CC BY
14ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
А.С.Казанова1, В.Ф.Лавров1, С.Н.Кузин1, Л.К.Эбралидзе1, С.Л.Ведунова1, НА.Малышев2, С.А.Русанова2, Л.Е.Кузина2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАДИЦИОННОГО СЕРОЛОГИЧЕСКОГО И МОДИФИЦИРОВАННОГО МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОПОЯСЫВАЮЩЕГО ГЕРПЕСА
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, 2Инфекционная клиническая больница № 1, Москва
Цель. Сравнительная оценка эффективности традиционного серологического и модифицированного методов диагностики заболевания, возникающего вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса (УХУ). Материалы и методы. Были обследованы две группы пациентов. Основная группа включала 39 больных манифестной формой опоясывающего герпеса (ОГ), контрольная — 20 здоровых доноров. Половой состав групп не различался. Традиционный метод серологической диагностики включал в себя определение в сыворотке крови больных и доноров с помощью ИФА анти^Е У2У IgG и анти-У£У IgG и анти-^М. Модифицированный метод заключался в выделении на градиенте плотности и культивировании в течение 48 ч мононуклеаров периферической крови (МПК) в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина и гентамицин. В дальнейшем, используя ИФА, в культуральной среде определяли концентрацию анти-У2У IgG и ^М. Результаты. У всех обследованных больных ОГ и здоровых доноров в крови были обнаружены анти-У£У IgG. Только у 26 (67%) из 39 больных ОГ в сыворотке крови определяли анти^Е У2У IgG и анти-У2У ^М. Среди доноров ложноположительные результаты по этим маркерам выявляли в 10% и 5% случаев, соответственно. При одновременном определении анти^Е У2У IgG и анти-У£У ^М специфичность метода возрастала до 100%, чувствительность диагностического метода, основанного на одномоментном определении анти^Е У2У IgG и анти-У£У ^М, составила 59%. При анализе спонтанной продукции МПК анти-У£У антител у 38 (97,4%) из 39 больных в культуре МПК определяли анти-У2У IgG, продукцию анти-У£У ^М наблюдали лишь у 4 пациентов. В контрольной группе ложноположительных результатов продукции МПК анти-У2У IgG и ^М модифицированным методом выявлено не было (специфичность 100%). При равном уровне специфичности чувствительность модифицированного метода, основанного на определении спонтанной продукции анти-У2У IgG культурой МПК, достоверно превышала эффективность
традиционной серологической диагностики (97,4 и 59%, р<0,0001). Заключение. Полученные данные позволяют рекомендовать для диагностики манифестных и атипичных форм VZV-инфекции, возникающих вследствие эндогенной реактивации вируса, новый модифицированный метод лабораторной диагностики заболевания как обладающий большей чувствительностью по сравнению с традиционным серологическим методом.
