CC BY
63
УДК 579.61; 579.222.3; 579.246.2
Инчагова К.С.12, Галаджиева А.А.23
1Оренбургский государственный университет 2Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства 3Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН E-mail: ksenia.inchagova@mail.ru
ВОЗДЕЙСТВИЕ АНТИБИТИКОВ КАНАМИЦИНА И ДОКСИЦИКЛИНА НА ОБРАЗОВАНИЕ АВТОИНДУКТОРА N-БУТИРИЛ^-ГОМОСЕРИН ЛАКТОНА КЛИНИЧЕСКИМИ ИЗОЛЯТАМИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Pseudomonas aeruginosa является одним из ведущих возбудителей внутрибольничных инфекций. Важной особенностью этого патогена является образование биоплёнок и многочисленных секретируемых факторов вирулентности, находящихся под контролем системы химической плотностно-зависимой коммуникации («кворум сенсинга»). Разработка подходов к подавлению данной системы является неотъемлемым аспектом совершенствования антибиотикотерапии синегнойной инфекции.
В работе использованы четыре клинических изолята Pseudomonas aeruginosa, выделенные в одном из родовспомогательных учреждений Оренбургской области и проявляющие способность к образованию ключевого автоиндуктора системы «кворум сенсинга» - Ы-бутирил^-гомосерин лактона (С4-АГЛ). Установлено, что субингибиторные концентрации антибиотиков оказывают регуляторное воздействие на данную способность, имеющее различную направленность при использовании аминогликозидов (на примере канамицина сульфата) и тетрациклинов (на примере доксициклина гидрохлорида). В присутствии канамицина зарегистрировано выраженное подавление продукции С4-АГЛ, что в качестве мишени воздействия антибиотика позволяет предполагать систему биосинтеза автоиндуктора. В свою очередь эффектом доксициклина являлось накопление внеклеточного С4-АГЛ выше контрольных значений, что указывает на нарушение системы восприятия автоинду4ктора бактериальными клетками-мишенями.
Выявленная способность аминогликозидов и тетрациклинов воздействовать на систему «кворум сенсинга» позволяет говорить о данных антибиотиках как регуляторах коллективного поведения патогенных бактерий, что открывает новые возможности для их использования при лечении инфекций, вызванных P. aeruginosa.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, кворум сенсинг, ацилированные лактоны гомосе-рина, аминогликозиды, тетрациклины, субингибиторные концентрации.
Внутрибольничные (госпитальные) инфекции - актуальная проблема современного здравоохранения [1], борьба с которой требует использования сложной антибиотикотерапии [2], направленной на образующие биопленки бактериальные патогены [3], [4]. При этом частая неэффективность подобной терапии определяется тем, что антибиотик уничтожает преимущественно планктонные клетки микроорганизмов, слабо проникая вглубь матрикса биопленки, в результате чего в ней формируются только относительно низкие (субингиби-торные) концентрации препарата [5].
Среди возбудителей госпитальных инфекций ведущее значение имеют грамотри-цательные микроорганизмы, доминирующим из которых является синегнойная палочка -Pseudomonas aeruginosa [6]. Региональная актуальность данного возбудителя подтверждается его регулярным выделением при случаях внутрибольничной инфекции в медицинских
учреждениях Оренбургской области. Патогенный потенциал P aeruginosa, помимо способности к образованию биопленок [7], включает экзотокисины и разнообразные секретируемые факторы вирулентности, биосинтез которых находится под контролем трехкомпонентной системы плотностно-зависимой коммуникации, обозначаемой термином «кворум сенсинг» (англ. - Quorum Sensing; QS) [8].
Принципиальная организация систем «кворум сенсинга» заключается в образовании бактериальными клетками низкомолекулярных диффундирующих сигнальных молекул - автоиндукторов, накапливающихся в среде культивирования и при достижении высокой плотности популяции воспринимаемых специальными рецепторными белками, запускающими транскрипцию целевых генов [9], [10]. Так P. aeruginosa имеет сложную трехкомпонентную систему «кворум сенсинга» с тремя различными АИ: N-(3-
оксододеканоил)^-гомосеринлактоном, ^бутирил^-гомосеринлактоном (^-АГЛ) и 2-гептил-З-гидрокси-4-хинолоном [11]. При этом наибольшее значение в патогенезе синег-нойной инфекции имеет опосредованная C4-АГЛ система rhll-rhlR [12], под позитивным контролем которой находятся образованием биопленочного рамнолипида, пиоцианина и других факторов вирулентности.
