CC BY
67
9. Crucitti T., Van Dyck E., Tehe A. et al. Comparison of culture and different PCR assays for detection of Trichomonas vaginalis in self collected vaginal swab specimens // Sex. Transm. Infect. 2003. V. 79. P. 393 - 398.
10. Tabrizi S.N. et al. Evaluation of real time polymerase chain reaction assays for confirmation of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples tested positive in the Roche Cobas Amplicor assay // Sex. Transm. Infect. 2004. V. 80. P. 68 - 71.
11. Krashin J.W., Koumans E.H., Bradshaw-Sydnor A.C. et al. Trichomonas vaginalis prevalence, incidence, risk factors and antibiotic-resistance in an adolescent population // Sex. Transm. Dis. V. 37. № 7, July 2010. P 440 - 444.
Новый метод диагностики инфекции, возникающей вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая
А.С. Казанова1 (pendelbus@gmail.com), В.Ф. Лавров1, С.Н. Кузин1, Л.К. Эбралидзе1, С.Л. Ведунова1, Н.А. Малышев2, С.А. Русанова2, Л.Е. Кузина2
1ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва (instmech@iitp.ru) 2ГУЗ «Инфекционная клиническая больница № 1», Москва
Резюме
Разработан новый метод лабораторной диагностики инфекции, возникающей вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (Varicella zoster virus - VZV), основанный на анализе продукции специфических антител мононуклеа-рами периферической крови (МПК). В культуре МПК 38-ми из 39-ти больных манифестной формой вторичной VZV-инфекции, протекающей в виде опоясывающего лишая, наблюдался активный синтез специфического IgG, что подтверждалось его обнаружением в культуральной жидкости с помощью ИФА. В группе, состоящей из 20-ти серопозитивных к VZVдоноров, продукции специфических противовирусных антител обнаружено не было. Чувствительность и специфичность разработанного нами метода, таким образом, составили соответственно 97,4 и 100%, что позволяет рекомендовать его для диагностики VZV-инфекции (в том числе ее атипичных форм), возникающей вследствие эндогенной реактивации вируса.
Ключевые слова: вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая, реактивация вируса, VZV-инфекция, опоясывающий лишай, мононуклеары периферической крови, VZV-IgG
A New Method for Diagnosis of Infection that Occurs Due to Reactivation of Varicella Zoster Virus
A.S. Kazanova1 (pendelbus@gmail.com), V.F. Lavrov1, S.N. Kuzin1, L.K. Ebralidze1, S.L. Vedunova1, N.A. Malyshev2, S.A. Rusanova2, L.E. Kuzina2
1The Federal State Budgetary Institution «I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera» of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow (instmech@iitp.ru)
2 State Institution of Public Health «Clinical Hospital of Infectious Disease № 1», Moscow Abstract
A new method based on spontaneous antibody production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in acute Herpes zoster (HZ) patients has been developed. VZV-IgG production was observed in 48-hour PBMC culture of 38 from 39 HZ patients, but in none of the control group, which consisted of 20 seropositive to VZV donors, with sex and age matching HZ patients. Sensitivity and specificity of PBMC antibody production measurement in diagnosis of endogenous VZV reactivation gained 97.4 and 100% respectively. The method could be applied to diagnosis of atypical VZV reactivation, i.e. Zoster sine herpete and VZV-vasculopathy without rash. Key words: Varicella zoster virus, virus reactivation, VZV-infection, Herpes zoster, peripheral blood mononuclear cells, VZV-IgG
Введение
Первичная инфекция, вызываемая вирусом ветряной оспы и опоясывающего лишая (Varicella zoster virus - VZV), - ветряная оспа протекает в большинстве случаев легко и имеет благоприятный прогноз [2]. Введение в национальные иммунизационные программы ряда стран обязательной вакцинации против ветряной оспы привело к снижению заболеваемости, особенно в детском возрасте, однако уровень инфицированности взрослого населения «диким» штаммом VZV остается по-прежнему
высоким [1]. По данным CDC, в США 99,6% лиц возрастной группы 40 - 49 лет инфицированы VZV [7].
