишая, а вторую контрольную группу (20 пациентов) составили практические здоровые доноры. Сначала из венозной крови пациентов, обработанной гепарином в количестве 20 ед. на 1 мл цельной крови, получили фракцию мононуклеарных клеток путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (р=1,077), затем клеточный осадок лизировали, обрабатывали протеиназой К и выделяли тотальную клеточную ДНК либо фенол-хлороформной экстракцией, либо используя набор для выделения DNA Prep 100. На последней стадии выделения ДНК высаживали двумя объемами этанола из раствора, двумолярного по ацетату аммония, осадок дополнительно про-
F1
н2
К
51 L01 L51 201 251 301 35.1 101 ■151 501 Libl 601 ЬЫ
CC-KTA3ATGA
AArCGKGAG TTAiifli'iCrjTC ATKCCACGT TACCGC-TGCA ATCMGGTGTA TACCOCACM CÄACCCÜCÄC GrFaGÖTGTG
GGTÜCbATAG TCjACCAAGG ACCTGGTTGC GCXCAAGGOC GGKT7CGGS TP.CTTIACGC MGMATGDS CT7GGAGCTI GAACCICGAb ATCCAC-CATA TASGTCGTAT GGATGIGGAI ССГАСАССТА GITACCGT'IT L-bATGC-CAAA AACACSAGCA ТГСТОСТСЙГ
eecTTACTiu: WGAATGAl G AGTCTTCGCG ТСАбААВДК AATGATTAHS ТГЛСТААТАС ТлАТГАГСЙЙС ATTAßTCCCG WATL'TTfJTfi: 'JTTftCASAtG
№ДТ0Г:АЪГТ TCAATACGC-T AGTTATGCCA AAAGACTCAT TTTGTGAGITA GCACCGATTC DGTGGCTAAG TTTGOCGTCA. AAACGGCAGT TATGTTTAnA
дтасйдкггт
HGCGOGGAAR ACGCGCCT7T TCMEGTAAS
а-зттосаттх:
CACTGTTTGA СТСЛСЬААСТ
CATXCAl-ATC GTAAl&TtTAG ftAAAGCGTAC ТТИггл.ЛТи
Атесйгтгтт глсст ааааа сетдагАтсд
iic :Ai.rt :AT'A(-it':
TCTCCTDCTA ACCViiJCi.M'ii/i.
GAGGTCTITA
CTGCACAAAT
TGAGGTfllCfl
ACTCCAGAGT
AGOGGATITA
7CGCCTAAAT
7TAACCTGTA
AATTGGACAT
ACATACAftCA
7GTATGTTGT
ATACTAAAGA
11АТ£АТТГСТ
AAÜGAAGCGG
7TCCTTC-KC
ТС-ААСГС
ftCTTGAG
ATQCGGAfiTC TftOoCCTCAS GflTCATAACT fiThiVTATTiiA AGASAACGCA TCTCTT3CGT ATA(K№3i3Ä tatcgoccct СТОЭЗВДАСВ уллесеттус;
СДСАСАТАПА
отсгстйттт
AAGGAGATGT TTCCTC7AGA GTGGAAGAAA
grcgtt;ttt
TGSAGT7CGG AC7TCAGGCC CGSGAGACGG GCOCTCT-3GG TGCTTTCAAG AG3AAA&TTG GGATCASTTG GCTAGTCAAC ACCAACCGTG TG3TTG3CAC
TTCATMGTA AMi' L'AtGGA" CACCTTATFT STMAATMA GACGAACACC GTGCT7GTGG AttMT'JAATG TGCCAATTAC ATACXC^fiT TATCDCCCjl^ лтгктллл r:: ТЬДСДТТТЬГ: TAATCCAAriA AITÄGGTTTT A'J'CACXCGTT TAGTGGGGAA TACACCGASÄ ATGTGGCTCT AGCGCCCGOC TGGCGGGGGG ACGTGC-TGGT TCCftCCACCA GCCEAAATCA CGGCTTTA^1 ÜA.TTGTTGTA СТАЛСААСАТ
Рис. 1. Схематическое изображение использовавшегося в «двойной» ПЦР фрагмента открытой рамки считывания 67 (ORF67) и соответствующая нуклеотидная последовательность.
Отмечены пары праймеров для первой R1) и второй R2) реакций, последовательности праймеров выделены жирным шрифтом.
2 Э 4 5 Б 7 В 9 10 И 12
Рис. 2. Электрофорез продуктов ПЦР в 1,6% ага-розном геле, окрашенном этидиум бромидом.
100 bp, 11 и 12 — отрицательный контроль.
На дорожках 1 — 9 нанесены анализируемые образцы ДНК, 10 — маркеры молекулярных масс
мывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 50 — 100 мкл буфера трис-HCl (pH 8,0). При дальнейшем использовании ДНК в ПЦР в течение относительно короткого времени пробы хранили в холодильнике при 4°C, для длительного хранения образцы ДНК замораживали и держали при -20°C.
