CC BY
308
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.841.11:546.215].083.3
В.А. Плюта1'2, Ю.В. Андреенко2, А.Е. Кузнецов2, И.А. Хмель1
ОБРАзОВАНИЕ БИОПЛЕНОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA РАО1 В ПРИСУТСТВИИ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА; ВЛИЯНИЕ ГЕНА AIIA
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, 123182; 2Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева,
Москва, 125047
Большинство бактерий существуют в природных экосистемах в виде специфически организованных, прикрепленных к различным поверхностям биопленок; биопленки имеют сложную архитектуру и окружены экзополимерным матриксом. Бактерии, живущие внутри биопленок, проявляют значительно более высокую устойчивость к действию антибактериальных факторов. Способность патогенных бактерий формировать биопленки вызывает серьезные проблемы в медицине. Поэтому изучение действия на образование биопленок различных соединений с антибактериальной активностью представляет большой интерес. В настоящей работе мы исследовали влияние перекиси водорода на образование биопленок Pseudomonas aeruginosa PAO1. Показано, что Н2О2 в субингибиторных и/или слабо подавляющих рост бактерий концентрациях оказывает стимулирующее действие на формирование биопленок. При более высоких концентрациях Н2О2 вызывает ингибирование образования биопленок. Для того чтобы выяснить, зависит ли стимуляция формирования биопленок от Quorum Sensing (QS) регуляции, в клетки P. aeruginosa PAO1 была введена плазмида pME6863, содержащая гетерологичный ген aiiA, кодирующий N-ацил-гомосерин лактоназу AiiA. Синтез клетками данного фермента, деградирующего N-ацил-гомосерин лактоны (АГЛ) — сигнальные молекулы QS систем, приводил к отсутствию стимуляции образования биопленок при действии Н2О2. Это показывает, что стимуляция формирования биопленок в присутствии Н2О2 зависит от функционирования QS систем регуляции экспрессии генов P. aeruginosa PAO1.
Ключевые слова: биопленки; перекись водорода; Pseudomonas aeruginosa
Большинство бактерий существуют в природных условиях (в почве, воде, ризосфере растений, в организмах животных и человека) в виде сложно организованных сообществ, прикрепленных к различным поверхностям, — биопленок. Биопленки могут содержать популяции, образованные из одного вида, или сообщества, развивающиеся из многих видов микробов. Биопленки имеют сложную архитектуру: они заключены в экзополимерный матрикс, содержат каналы, наполненные жидкостью, через которые происходят приток питательных веществ и выведение продуктов метаболизма бактерий. Основным компонентом матрикса являются экзополисахариды; матрикс содержит также белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества; состав матрикса различен у бактерий разных таксономических групп [2, 7, 8]. Изучение биопленок вызывает огромный интерес в последние годы. Их исследование важно, главным образом, потому, что способность бактерий существовать в составе биопленок создает серьезные трудности в медицинской практике. Бактерии, живущие внутри биопленок, проявляют значительно более высокую устойчивость к действию антибактериальных факторов, включая антибиотики и др. Патогенные бактерии
могут образовывать биопленки на различных устройствах, применяемых в медицине, например, катетерах, линзах, клапанах сердца и сосудов, что приводит к возникновению трудно излечиваемых хронических инфекций [2, 4, 7, 8, 15]. Поэтому поиск и изучение веществ, которые могут подавлять образование биопленок, являются чрезвычайно важной задачей.
О генетическом контроле образования биопленок бактериями известно недостаточно, этот вопрос в настоящее время активно изучается. Существенную роль в регуляции формирования биопленок различными бактериями играют Quorum Sensing системы регуляции экспрессии генов [4, 8, 9]. Этот тип регуляции включает низкомолекулярные сигнальные молекулы; наиболее изученными из них являются N-ацил-гомосерин лактоны (АГЛ). QS-системы участвуют в регуляции многих клеточных процессов бактерий, в том числе, в контроле синтеза вторичных метаболитов, вирулентности бактерий и др. [3, 23, 32]. Ингибиторы QS могут иметь фармацевтическое значение, на их основе разрабатываются лекарственные средства, направленные против патогенности бактерий [4].