Журн. микробиол., 2013, № 2, С. 83—90
Ключевые слова: вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса, моно-нуклеары периферической крови, VZV-инфекция, реактивация вируса, серологическая диагностика
A.S.Kazanova1, V.F.Lavrov1, S.N.Kuzin1, L.K.Ebralidze1, S.L.Vedunova1, N.A.Malyshev2, S.A.Rusanova2, L.E.Kuzina2
COMPARATIVE EVALUATION OF EFFECTIVENESS OF TRADITIONAL SEROLOGIC AND MODIFIED METHODS OF HERPES ZOSTER LABORATORY DIAGNOSTICS
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, 2Infectious Diseases Clinical Hospital No. 1, Moscow, Russia
Aim. Comparative evaluation ofeffectiveness oftraditional serologic and modified diagnostic methods of disease arising due to varicella and herpes zoster virus (VZV) reactivation. Materials and methods. 2 groups of patients were examined. The main group consisted of 39 patients with manifest form of herpes zoster (HZ), control — 20 healthy donors. Sex composition of the groups did not differ. Traditional method of serologic diagnostics included determination of anti-gE VZV IgG and anti-VZV IgG and anti-IgM in patient and donor blood sera by using EIA. Modified methods consisted of isolation in density gradient and cultivation for 48 hours of peripheral blood mononuclears (PBMC) in RPMI-1640 complete culture medium containing 10% offetal bovine serum, 4 mM L-glutamin and gentamycin. Concentrations ofanti-VZV IgG and IgM were then determined in culture medium by using EIA. Results. In all the examined HZ patients and healthy donors anti-VZV IgG were detected in blood. Only in 26 (67%) of 39 HZ patients anti-gE VZV IgG and anti-VZV IgM were determined in blood sera. Among donors false positive results for these markers were detected in 10% and 5% of cases, respectively. During simultaneous determination of anti-gE VZV IgG and anti-VZV IgM the specificity of the method increased to 100%, sensitivity of the diagnostic method based on simultaneous determination of anti-gE VZV IgG and anti-VZV IgM was 59%. During analysis of spontaneous production of anti-VZV antibodies by PBMC in 38 (97.4%) of 39 patients anti-VZV IgG were determined in PBMC culture, anti-VZV IgM production was observed only in 4 patients. In control group false positive results ofanti-VZV IgG and IgM production by PBMC was not detected by the modified method (100% specificity). At equal specificity level sensitivity of the modified method based on determination of spontaneous anti-VZV IgG production by PBMC culture was significantly higher than effectiveness of the traditional serologic diagnostics (97.4% and 59%, p<0.0001).
Conclusion. The data obtained allow to recommend during diagnostics of manifest and atypical VZV infection forms arising due to endogenous virus reactivation the new modified method of laboratory diagnostics of the disease as having higher sensitivity compared with traditional serologic method.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 2, P. 83-90
Key words: varicella and herpes zoster virus, peripheral blood mononuclears, VZV infection, virus reactivation, serologic diagnostics
ВВЕДЕНИЕ
Вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса (Varicella Zoster Virus, VZV) вызывает заболевания, которыми переболевает большая часть населения Земли. По данным Центра по контролю и профилактики заболеваний США к 40-летнему возрасту VZV заражается до 99,6% населения планеты [9]. До недавнего времени считалось, что VZV-инфекция протекает исключительно в манифестной форме с характерными везикулярными высыпаниями независимо от того является ли она следствием первичного экзогенного заражения или вторичной эндогенной реактивации вируса [2]. Долгое время основным и вполне достаточным диагностическим приемом был метод клинической диагностики. В настоящее время с этой целью успешно применяются молекулярно-генетические методы, в частности, ПЦР. Для постановки ПЦР требуется минимальное количество вируса, выделяемого из содержимого везикул на коже больного [3]. Удалось установить реактивацию VZV, исследовав с помощью ПЦР содержимое единственного пузырька на коже пациента [14]. Однако и у этого современного метода есть ограничения, связанные с трудностью получения материала для исследований. Так, показано, что адаптивный иммунитет к VZV способен в значительной степени или даже полностью подавлять кожные проявления инфекции, не отменяя при этом репликацию вируса в нервной ткани. Часто это завершается возникновением особой формы опоясывающего герпеса (ОГ) без высыпаний — Zoster Sine Herpete [5]. Более того, процесс реактивации с антероградным распространением вируса из тройничного узла и чувствительных ганглиев первых шейных спинномозговых нервов приводит к заражению клеток адвентиции сосудов головного мозга и трансмуральному проникновению вируса в интиму артерий, где происходит его репликация [10 — 12]. Вирусиндуцированное поражение сосудов головного мозга в виде VZV-васкулопатии может вызывать развитие инсультов и формирование сосудистых мальформаций [11]. Показано, что в 37% случаев VZV-васкулопатия не сопровождается характерными везикулярными высыпаниями, однако тяжесть неврологического поражения при этом сохраняется [6, 7]. Интерес к лабораторным методам диагностики реактивации VZV, в том числе при атипичной (без сыпи) форме болезни, связан, главным образом, с особенностями патогенеза VZV-инфекции. Известно, что в процессе реактивации вируса в кровотоке часто не наблюдается высокого уровня циркуляции вирионов,
виремия отсутствует, распространение вируса происходит преимущественно трансаксональным путем. Ввиду этого, традиционная серологическая и молекулярно-генетическая диагностика атипичных форм VZV-инфек-ции, включая Zoster Sine Herpete, при всей ее необходимости и важности сопряжена с существенными трудностями.