Учитывая ключевую роль «кворум сенсин-га» P. aeruginosa и ряда других микроорганизмов в патогенезе вызываемых ими инфекционных состояний, данные системы рассматривается в качестве новой перспективной мишени, воздействие на которую позволит на новых принципах бороться с заболеваниями бактериальной этиологии [15], [16]. Отдельным направлением подобного поиска является анализ кворум-регулирующего эффекта антибиотиков, в последнее время рассматриваемых не только как факторы межмикробного антагонизма, но и как сигнальные молекулы [17], изменяющие профиль генной экспрессии воспринимающих их бактериальных клеток.
Однако, имеющиеся публикации об участии антибиотиков в регуляции систем «кворум сенсинга» относительно немногочисленны, а представленные в них данные часто противоречивы. Так, с одной стороны, имеются данные о способности цефтазидима и тобрамицина [18], а также цефтазидима, азитромицина и ципроф-локсацина [19] ингибировать эту систему у лабораторных штаммов P aeruginosa. С другой стороны, в работе Shen et al. [20] субингиби-торные концентрации азитромицина, ванкоми-
цина, тетрациклина и ампициллина, напротив, активировали экспрессию кворум-зависимых секретируемых факторов вирулентности данного микроорганизма.
В этой связи целью настоящего исследования явилось экспериментальное изучение регуляторных эффектов антибиотиков из групп аминогликозидов и тетрациклинов на систему «кворум сенсинга» у клинических изолятов P. aeruginosa, выделенных в одном из медицинских учреждений Оренбургской области, с акцентом на образование ими бутирил-L-гомосеринлактона, являющегося ключевым фактором индукции биопленкообразования и факторов вирулентности.
Материалы и методы
В работе использованы четыре штамма P aeruginosa, выделенных из трупного материала (№1), кала (№2), мочи (№3) и содержимого желудка (№4) пациентов одного из родовспомогательных учреждений Оренбургской области в ноябре 2015 г. Данные об их чувствительности к антибиотикам приведены в таблице 1.
Оценка продукции ^-АГЛ клиническими изолятами P. aeruginosa проводилась с использованием сенсорного штама Escherichia coli JLD271, pAL101; rhlR+ rhlI_luxCDABE; TetR p15A (E. coli pAL101) [21]. Его особенностью являлось наличие плазмиды pAL101, в составе которой кассета luxCDABE-генов клонирована под контролем гена rhlR, кодируемый которым рецепторный белок при взаимодействии с ^-АГЛ активирует транскрипцию генов биолюминесценции. Кроме того, для повышения
Таблица 1 - Чувствительность клинических изолятов P. aeruginosa к антибиотикам из групп аминогликозидов и тетрациклинов, определенная методом диффузии в агар и охарактеризованная диаметрами зон подавления роста тест-штаммов (мм)
' ' ———^^^ Штамм Антибиотик ■——^^ №1 №2 №3 №4
Аминогликозиды
Канамицин 0 (R) 0(R) 0(R) 0(R)
Гентамицин 0 (R) 10 (R) 0(R) 0(R)
Амикацин 22 (S) 20 (S) 21 (S) 20(S)
Тетрациклины
Тетрациклин 0 (R) 0(R) 21 (S) 15 (I)
Доксициклин 0(R) 14 (I) 18(S) 19(S)
Обозначения в скобках: Я - штамм устойчив к антибиотику, S -штамм чувствителен к антибиотику, I - штамм проявляет промежуточную чувствительность к антибиотику.
чувствительности данной репортерной системы, она клонирована в хозяйском штамме E. coli JLD271 с мутацией в гене sdiA, продукт которого также распознает АГЛ и мог бы конкурировать с rhlR за его связывание. Перед проведением исследований E.coli pAL101выращивали в течение 18-24 часов при 37 °C в LB-агаре («Sigma», США). Непосредственно перед постановкой эксперимента культуру разводили LB-бульоном и дополнительно подращивали в течение 2-3 часов до достижения оптической плотности 0,5 ед. при 450 нм.