Во время первичной инфекции VZV трансаксо-нальным и гематогенным путем проникает в чувствительные ганглии черепно-мозговых и спинномозговых нервов, в ганглии нодозного и чревного сплетений вегетативной нервной системы, где пожизненно персистирует в латентном состоянии [2]. В дальнейшем, при снижении функциональной активности адаптивного (преимущественно клеточного) иммунитета с возрастом, а также в результа-
те стресса, повреждений головного мозга, приобретенных иммунодефицитов (при ятрогенной имму-носупрессии больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, у реципиентов солидных органов, пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита), возможна реактивация VZV.
Инфекция, возникающая вследствие эндогенной реактивации вируса, протекает в виде опоясывающего лишая (ОЛ) - заболевания, для которого характерны везикулярные высыпания по ходу нервов в пределах одного - трех дерматомов, сопровождающиеся выраженным болевым синдромом. Более половины случаев ОЛ осложняется постгерпетической невралгией, невритами, парезами, VZV-васкулопатией [6]. В ряде случаев противовирусный иммунный ответ значительно снижает кожные проявления инфекции (Zoster sine herpete), но не отменяет репликацию вируса в ганглиях [4]. Более того, без сыпи может протекать наиболее грозное проявление VZV-инфекции, возникающее при реактивации персистирующего в тройничном ганглии и чувствительных ганглиях первых шейных спинномозговых нервов вируса, - VZV-васкулопатия [8, 10, 11]. Постановка диагноза при этом крайне затруднена. Антероградное трансаксональное распространение VZV после реактивации и преимущественная локализация в ЦНС затрудняют применение ПЦР-диагностики. Метод выявления в сыворотке крови больных ОЛ в качестве маркеров острой VZV-инфекции IgM не обладает достаточной чувствительностью и специфичностью [3].
Высокую чувствительность продемонстрировал диагностический подход, основанный на анализе интратекального синтеза специфических антител [12]. Однако необходимость проведения для его реализации люмбальной пункции существенно ограничивает использование данного метода.
Ранее было показано, что при первичных цито-мегаловирусной (ЦМВ) и токсоплазменной инфекциях мононуклеарными клетками периферической крови (МПК) больных, при их культивировании in vitro, спонтанно синтезируются специфические к инфекционному агенту антитела (Ат) [13, 14].
Цель исследования - разработка высокочувствительного метода лабораторной диагностики вторичной VZV-инфекции, которая возникает вследствие эндогенной реактивации вируса, основанного на анализе спонтанной продукции МПК больных ОЛ специфического IgG in vitro.
Материалы и методы
В исследовании принимали участие две группы испытуемых. Основная группа включала 39 пациентов с типичной формой реактивации VZV в виде ОЛ, находившихся на стационарном лечении в ИКБ № 1. Средний возраст больных составлял 63,7 ± 18,1 года. Забор крови проводился на 7-й день (± 3,7 дня) с момента появления неврологической симптоматики (3 - 22-й день болезни). Начало высыпаний не всегда совпадало с появле-
нием парестезий. Так, в одном случае забор крови у пациента на 4-й день болезни пришелся на первые сутки с момента появления сыпи.
Контрольная группа состояла из 20-ти практически здоровых доноров, ранее (не менее шести месяцев назад) перенесших ветряную оспу (15 человек) или ОЛ (5 человек). Средний возраст - 55,0 ± 11,7 года. Два донора были в контакте с больными ОЛ (работники отделения). Тендерный состав групп достоверно не различался. Критерием включения в группу контроля было наличие детектируемого уровня VZV-IgG в сыворотке крови. Серопозитивность определяли методом ИФА с использованием коммерческой иммуноферментной тест-системы (ИФТС) «Векто VZV-IgG» производства ЗАО «Векторбест» (г. Новосибирск).
Выделение и культивирование МПК
Из гепаринизированной венозной крови (20 ед. натрия гепарина на 1 мл цельной крови), полученной натощак, на градиенте плотности фиколл-верографин (Р = 1,077) выделяли МПК. Клетки трижды отмывали при температуре 4 °С, доводили до концентрации 1 х 106 кл.мл и культивировали в стерильных стеклянных пробирках при 37 °С в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина и гентамицин. Через 48 часов МПК осаждали центрифугированием при 250 g в течение 15 минут, а полученную надосадочную культуральную жидкость разливали в пластиковые микропробирки по 350 мкл и хранили до проведения ИФА при -18 °С.