Для амплификации в качестве маркерного фрагмента вирусной ДНК была выбрана последовательность длиной 447 пар нуклеотидов, входящая в открытую рамку считывания 67 и кодирующая фрагмент гена гликопротеина I вируса, как показано на рис. 1. С целью получения искомого фрагмента проводили анализ вирусной ДНК в образцах с помощью двухступенчатой ПЦР с последовательным использованием двух пар праймеров. На первой стадии проводили амплификацию ДНК, используя праймеры, ограничивающие участок длиной 677 пар нуклеотидных остатков (п.н.). Следует отметить, что концентрации ДНК, полученной после первой амплификации исследуемых образцов, было недостаточно для визуализации в агарозном геле, а эффективность прохождения реакции оценивали, используя клонированный фрагмент гена вируса как положительную контрольную ДНК матрицу в полимеразной цепной реакции. На второй стадии проводили амплификацию с использованием второй пары праймеров, ограничивающих фрагмент ДНК размером 447 пар нуклео-тидных остатков, причем в качестве матрицы ДНК использовали реакционные смеси, полученные после первой ПЦР. После проведения амплификации реакционные смеси анализировали в 1,6% агарозном геле в присутствии этидиум бромида и визуализировали результаты на приборе для документации гелей (BioRad), как это представлено выборочно по нескольким образцам на рис. 2. Положительными считали образцы, в которых в качестве основного продукта реакции получали ДНК с молекулярной массой, примерно соответствующей 447 п.н., сравнивая ДНК реакционных смесей с маркерами молекулярных масс (дорожка 10); на рис. 2 — это образцы 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, а такие образцы, как 3 и 9, без следов ПЦР продуктов, считали отрицательными.
В результате эксперимента ДНК вируса Varicella Zoster была обнаружена у 17 из 35 пациентов (49%) с клиническими проявлениями опоясывающего лишая, а также у 1 из 20 (5%) здоровых доноров.
ОБСУЖДЕНИЕ
Заболевания, вызываемые вирусом Varicella Zoster, остаются значимой социальной проблемой, несмотря на разработку вакцины и введение в ряде стран вакцинопрофилактики ветряной оспы [2]. Переболевшие являются носителями вируса в латентной форме, и до недавнего времени считалось, что вторичная инфекция возникает исключительно в результате реактивации, так как это было показано в ряде работ с помощью рестрикционного анализа вирусной ДНК [9, 15]. Однако было показано, что в некоторых случаях происходит вторичное инфицирование другим генетическим штаммом, чаще бессимптомное, что дополнительно осложня-
ет эпидемиологическую ситуацию, так как возможна реактивация любого штамма. К примеру, был описан пациент, дважды переболевший опоясывающим герпесом после первичной ветрянки, причем генотип следующего герпеса отличался от предыдущего [10]. Был даже описан случай выделения двух генетических вариантов вируса у ребенка с ветряной оспой [14], что было подтверждено методами полноразмерного сиквенирования. В настоящей работе мы попытались использовать метод двухступенчатой ПЦР, отличающийся относительной простотой и дешевизной, для анализа образцов от пациентов с подтвержденным диагнозом с целью показать возможность использования этого метода для анализа случаев со сложной этиологией, в том числе и бессимптомных. Считается, что вирус можно обнаружить в монону-клеарных клетках крови в течение только первых нескольких дней после реактивации или инфицирования, например, японские исследователи показали наличие ДНК вируса в 60% образцов [11], что несколько выше по сравнению с данными, полученными нами (49%). Однако необходимо подчеркнуть, что мы анализировали 35 образцов крови, в то время как Ito M. et al. [11] только 10, что свидетельствует о более высокой статистической достоверности наших данных. Необходимо также учитывать возможность вирусных мутаций, а также вторичного заражения другим генотипом вируса, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Генотипирование образцов, полученных в Москве (20 образцов) и Новосибирске (12 образцов), было проведено Loparev VN. et al. [12] с помощью метода полиморфизма (точечных замен) в сайтах рестрикции эндонуклеаз (BglI в ORF54 и PstI в ORF38), и было показано, что VZV в России относится к европейскому генотипу, позднее классифицированному как Е1 [13]. Однако использование методов полноразмерного геномного сиквенирования для анализа генома ВВЗ позволило выявить три гипервариабельных участка: ORF 1-3, ORF 35-37, ORF 57-68 [10]. Хотя появление мутаций в кодирующей области ORF 67 (gI), влияющих на результаты ПЦР, представляется маловероятным, такую возможность нельзя исключать полностью. Более того, в одной из работ [7] при анализе геномов дикого вируса и культивируемого штамма с помощью полноразмерного геномного сиквенирования было показано, что количество точечных нуклеотидных полиморфных замен (SNP — single nucleotide polymorphism) в диком вирусе существенно выше, чем в культивируемом на низких пассажах штамме: 197 (41 подтвержденная замена) в диком против 42 (6 подтвержденных) в культивируемом.