При исследовании продукции С4-АГЛ клиническими изолятами P. aeruginosa их выращивали в LB-бульоне при 37 °С в течение 6, 12, 24 часов, центрифугировали при 13000 оборотах в течение 5 минут, отбирали супернатанты, которые тестировали на люминесцирующем штамме E. coli pAL101. Для этого в ячейки 96-луночного планшета из непрозрачного пластика (Thermo, США) вносили по 100 мкл культуры E. coli pAL10^ супернатанта P. aeruginosa. Отрицательными контролями являлись пробы сенсорного штамма с добавлением аналогичного объема LB-бульона, положительными - его смеси с химически чистым препаратом С4-АГЛ (Sigma, США) в концентрации 10-6 М. Динамическую регистрацию развития биолюминесценции в опытных и контрольных пробах
производили в термостатируемом блоке био-люминометра LM 01T («Immunotech», Чехия) в течение 60 минут. Степень индукции биолюминесценции определяли как отношение интенсивности свечения исследуемого образца на n-ой и 0-ой минутах исследования, соотнося полученные величины с аналогичными значениями в контроле. Полученные данные выражали графически в виде зависимости выраженности биолюминесценции (отн. ед) от времени инкубации (с) (рис. 1).
В качестве потенциальных регуляторов «кворум сенсинга» данных микроорганизмов использованы антибиотики из групп аминогли-козидов и тетрациклинов, основной мишенью действия которых является малая (30S) субъединица бактериальной рибосомы. В качестве модельного аминогликозидного антибиотика использовали канамицина сульфат (CAS 2538994-0), тетрациклины были представлены докси-циклина гидрохлоридом (CAS 10592-13-9).
При исследовании влияния данных антибиотиков на P aeruginosa готовили три серии двукратных разведений канамицина и докси-циклина в 2 мл LB-бульона в концентрации от 2500 мг/мл до 4,89 мг/мл, в одну из которых вносили по 20 мкл суточной культуры P aeruginosa. Вторая и третья (контрольные) серии оставалась стерильными, при этом в одну из
Рисунок 1 - Динамика биолюминесценции E. coli JLD271, pAL101; rhlR+ rh/I_luxCDABE; TetR pl5A в присутствии супернатантов P. aeruginosa (1-4), полученных после 6, 12 и 24 часов
культивирования в LB-бульоне
них дополнительно вносили химически чистый препарат С4-АГЛ в концентрации 10-6 М, а в другую - использованный для его разведения растворитель. После культивирования при 37 °С оценивали рост бактериальной культуры при 450 нм, после чего пробы центрифугировали при 13000 оборотах в течение 5 минут, а отобранные супернатанты и эквивалентные им по содержанию антибиотиков контрольные образцы тестировали в отношении E. coli pAL101 как описано выше. На основании полученных данных строили графики, характеризующие зависимости интенсивности роста P. aeruginosa (по значениям ОП450) и образования С4-АГЛ (по интенсивности биолюминесценции) от воздействующей концентрации антибиотика (рис. 2).
Результаты и обсуждение
Оценка способности P aeruginosa к продукции С4-АГЛ позволила зафиксировать ее у всех четырех исследованных клинических изолятов, одновременно продемонстрировав существование некоторых штаммовых различий (рис. 1). Так на ранних сроках инкубации (6 часов) детек-
тируемая продукция зафиксирована у штамма №1, однако в дальнейшем на 12 и 24 часах инкубации интенсивность индукции свечения E. coli pAL101 в присутствии супернатантов данного штамма не претерпевала существенных изменений. Для штаммов №2 и №4 был характерен максимум продукции С4-АГЛ на 12 часе культивирования, после чего содержание данного автоиндуктора существенно снижалось, вероятно, вследствие его восприятия и утилизации клетками P aeruginosa, достигшими плотности популяции, достаточной для развития эффекта «кворум сенсинга». Наконец, супернатант штамма №3 обуславливал примерно одинаковый уровень индукции биолюминесценции E. coli pAL101 только на 12 и 24 часе инкубации, по своей интенсивности уступающей таковым у супернатантов штаммов №2 и №4.