ИФА
Неразведенную, а также пяти- и десятикратно разведенную в фосфатно-солевом буфере культуральную жидкость по 100 мкл вносили в лунки планшета ИФТС «Векто VZV-IgG». В дальнейшем при проведении ИФА следовали методическим рекомендациям производителя тест-системы. Учет результатов проводили с помощью ИФА-ридера Е1 х 800 при длине волны 450 нм. Результаты выражали в единицах оптической плотности (ОП). Культуральную жидкость анализировали также на наличие ^М к VZV с использованием ИФТС «Векто VZV-IgМ».
Оценку специфичности продукции антител проводили путем анализа образцов культуральной жидкости с помощью ИФТС «ЦМВ-Скрин» производства ЗАО «Биосервис» (Москва).
Обработка клеток ингибитором синтеза белка
Для подтверждения активного характера синтеза специфических антител МПК двух больных ОЛ культивировали в течение 30 минут при 37 °С в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 20 мкг/мл ингибитора синтеза белка циклогекси-мида (Са1Ьюс1лет, США), как описано J.R Vendrell с соавт. [15]. Затем клетки трижды отмывали, те-
стируя их жизнеспособность с помощью трипано-вого синего (приемлемым для исследования считался уровень витальности > 95%), доводили до концентрации 1 х 106 кл./мл и культивировали, как описано нами выше. МПК этих больных, культивируемые 30 минут при 37 °С в полной питательной среде без циклогексимида с последующими тремя отмывками, служили контролем.
Статистическая обработка данных
Для анализа и верификации данных использовали стандартный пакет программ Statistica 8.0 (StatSoft) для персональных компьютеров. В тексте указаны средние значения соответствующих параметров и среднеквадратического отклонения (M ± о). Для оценки достоверности различий показателей в основной и контрольной группах использовали t-критерий.
Результаты и обсуждение
Установлено, что все лица, принимавшие участие в исследовании, были серопозитивны к вирусу ветряной оспы и опоясывающего лишая. Уровни VZV-IgG в сыворотках крови больных ОЛ и практически здоровых доноров, выявленные с помощью ИФА, имели достоверные различия. В группе больных ОЛ концентрация Ат составила 3,43 ± 1,05 ОП, в группе доноров - 2,47 ± 1,53 ОП (Р = 0,046). Максимальные значения VZV-IgG в сыворотках крови больных и доноров были сопоставимы - 4,365 и 4,047 ОП соответственно.
При культивировании МПК пациентов in vitro у 38-ми из 39-ти больных ОЛ (97,4%) начиная с третьего дня болезни определялась активная спонтанная продукция VZV-IgG. Концентрация Ат в образцах неразведенной культуральной жидкости была, как правило, значительной, ее уровень превышал 4,0 ОП, минимальная концентрация Ат, которая была выявлена у одного из пациентов опытной группы, составляла 0,6 ОП. Разведение культуральной жидкости перед определением концентрации Ат в пять и десять раз существенно снижало чувствительность метода, положительный уровень VZV-IgG детектировался лишь у 28-ми и 24-х больных ОЛ из 38-ми, что составило соответственно 73 и 62%.
Необходимо отметить, что в культуре МПК одной из пациенток на 3-й день болезни выявить достоверно определяемую продукцию VZV-IgM и -IgG не удалось, что, возможно, стало следствием недостаточного количества антителопродуцентов в выделенной популяции лимфоцитов периферической крови. Нельзя исключить и генетически обусловленного снижения образования антител плазматическими клетками, что в определенной степени подтверждается низким содержанием в сыворотке периферической крови этой больной VZV-IgG и -IgM - 1,1 и 0,597 ОП соответственно.
В отличие от активной продукции МПК VZV-IgG у подавляющего числа больных ОЛ in vitro достовер-
но определяемое образование VZV-IgM было зафиксировано лишь у четырех из 39 пациентов, что характерно для вторичного иммунного ответа [9]. При этом средний уровень продукции VZV-IgM МПК всех четырех больных был низким - 0,47 ± 0,1 ОП. Исходя из этого, можно сделать вывод, что лабораторная диагностика острой инфекции, возникающей вследствие реактивации VZV, основанная на анализе продукции VZV-IgM в культуре МПК больных ОЛ, включая его атипичные формы, на практике не может быть успешно реализована.