В работах Vendrell J.P. et al. было показано, что при цитомегаловирусном мононуклеозе, первичной токсоплазменной инфекции, бруцеллезе в культуре мононуклеаров периферической крови (МПК) больных, в состав которой входят преимущественно лимфоциты и моноциты, наблюдалась активная продукция специфических к соответствующему инфекционному агенту антител (Ат) [15 — 17].
Исходя из этого, целью нашего исследования стала оценка эффективности нового, адаптированного к диагностике сложных, в частности, атипичных форм VZV-инфекции, возникающих на фоне эндогенной реактивации вируса, метода, в основе которого лежит спонтанная продукция in vitro МПК больных ОГ анти-VZV IgG. Наряду с этим, в задачи исследования входила сравнительная оценка диагностической значимости традиционного метода определения таких серологических маркеров реактивации вируса, как анти-gE VZV IgG, анти-VZV IgM и разработанного нами модифицированного метода лабораторной диагностики VZV-инфекции [4, 13].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании были включены две группы пациентов — опытная и контрольная. Опытная группа состояла из 39 больных ОГ с различной локализацией сыпи, находящихся на стационарном лечении в ИКБ №1. Средний возраст больных составлял 63,7±18,1 лет. Забор крови проводился в среднем на 7,0±3,7 день с момента заболевания (3 — 22 день болезни), началом которого считался день появления неврологической симптоматики, предшествующей в большинстве случаев высыпаниям на коже. Так, например, в одном случае забор крови у пациента проводили в день появления сыпи, при этом шли уже 4 сутки заболевания.
Вторая группа — контроля состояла из 20 практически здоровых доноров, перенесших ветряную оспу (15 человек) или неосложненный опоясывающий герпес (5 человек) не менее 6 месяцев назад. Средний возраст доноров составлял 55,0±11,7 лет. Двое добровольцев находились в контакте с больными ОГ (работники инфекционного отделения) в заразный период. Гендерный состав групп достоверно не различался.
Традиционную серологическую лабораторную диагностику ОГ проводили с использованием иммуноферментных тест-систем (ИФТС) «Векторбест» (Новосибирск) «Векто gE-VZV — IgG» и «Векто VZV — IgM», позволяющих определять в крови больных серологические маркеры острой VZV-инфекции — IgG к поверхностному гликопротеину E вируса (gE VZV), а также анти-VZV IgM. Концентрацию анти-VZV IgG в сыворотке определяли с помощью ИФТС «Векто VZV — IgG». Учет результатов проводили с помощью спектрофотометра EL-X800 при длине волны 450 нм и выра-
жали в ОП. Положительным признавали результат, превышающий сумму ОП отрицательного контроля для данной ИФТС и 0,3 ОП.