Большой интерес в этой связи вызывают ферменты, разрушающие АГЛ — N-ацил-гомосерин лактоназы (АГ-лактоназы) и ацилазы [11, 12, 18, 19]. АГ-лактоназы были впервые обнаружены у бацилл. Лактоназа AiiA расщепляет лактонное кольцо, инактивируя АГЛ [11, 12]. Были получены данные о том, что введение в клетки бактерий плазмид, несущих клонированные гены АГ-лактоназ, приводило к деградации АГЛ и изменению экспрессии генов, в регуляции которых участвуют QS-системы. Например, введение плаз-миды pME6863, содержащей клонированный ген лактоназы aiiA, сильно уменьшало содержание в клетках P. aeruginosa PAO1 АГЛ и продукцию некоторых факторов вирулентности (эластазы, рам-нолипидов, пиоцианина, цианида) [25]. Подобный подход представляется весьма перспективным для изучения регуляторной роли QS-систем, однако он был использован только для нескольких бактерий. Многие вопросы, связанные с действием АГ лакто-наз в клетках, остаются недостаточно изученными, в частности, действие на образование биопленок.
Использование генов, кодирующих ферменты деградации АГЛ, представляется особенно целесообразным в случаях, когда бактерия синтезирует несколько АГЛ и содержит более чем одну систему QS-регуляции, так как различные АГЛ могут ча-
Таблица 1 Штаммы и плазмиды, использованные в работе
ОП595
1,6-,
Штаммы бактерий
Характеристика штаммов
Источник
Pseudomonas aeruginosa PAO1
Chromobacterium violaceum (CV026)
Agrobacterium tumefaciens NT1/ pZLR4
E. coli Sl7-l(X-pn-)
E. coli S17-1/ pME6863
E. coli S17-1/ pME6000
P. aeruginosa PAO 1 / pME6863
P. aeruginosa PAO 1 / pME6000
pME6000
pME6863
Прототроф.
Биосенсор для определения АГЛ. Продукция виолацеина. Smr mini-Tn5 Hg cviI::Tn5xy\EKm
Биосенсор для определения АГЛ. Gmr Cbr
thi pro hsdR hsdM recA rpsL RP4-2 (Tcr::MuJ Kmr::Tn7 (X-pir)
S17-1(X-pir), несет плазмиду pME6863, содержащую клонированный ген aiiA, Tcr
S17-1 (X-pir), содержит векторную плазмиду pME6000, Tcr
P. aeruginosa PAO1, содержит плазмиду pME6863, ген aiiA, Tcr
P. aeruginosa PAO1, содержит векторную плазмиду pME6000, Tcr
Вектор для клонирования,
Tcr
pME6000, несущая ген aiiA , Tcr
Коллекция Института молекулярной генетики РАН
[22]
[6]
Чернин Л.С. (Израиль)
[l] [l]
Данная работа
Данная работа
[25] [25]
стично заменять друг друга при взаимодеиствии с рецепторными белками.
В данноИ работе мы исследовали влияние перекиси водорода (НО) на образование биопленок P. aeruginosa PAO1. Бактерия P. aeruginosa широко известна как оппортунистический патоген человека, вызывающий внутрибольничные и легочные инфекции, особенно у пациентов с нарушенным иммунитетом и кистозным фиброзом. Кроме того, штаммы P. aeruginosa широко распространены в почве и водной среде, способны колонизовать корни растений, образовывать на них биопленки и вызывать гибель растений [31].