Что же касается обнаружения вирусной ДНК в одном из образцов из пула здоровых доноров, то следует обратить внимание на следующее. Образцы от практически здоровых доноров были получены у переболевших пациентов, излечившихся от опоясывающего лишая и не имевших клинических проявлений инфекции в течение, как минимум, последних 6 месяцев перед забором крови. Другими словами, у всех пациентов контрольной группы, исходя из общих соображений о жизненном цикле VZV, вирус, скорее всего, находился в латентной форме. Поэтому, если отбросить артефакт, здесь можно указать на бессимптомную реактивацию вируса, как, например, было описано при исследовании образцов астронавтов [6], хотя возможен и случай вторичного инфицирования, протекающего также бессимптомно. Точный ответ можно было бы получить, сравнив результаты генотипирования ДНК вируса исследуемого образца с ДНК из образца, полученного у того же пациента в момент острой инфекции. Также для получения более статистически достоверных данных численность пула здоровых доноров должна быть существенно увеличена.
Таким образом, метод двухступенчатой ПЦР может быть использован как дополнительное подтверждение реактивации вируса или инфицирования, особенно при анализе нетипичных клинических случаев, вызываемых вирусом (например, неврологических расстройств без высыпаний на коже [8]), а также бессимптомного течения инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Казанова А.С., Лавров В.Ф., Кузин С.Н. и др. Сравнительная оценка эффективности традиционного серологического и модифицированного метода диагностики опоясывающего герпеса. Журн. микробиол. 2013, 2: 89-95.
2. Казанова А.С., Лавров В.Ф., Дубоделов Д.В. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: история и перспективы вакцинопрофилактики. Эпидемиол. инфекц. бол. Акт. вопр. 2011, 2: 36-41.
3. Лавров В.Ф., Казанова А.С., Кузин С.Н. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: особенности заболеваемости и клинических проявлений. Эпидемиол. инфекц. бол. Акт. вопр. 2011, 3: 54-60.
4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир. 1984.
5. Cohen J.I. The Varicella Zoster Virus Genome. Curr. Top. Mircobiol. Immunol. 2010, 342: 1-14.
6. Cohrs R.J., Mehta S.K., Schmid D.S. et al. Asymtomatic reactivation and shed of infectious varicella zoster virus in astronauts. J. Med. Virol. 2008, 80 (6): 1116-1122.
7. Depledge D.P, Palser A.L., Watson S.J. et al. Specific capture and whole-genome sequencing of viruses from clinical samples. PloS One. 2011, 6 (11): e27805.
8. Gilden D., Cohrs R.J., Mahalingam R. et al. Neurological disease produced by varicella zoster virus reactivation without rash. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2010, 342: 243-253.
9. Hayakawa Y., Yamamoto T., Yamanishi K. et al. Analysis of varicella-zoster virus DNAs of clinical isolates by endonuclease HpaI. J. Gen. Virol. 1986, 67: 1817-1829.
10. Hambleton S., Steinberg S.P., Larussa P.S. et al. Risk of herpes zoster in adults immunized with varicella vaccine. J. Infect. Dis. 2008, 197 (2): S196-S199.
11. Ito M., Nishihara H., Mizutani K. et al. Detection of varicella-zoster virus (VZV) DNA in throat swabs and peripheral blood mononuclear cells of immunocompromised patients with herpes zoster by polymerase chain reaction. Clin. Diagn. Virol. 1995, 4: 105-112.
12. Loparev V.N., Gonzalez A., Deleon-Carnes M. et al. Global identification of three major genotypes of varicella-zoster virus: longitudinal clustering and strategies for genotyping. J. Virol. 2004, 78: 8349-8358.
13. Loparev V.N., Rubtcova E.N., Bostik V. et al. Identification of five major and two minor genotypes of varicella-zoster virus strains: a practical two-amplicon approarch used to genotype clinical isolates in Australia and New Zeland. J. Virol. 2007, 81: 12758-12765.
14. Quinlivan M., Sengupta N., Breuer J. A case of varicella caused by co-infection with two different genotypes of varicella-zoster virus. J. Clin. Virol. 2009, 44: 66-69.
15. Straus S.E., Reinhold W., Smith H.A. et al. Endonuclease analysis of viral DNA from varicella and subsequent zoster infections in the same patient. New Engl. J. Med. 1984, 311: 13621364.
16. Tyler S.D., Peters G.A., Grose C. et al. Genomic cartography of varicella-zoster virus: a complete genome-based analysis of strain variability with implications for attenuation and pheno-typic differences. Virology. 2007, 359: 447-458.
Поступила 17.06.14
Контактная информация: Сидоров Александр Викторович, к.б.н.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)674-76-37