Для определения спонтанной продукции специфических антител МПК in vitro из гепаринизированной венозной крови (20 ед. гепарина на 1 мл цельной крови), полученной натощак, на градиенте плотности фиколл-верографина (р=1,077) выделяли МПК, которые трижды отмывали при 4°С, доводили до концентрации 1х106 кл/мл, а затем культивировали при 37°С в жидкой питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина и гентамицин. Через 48 ч МПК осаждали центрифугированием при 250 g, а надосадочную культу-ральную жидкость замораживали при -18°С и хранили до проведения ИФА. В дальнейшем образцы надосадочной жидкости из культуры клеток больных ОГ и здоровых доноров в объеме 100 мкл вносили в лунки плоскодонных полистироловых планшетов ИФТС «Векто VZV — IgG». Кроме того, культуральную жидкость анализировали на наличие IgM Ат к VZV, используя для этого ИФТС «Векто VZV — IgM». Оценку специфичности продукции анти-VZV IgG в образцах из культур клеток больных ОГ проводили с помощью ИФТС «ЦМВ-Скрин» «Биосервис» (Москва).
Анализ и верификацию данных осуществляли, применяя стандартный пакет программ Statistica 8.0 (StatSoft) для персональных компьютеров. Оценку достоверности различий показателей в основной и контрольной группе, а также сравнение эффективности традиционного и модифицированного метода диагностики проводили с использованием t-критерия.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В образцах крови всех обследуемые нами больных ОГ и здоровых доноров были обнаружены IgG к VZV, т.е. эти лица оказались серопозитив-ными по отношению к вирусу. При этом значения концентрации анти-VZV IgG в сыворотках крови больных ОГ и здоровых доноров имели статистически достоверные различия. У больных концентрация Ат была достоверно выше, чем у здоровых серопозитивных к VZV доноров. Так, в группе больных ОГ средний уровень анти-VZV IgG составил 3,43±1,05 ОП, а в группе доноров — 2,47±1,53 ОП (р=0,046). Тем не менее, ввиду того, что максимальные значения ОП сывороток, полученных из крови доноров и больных, достоверно не различались, был сделан вывод о том, что концентрация анти-VZV IgG в сыворотке крови пациента, выраженная в ОП, не может служить серологическим маркером острой VZV-инфекции.
Тринадцать из 39 больных ОГ (33%) не имели в сыворотке крови анти-VZV IgM и у 13 больных (также 33%) отсутствовали анти-gE VZV IgG, т.е. у тех и других в крови не выявляли серологические маркеры острой VZV-инфекции. В группе доноров число IgM позитивных к VZV лиц составило 5%, а имеющих анти-gE VZV IgG, соответственно, 10%. Избежать ложно-положительных результатов при выявлении серологических маркеров острой VZV-инфекции позволяет симультанное определение анти-VZV IgM и анти-gE VZV IgG. В сыворотке крови больных ОГ оба маркера одновременно выявляли лишь у 23 из 39 пациентов (59%).
Таким образом, определение в сыворотке крови больных ОГ анти^Е У2У IgG и анти-У2У ^М как серологических маркеров острой У2У-инфекции показало их достаточно высокую диагностическую значимость. При этом в сыворотке крови 10 из 39 больных ОГ (26%) ни один из указанных маркеров обнаружен не был, и, таким образом, у 26% больных диагноз «опоясывающий герпес» лабораторного подтверждения с использованием традиционных методов серологической диагностики не получил.
В нашем исследовании у 38 из 39 больных ОГ, начиная с третьего дня болезни, наблюдалась спонтанная продукция МПК анти-У2У IgG. Концентрация анти-У2У IgG в культуральной жидкости МПК этих больных была очень высокой, у подавляющего числа образцов превышала 4,0 ОП, в среднем 3,327+1,21 ОП. Минимальное значение, выявленное у одного из пациентов этой группы, составил 0,6 ОП.
Только у одной больной ОГ на 3 день заболевания продукция анти-У2У IgG МПК не определялась, что, вероятно, могло быть следствием малого количества антителопродуцентов в культуре либо результатом нарушения В-клеточного иммунного ответа. У этой пациентки также была отмечена низкая концентрация анти-У2У IgG и ^М в сыворотке — 1,1 и 0,597 ОП, соответственно.