Таким образом, полученные результаты, принципиально подтвердив наличие у клинических изолятов P aeruginosa наличие систем «кворум сенсинга», опосредованных автоиндуктором С4-АГЛ, показали неидентичность количественных характеристик их функциони-
Рисунок 2 - Пример воздействия канамицина (А) и доксициклина (Б) на рост и образование С4-АГЛ клиническим изолятом P. aeruginosa №2: 1 - интенсивность индукции биолюминесценции при использовании супернатантов P. aeruginosa, выросшей на среде с антибиотиками; 2 - оптическая плотность культуры P. aeruginosa при росте на среде с антибиотиком
рования, что в контексте основной задачи настоящего исследования одновременно послужило обоснованием для выбора основных модельных объектов для оценки кворум-регулирующей активности антибиотиков.
Другим результатом предварительной серии экспериментов явилась констатация отсутствия искажающего действия аминоглико-зидов и тетрациклинов на результат восприятия С4-АГЛ сенсорным штаммом E. coli pAL101. Во-первых, исследованные антибиотики в использованном диапазоне концентраций самостоятельно не вызывали индукции биолюминесценции, а во-вторых, смеси антибиотиков с химически чистым С4-АГЛ существенно не изменяли характера реакции сенсорного штамма на данный препарат.
Последующее определение зависимости биолюминесцентного отклика E. coli pAL101 супернатантов P. aeruginosa, выращенных в контакте с канамицином и доксициклином, позволило констатировать различный характер воздействия данных антибиотиков на достигаемое содержание внеклеточного С4-АГЛ. Так канамицин, не проявивший выраженного ингибирующего эффекта на рост P aeruginosa, привел к полному подавлению образования автоиндуктора, с использованием E. coli pAL101 не обнаруженного ни в одном из супернатантов во всем исследованном диапазоне концентраций этого антибиотика (рис. 2А). Напротив, док-сициклин, в отношении тестированных штаммов P aeruginosa характеризуемый значением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) на уровне 39,07 мг/мл (рис. 2Б), напротив, обуславливал повышенное присутствие С4-АГЛ во всех анализируемых супернатантах, что свидетельствовало об избыточном накоплении автоиндуктора в среде культивирования.
Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что представители двух групп антибиотиков (аминогликозидов и тетрацикли-нов), имеющих одну и ту же мишень (малую 30S субъединицу бактериальной рибосомы), в экспериментальных условиях оказывают разно-
направленное воздействие на систему «кворум сенсинга» у клинических изолятов P. аeruginosa, а именно - на уровень образования ими ключевого автоиндуктора плотностно-зависимой коммуникации - С4-АГЛ. При этом в присутствии канамицина в широком диапазоне концентраций зарегистрировано выраженное подавление продукции С4-АГЛ, что в качестве мишени воздействия данного антибиотика позволяет предполагать систему биосинтеза автоиндуктора. В свою очередь эффектом доксициклина оказалось накопление внеклеточного С4-АГЛ выше контрольных значений, что может указывать на то, что биологическая активность данного антибиотика реализуется через нарушение системы восприятия автоиндуктора бактериальными клетками-мишенями.
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии у антибиотиков ранее неизвестного механизма биологической активности, заключающегося в модуляции (ослаблении или усилении) биосинтеза автоиндукторов системы «кворум сенсинга». В частности, у взятых в настоящее исследование антибиотиков этот эффект может быть связан с преимущественным эффектом их субингибиторных концентраций на трансляцию определенных групп белков: синтез автоиндуктора (при использовании аминогликозидов) или воспринимающих их рецепторов (при использовании тетрациклинов). В свою очередь практически ориентированный аспект полученного результата определяется обоснованием нового подхода к отбору антимикробных препаратов для терапии бактериальных инфекций, возбудители которых используют системы плотностно-зависимой коммуникации при образовании биопленок и экспрессии факторов вирулентности. В подобном контексте обнаружение у амино-гликозидов (на примере канамицина) способности к выраженной репрессии ключевого автоиндуктора P. аeruginosa - С4-АГЛ определяет перспективу их использования в качестве блокаторов системы «кворум сенсинга» патогенных бактерий.
08.09.2016
Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта РФФИ №16-44-560692 р_а.
Список литературы:
1. Покровский, В.И. Внутрибольничные инфекции: проблемы и пути решения / В.И. Покровский, Н.А. Семина // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2000. - №5. - С. 12-14.