В настоящей работе было впервые показано, что Н2О2 в субингибиторных концентрациях и/или концентрациях, слабо подавляющих рост бактерий, оказывает стимулирующее действие на формирование биопленок P. aeruginosa PAO1, но при этом не стимулирует образование биопленок бактериями P. aeruginosa PAO1 с плазмидой pME6863, содержащей клонированный гетерологичный ген АГ-лактоназы (aiiA). Полученные данные показывают, что стимулирование образования биопленок в присутствии Н2О2 зависит от QS-регуляции.
Материалы и методы
Бактерии, условия выращивания
Штаммы бактерий, использованные и полученные в работе, приведены в табл. 1. Бактерии выращивали на жидкой среде LB (г/л):
150 300 750 1500 Перекись водорода, мкг/мл
3000
Рис. 1. Влияние перекиси водорода на образование биопленок и планктонный рост P. aeruginosa PAO1. По оси абсцис — концентрация перекиси водорода, мкг/мл. По осям ординат: слева — ОП595, справа — отношение биомасс, биопленочных и планктонных бактерий (бп/пр). Биопленки — темные столбцы, планктонный рост — светлые столбцы. Кривая показывает отношение биомассы биопленок к планктонному росту (БП/ПР).
Bacto T^ptone ("Pronadisa", Hispanlab, S.A., Madrid, Spain) — 10; Yeast Extract ("Pronadisa", Hispanlab, S.A., Madrid, Spain) — 5; NaCl
— 10, или на LA (1,5% агара, Difco) при 30°C и перемешивании. Перекись водорода (ЭКОлаб) растворяли в дистиллированной воде до необходимой концентрации. Антибиотики добавляли в среду в следующих концентрациях: ампициллин — 100 и 200 мкг/мл (ОАО "Биохимик", Россия); тетрациклина гидрохлорид — 20 и 200 мкг/мл ("AppliChem", Германия), гентамицин — 40 мкг/мл (КРКА, Словения); канамицин 100 мкг/мл (ОАО "Синтез", Россия).
Перенос плазмидpME6000 и pME6863 в клетки P. aeruginosa PAO1 выполняли по методу [25] с небольшими модификациями. Плазмиды передавали из E. coli S17-1 конъюгацией в P. aeruginosa PAO1 с селекцией на среде LA с тетрациклина гидрохлоридом и ампициллином. Присутствие гена aiiA в штамме PAO 1, несущем плазмиду pME6863, было подтверждено с помощью ПЦР, с использованием специфических праймеров для этого гена (подобраны по последовательности гена aiiA, AF397400): AIIA-F 5'-TTCGTCCCAGCAGGTCGTT и AIIA-R 5'- GATGCCCTGGAGTATGGCCT. Режим ПЦР: 94°C — 3 мин, 62°C — 2 мин, 72°C — 2 мин, затем 30 циклов 94°C — 10 с, 62°C
— 10 с, 72°C — 20 с, после чего 72°C — 5 мин.
Определение продукции АГЛ
Для определения продукции АГЛ использовали два биосенсора. Первый сенсор Chromobacterium violaceum CV026 высевали штрихами на поверхность среды LA, пересекали их штрихами тестируемых культур, инкубировали 24—48 ч при 30°C. В случае, когда штамм продуцировал АГЛ, наблюдали окрашивание индикаторного штамма (CV026) в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски оценивали визуально [6, 22].
Второй биосенсор Agrobacterium tumefaciens NTl/pZLR4 выращивали на среде LB с добавлением гентамицина в течение ночи при 30°С. Чашку с агаризованной средой М9 с добавленным X-Gal (конечная концентрация 80 мкг/мл) заливали 3,5 мл M9 c 0,5% агара с добавлением 0,1 мл ночной культуры A. tumefaciens NTl/pZLR4. Тестируемые на продукцию АГЛ штаммы высевали уколами на поверхность агаризованной среды после ее застывания или добавляли жидкую ночную культуру в лунки в агаризованной среде, инкубировали при 30°С 24—48 ч. О синтезе АГЛ судили по появлению голубых зон гидролиза X Gal [27].