Продукция специфических ^М у больных ОГ была зарегистрирована лишь у 4 из 39 пациентов, что характерно для вторичного противовирусного иммунного ответа. При этом в культурах мононуклеаров крови всех 4 пациентов концентрация анти-У2У ^М была низкой — 0,470+0,1 ОП. Исходя из этого, определение анти-У2У ^М в культуре МПК больных ОГ в качестве маркеров реактивации У2У, по нашему мнению, можно считать нецелесообразным.
Ни в одном из образцов среды, полученном из культуры клеток здоровых доноров, в том числе находившихся в контакте с больными ОГ, продукции специфических анти-У2У IgG и ^М обнаружено не было, ОП среды культивирования не превышала величину отрицательного контроля для данных ИФТС (0,067 ОП и 0,089 ОП, соответственно). Кроме того, все образцы среды, взятые из культуры МПК доноров и больных ОГ, были отрицательны на анти-ЦМВ IgG, что определенно указывает на специфичность антительного ответа МПК у всех обследованных лиц.
Таким образом, чувствительность метода диагностики острой У2У-инфекции, возникающей вследствие эндогенной реактивации вируса, который основан на анализе спонтанной продукции МПК анти-У2У IgG, по нашим данным составляет 97,4% при полном отсутствии ложнополо-жительных результатов. Если метод дополнить определением в сыворотке крови больных анти-У2У ^М, то чувствительность диагностики достигает 100% . Модифицированный метод, показавший чувствительность 97,4%, оказался достоверно эффективнее традиционной серологической диагностики, с помощью которой удалось подтвердить лишь 59% случаев ОГ (р<0,001).
ОБСУЖДЕНИ Е
Несмотря на введении в ряде стран вакцинопрофилактики ветряной оспы, VZV-инфекция вследствие реактивации вируса остается значимой проблемой для человечества [1, 8]. В ходе нашего исследования в сыворотках всех обследуемых, в том числе здоровых доноров, определяли различные, преимущественно, высокие концентрации анти-VZV IgG, что явилось отражением известного уровня инфицированности населения данным вирусом [9].
Нами было установлено, что симультанное определение таких важных серологических маркеров острой инфекции как анти-VZV ^М и анти-gE VZV IgG позволяет избежать ложноположительных результатов и в определенной степени может служить эффективным скрининговым приемом выявления эндогенной реактивации VZV. Уровень диагностической значимости одновременного определения с помощью ИФА в сыворотке крови анти-VZV ^М и анти-gE VZV IgG по нашим данным составляет 59%. Тем не менее, необходимо отметить, что более чем у 26% больных ОГ не удавалось выявить ни одного из указанных маркеров в сыворотке крови.
Разработанный нами метод, в основе которого лежит анализ спонтанной продукции мононуклеарами периферической крови больных опоясывающим герпесом анти-VZV IgG in vitro, в процессе выполнения исследования показал высокие чувствительность и специфичность (97,4 и 100% соответственно). Таким образом, метод оказался достоверно эффективнее традиционной серологической диагностики и может быть реализован при верификации сложных, главным образом, атипичных случаев заболеваний, вследствие реактивации VZV, в частности, Zoster Sine Herpete и VZV-васкулопатия без высыпаний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Казанова А.С., Лавров В.Ф., Дубоделов Д.В. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: история и перспективы вакцинопрофилактики. Эпидем. и инфекц. бол. Актуальные вопросы. 2011, 2: 36-41.
2. Лавров В.Ф., Казанова А.С., Кузин С.Н. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: особенности заболеваемости и клинических проявлений. Эпидем. инфекц. бол. Актуальные вопросы. 2011, 3: 54-60.
3. Beards G., Graham C., Pillay D. Investigation of vesicular rashes for HSV and VZV by PCR. J. Med. Virol. 1998, 54 (3): 155-157.
4. Dobec M., Bossart W., Kaeppeli F. et al. Serology and serum DNA detection in shingles. J. Swiss. Med. Wkly. 2008, 138 (3 — 4): 47-51.