2. Внутрибольничные инфекции: новые горизонты профилактики / В.И. Покровский и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2011. - №1. - С. 4-7.
3. Николаев, Ю.А. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология. - 2007. - Т. 76(2). - С. 149-163.
4. Kiivet, R.A. Changes in the use of antibacterial drugs in the countries of Central and Eastern Europe / R.A. Kiivet et al. // Eur J Clin Pharmacol. - 1995. - V. 48. - P. 299-304.
5. Гостев, В.В. Бактериальные биопленки и инфекции / В.В. Гостев, С. В. Сидоренко // Журнал инфектологии. - 2010. - №3. -С. 4-14.
6. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорези-стентности / С.В. Сидоренко и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - №3. - С. 25-34.
7. Spoering, A.L. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials / A.L. Spoering, K. Lewis // Journal of Bacteriology - 2001. - V. 183. - №23. - P 6746-51. doi:10.1128/JB.183.23.6746-6751.2001.
8. Smith, R.S. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target / R.S. Smith, B.H. Iglewski // The Journal of Clinical Investigation. - 2003. -V. 112. - P. 1460-1465. doi:10.1172/JCI200320364.
9. Waters, C.M. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria / C.M. Waters, B.L. Bassler // Ann Rev Cell Dev Biol. - 2005. -V. 21. - P. 319-346.
10. Reading, N.C. Quorum sensing: the many languages of bacteria / N.C. Reading, V. Sperandio // FEMS Microbiol Lett. - 2006. -V. 254. - P. 1-11.
11. Pearson, J.P. Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes / J.P. Pearson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - V. 91. - P. 197-201.
12. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa / J.P. Pearson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. - V. 92. - P. 1490-1494.
13. Chan, K-G Inhibiting N-acyl-homoserine lactone synthesis and quenching Pseudomonas quinolone quorum sensing to attenuate virulence / K-G Chan, Y-C Liu, C-Y Chang. // Front Microbiol. - 2015. - V. 6. - 1173 p. - doi: 10.3389/fmicb.2015.0117.
14. Favre-Bonte, S. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa: role of the C4-HSL cell-to-cell signal and inhibition by azithromycin / Favre-Bonte S., Köhler T., Van Delden C.J. // Antimicrob Chemother. - 2003. - V. 52(4). - P. 598-604.
15. Bhardwaj, A.K. Bacterial quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance / A.K. Bhardwaj, K. Vinothkumar, N. Rajpara // Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery - 2013. - V. 8. -P. 68-83.
16. Quorum sensing in gram-negative bacteria: small-molecule modulation of AHL and AI-2 Quorum sensing pathways / W.R.J.D. Galloway et al. // Chem. Rev. - 2011. - V. 111. - P. 28-67.
17. Булгакова, В.Г. Действие антибиотиков как сигнальных молекул / В.Г. Булгаковаи др. // Антибиотики и химиотерапия. -2014. - №1. - С. 36-43.
18. Sub-inhibitory concentrations of ceftazidime and tobramycin reduce the quorum sensing signals of Pseudomonas aeruginosa / L.A. Garske et al. // Pathology. - 2004. -V. 36. - P. 571-575.
19. Effects of antibiotics on quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / M.E. Skindersoe et al. // Antimicrob. Agents Chemother. -2008. - V. 52. - P. 3648-3663.
20. Modulation of secreted virulence factor genes by subinhibitory concentrations of antibiotics in Pseudomonas aeruginosa / L. Shen et al. // J. Microbiol. - 2008. - V. 46. - P. 441-447.
21. Lindsay, A. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones / A. Lindsay, B.M. Ahmer // J.Bacteriol. - 2005. - V. 187(14). -P. 5054-5058.
Сведения об авторах: Инчагова Ксения Сергеевна, аспирант кафедры биохимии и микробиологии
Оренбургского государственного университета, научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института мясного скотоводства 460018, г. Оренбург, пр-т Победы, 13, ауд. 2308, e-mail: ksenia.inchagova@mail.ru
Галаджиева Анна Александровна, научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института мясного скотоводства, научный сотрудник Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук, кандидат биологических наук 460022, г Оренбург, ул. Подурова, д 8/1, e-mail: аnnatolmacheva56@gmail.com