Ни в одном образце культуры МПК здоровых доноров, в том числе находившихся в контакте с больными ОЛ, продукции VZV-IgG и -IgM обнаружено не было, ОП образцов не превышала величину отрицательного контроля для данных тест-систем (0,067 и 0,089 ОП соответственно). Кроме того, все образцы надосадочной жидкости, полученные из культуры клеток, как доноров, так и больных ОЛ, не содержали IgG к ЦМВ, что указывает на специфичность процесса антителообразования. При обработке МПК двух больных ОЛ циклогек-симидом (ингибитором синтеза белка) продукция VZV-IgG резко снижалась - с 0,6 до 0,229 ОП у одного больного и с 1,767 до 0,263 ОП - у другого, что свидетельствует об активном синтезе МПК специфических противовирусных антител, который блокировался в наших опытах с помощью данного препарата.
В результате проведенного исследования нами было продемонстрировано, что чувствительность метода лабораторной диагностики острой VZV-инфекции при эндогенной реактивации вируса, в основе которого лежит анализ спонтанной продукции VZV-IgG мононуклеарами периферической крови больных in vitro, оказалась очень высокой (97,4%), а специфичность метода с учетом полного отсутствия ложноположительных результатов составила 100%.
Таким образом, впервые были получены данные, указывающие на то, что при вторичной инфекции, возникающей вследствие эндогенной реактивации вируса, мононуклеарами периферической крови больных опоясывающим лишаем спонтанно синтезируются специфические к VZV IgG. Продукция VZV-IgG подтверждается их обнаружением в культуре клеток с помощью ИФА. Синтез специфических Ат МПК больных ОЛ in vitro, вероятнее всего, является следствием предшествующей активации клеток VZV-антигеном in vivo. В культуре клеток испытуемых из контрольной группы, ранее инфицированных VZV, признаков продукции VZV-IgG обнаружено не было, что, по-видимому, указывает на латентное состояние вируса, персистирующего в организме. Занос в культуру клеток больных ОЛ анти-VZV из сыворотки крови путем абсорбции на поверхности МПК представляется маловероятным, так как продукции VZV-IgG в культуре МПК доноров обнаружено не было при практически полной сопоставимости максимальных значений VZV-IgG
в сыворотках крови испытуемых обеих групп. Кро- Выводы ме того, на активный характер синтеза иммуно- 1. глобулинов указывают данные эксперимента с ингибитором синтеза белка - циклогексимидом, после обработки клеток которым уровень VZV-IgG в культуральной жидкости больных резко снижался. Ложноположительные результаты, полученные J.P. Vendrell et а1. (1991) в результате абсорбции на мононуклеарах крови сывороточных антител, 2. могли быть следствием избыточно высокой концентрации клеток (5 х 106 кл./мл) при культивировании [15]. В наших опытах ложноположительные результаты при исследовании МПК доноров отсутствовали. Продуцируемые клетками антитела были специфичны по отношению к изучаемому инфекционному агенту - VZV. Образования ЦМВ-^ выявлено не было.
Разработанный новый метод диагностики вторичной VZV-инфекции, основанный на оценке спонтанной продукции VZV-IgG в культуре МПК начиная с третьего дня болезни, продемонстрировал высокие показатели специфичности и чувствительности - 100 и 97,4% соответственно.
Метод может быть эффективным при диагностике атипичных случаев VZV-инфекции, возникающей вследствие эндогенной реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая, а также оказаться перспективным при диагностике вторичных инфекций, возникающих вследствие реактивации инфекционных агентов различной вирусной этиологии, в том числе других представителей семейства герпес-вирусов. ш
Литература
1. Казанова А.С., Лавров В.Ф., Дубоделов Д.В. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: история и перспективы вакцинопрофилактики // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2011. № 2. С. 36 - 41.
2. Лавров В.Ф., Казанова А.С., Кузин С.Н. и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: особенности заболеваемости и клинических проявлений // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2011. № 3. С. 54 - 60.
References
1. Kazanova A.S., Lavrov V.F., Dubodelov D.V. i dr. Vetrjanaja ospa i opojasyvajushchij lishaj: istorija i perspektivy vakcinoprofilaktiki // Epidemiologija i infekcionnye bolezni. Aktual'nye voprosy. 2011. № 2. P. 36 - 41.
2. Lavrov V.F., Kazanova A.S., Kuzin S.N. i dr. Vetrjanaja ospa i opojasyvajushchij lishaj: osobennosti zabolevaemosti i klinicheskih projavlenij // Epidemiologija i infekcionnye bolezni. Aktual'nye voprosy. 2011. № 3. P. 54 - 60.