5. Gilden D.H., Cohrs R.J., Mahalingam R. et al. Neurological disease produced by varicella zoster virus reactivation without rash. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2010, 342: 243 — 253.
6. Gilden D.H., Cohrs R.J., Mahalingam R. et al. Varicella zoster virus vasculopathies: diverse clinical manifestations, laboratory features, pathogenesis, and treatment. Lancet Neurol. 2009, 8 (8): 731-740.
7. Gilden D.H., Kleinschmidt-DeMasters B.K., LaGuardia J.J. et al. Neurologic complications of the reactivation of varicella-zoster virus. N. Engl. J. Med. 2000, 342 (9): 635-645.
8. Insinga R.P., Itzler R.F., Pellissier J.M. et al. The incidence ofherpes zoster in a United States administrative database. J. Gen. Intern. Med. 2005, 20 (8): 748-753.
9. Kilgore P.E., Kruszon-Moran D., Seward J.F. et al. Varicella in Americans from NHANES III: implications for control through routine immunization. J. Med. Virol. 2003, 70 (1): 111-118.
10. Mayberg M., Langer R.S., Zervas N.T. et al. Perivascular meningeal projections from cat trigeminal ganglia: possible pathway for vascular headaches in man. Science. 1981, 213 (4504): 228-230.
11. Nagel M.A., Traktinskiy I., Azarkh Y. et al. Varicella zoster virus vasculopathy: analysis of virus-infected arteries. Neurology. 2011, 77 (4): 364-370.
12. Saito K., Moskowitz M.A. Contributions from the upper cervical dorsal roots and trigeminal ganglia to the feline circle of Willis. Stroke. 1989, 20 (4): 524-526.
13. Thomsson E., Persson L., Grahn A. et al.Recombinant glycoprotein E produced in mammalian cells in large-scale as an antigen for varicella-zoster-virus serology. J. Virol. Methods. 2011, 175 (1): 53-59.
14. Vena G.A., Apruzzi D., Vestita M. et al. Zoster «a lmost» sine herpete: diagnostic utility of real time-polymerase chain reaction. New Microbiol. 2010, 33 (4): 409410.
15. Vendrell J.P., Pratlong F., Decoster A. et al. Secretion of Toxoplasma gondii-specific antibody in vitro by peripheral blood mononuclear cells as a new marker of acute toxoplasmosis. Clin. Exp. Immunol. 1992, 89 (1): 126-130.
16. Vendrell J.P., Segondy M., Ducos J. et al. Analysis of the spontaneous in vitro anti-HIV-1 antibody secretion by peripheral blood mononuclear cells in HIV-1 infection. Clin. Exp. Immunol. 1991, 83 (2): 197-202.
17. Vendrell J.P., Segondy M., Fournier A.M. et al. Spontaneous in vitro secretion of antibody to cytomegalovirus (CMV) by human peripheral blood mononuclear cells: a new approach to studying the CMV-immune system interaction. J. Infect. Dis. 1991, 164 (1): 1-7.
Поступила 19.06.12
Контактная информация: Казанова А.С.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, (495)674-55-01
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
А.Б.Жебрун, А.В.Сварваль, О.А.Балабаш, Р.С.Ферман
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИИ HELICOBACTER PYLORI У ПАЦИЕНТОВ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА
НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Пастера, Санкт-Петербург
Цель. Изучение штаммов Н. pylori, циркулирующих в Санкт-Петербурге, среди пациентов с различной патологией желудочно-кишечного тракта, а также изучение частоты инфекцирования Н. pylori по данным серологических маркеров среди данной группы больных. Материалы и методы. С помощью серологического метода были обследованы 162 человека с различными хроническими заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки. Исследовано наличие в сыворотке крови IgG к бактериальному антигену H.pylori и IgG к его токсину-CagA. Бактериологически обследованы 129 пациентов, исследованию подлежали био-