3. Dobec M., Bossart W., Kaeppeli F. et al. Serology and serum DNA detection in shingles // J. Swiss. Med. Wkly. 2008. V. 138 (3 - 4). P. 47 - 51.
4. Gilden D., Cohrs R.J., Mahalingam R. et al. Neurological disease produced by Varicella zoster virus reactivation without rash // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2010. V. 342. P 243 - 253.
5. Gilden D., Cohrs R.J., Mahalingam R. et al. Varicella zoster virus vasculopathies: diverse clinical manifestations, laboratory features, pathogenesis, and treatment // Lancet Neurol. 2009. V. 8. P. 731 - 740.
6. Gilden D.H., Kleinschmidt-DeMasters B.K., LaGuardia J.J. et al. Neurologic complications of the reactivation of Varicella zoster virus // N. Engl. J. Med. 2000. V. 342 (9). P. 635 - 645.
7. Kilgore P.E., Kruszon-Moran D., Seward J.F. et al. Varicella in Americans from NHANES III: implications for control through routine immunization // J. Med. Virol. 2003. V. 70. (Suppl. 1). P. 111 - 118.
8. Mayberg M., Langer R.S., Zervas N.T. et al. Perivascular meningeal projections from cat trigeminal ganglia: possible pathway for vascular headaches in man // Science. 1981. V. 213 (4504). P. 228 - 230.
9. Medical Immunology, Sixth Edition. By G. Virella. New York, 2007. - 667 p.
10. Nagel M.A., Traktinskiy I., Azarkh Y. et al. Varicella zoster virus vasculopathy: analysis of virus-infected arteries // Neurology. 2011. V. 77 (4). P. 364 - 370.
11. Saito K., Moskowitz M.A. Contributions from the upper cervical dorsal roots and trigeminal ganglia to the feline circle of Willis // Stroke. 1989. V. 20 (4). P. 524 - 526.
12. Schultze D., Weder B., Cassinotti P. et al. Diagnostic significance of intrathecally produced herpes simplex and Varizella zoster virus-specific antibodies in central nervous system infections // Swiss. Med. Wkly. 2004. V. 134 (47, 48). P. 700 - 704.
13. Vendrell J.P, Pratlong F., Decoster A. et al. Secretion of Toxoplasma gondii-specific antibody in vitro by peripheral blood mononuclear cells as a new marker of acute toxoplasmosis // Clin. Exp. Immunol. 1992. V. 89 (1). P. 126 - 130.
14. Vendrell J.P, Segondy M., Fournier A.M. et al. Spontaneous in vitro secretion of antibody to cytomegalovirus (CMV) by human peripheral blood mononuclear cells: a new approach to studying the CMV-immune system interaction // J. Infect. Dis. 1991. V. 164 (1). P. 1 - 7.
15. Vendrell J.P, Segondy M., Ducos J. et al. Analysis of the spontaneous in vitro anti-HIV-1 antibody secretion by peripheral blood mononuclear cells in HIV-1 infection // Clin Exp. Immunol. 1991. V. 83 (2). P. 197 - 202.
ИНФОРМАЦИЯ РОСПОТРЕБНАДЗОРА
Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в январе - июле 2012 года
(По данным формы № 1 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях»). (Начало - на стр. 22, продолжение -на стр. 67)
В группе инфекций, управляемых средствами специфической профилактики, эпидемиологическая ситуация продолжает оставаться напряженной.
Заболеваемость корью за семь месяцев 2012 года увеличилась по сравнению с тем же периодом 2011 в 12,2 раза, в том числе среди детей до 14 лет - в 32,4 раза. Показатели заболеваемости корью составили 1,44 на 100 тыс. населения и 5,18 на 100 тыс. детей до 14 лет.
За семь месяцев 2012 года зарегистрировано 2060 случаев кори в 56 субъектах Российской
Федерации (в 2011 г. - 70 случаев). Из общего числа заболевших - 85,3% зарегистрировано в Центральном, Южном и Северо-Кавказском федеральных округах. В Центральном федеральном округе зарегистрировано 398 случаев (52,9%) в Москве и 101 случай (13,4%) - в Московской области. В Южном и Северо-Кавказском федеральных округах случаи кори отмечены на территории всех субъектов, наибольшее число - в Волгоградской области (272 случая) и Ставропольском крае (191 случай).