Анализ биопленок
Образование биопленок исследуемых штаммов было проанализировано, как описано в [35] с небольшими изменениями.
Свежую культуру, выросшую на чашках со средой LA, высевали в LB и инкубировали на качалке в течение 24 ч при температуре 30°C. Затем культуры разбавлялись в 100—300 раз в LB. Для измерения образования биопленок культуры выращивали в полистироловых планшетах
ОП595 БП/ПР
Рис. 2. Влияние перекиси водорода на образование биопленок и планктонный рост P. aeruginosa PAO1 pME6000.
Обозначения те же, что на рис. 1.
(ОАО "МЕДПОЛИМЕР", Санкт-Петербург, Россия). В лунки вносили 135 мкл культуры и 15 мкл водного раствора перекиси водорода, в контроле — 15 мкл воды. Клетки выращивали 24 ч со слабым перемешиванием на качалке (—105 об./мин) при температуре 30°C, после чего определяли рост планктонных, т.е. неприкрепленных клеток (OH595). Образование биопленок измеряли после удаления среды, промывки ячеек водой (3 раза) и окрашивания прикрепленных клеток красителем (1% кристаллический фиолетовый, "Реахим", Россия). После окрашивания в течение 45 мин при 24°С жидкость сливали, краситель из биопленок экстрагировали 96% этанолом, оптическую плотность раствора измеряли при 595 нм. Для измерения планктонных клеток и биопленок использовали iMark Microplate Reader ("Bio-Rad", США). Продолжительность роста клеток в течение 24 ч была оптимальной для формирования биопленок; после этого времени уровень образования биопленок не изменялся или даже несколько уменьшался. В каждом эксперименте было по 4—S лунок с исследуемыми штаммами, эксперименты повторяли 3—4 раза. Изучая под микроскопом клеточную суспензию из лунок, не наблюдали образования клеточных агрегатов. Биопленки формировались на стенках лунок на границе питательной среды и воздуха, но не на дне лунок и не на поверхности среды в лунках.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 приведены данные типичного опыта по влиянию Н2О2 на формирование биопленок у P. aeruginosa PAO 1. Можно видеть, что в диапазоне увеличения концентрации Н2О от 300 до 1500 мкг/ мл происходила стимуляция образования биопленок до 3,5 раз (при 1500 мкг/мл) по сравнению с контролем (без Н2О2). При этом величина планктонного роста не изменялась до 750 мкг/мл Н2О2 и уменьшалась приблизительно в 2 раза при 1500 мкг/мл Н2О2. При дальнейшем повышении концентрации Н2О2 биомассы образованных биопленок и планктонных клеток резко снижались.
Известно, что в регуляции формирования биопленок P. aeruginosa участвуют QS-системы, они необходимы для формирования зрелых, дифференцированных биопленок [S, 9]. Поэтому представляло интерес проверить, зависит ли эффект стимуляции образования биопленок при действии Н О от QS-систем этой бактерии, использующих АГЛ в качестве сигнальных молекул. Штаммы P. aeruginosa (включая штамм PAO1) имеют две QS-системы, функционирующие с участием АГЛ - LasI/LasR и RhlI/RhlR, гомологи классической LuxI/LuxR системы Vibrio fischeri. LasI и RhlI син-тазы катализируют синтез ^3-оксо-додеканоил^-
ОП595 БП/П
Перекись водорода, мкг/мл
Рис. 3. Влияние перекиси водорода на образование биопленок и планктонный рост P. aeruginosa PAO1 pME6863.
Обозначения те же, что на рис. 1.
гомосерин лактона (3-оксо-02-ГЛ) и N-бутаноил-L-гомосерин лактона (С4-ГЛ), соответственно. Показано, что до 11% генома P. aeruginosa регулируются с участием АГЛ-зависимых систем [26, 30, 34]. Кроме того, штаммы P. aeruginosa синтезируют третью сигнальную молекулу, 2-гептил-3-гидрокси-4-хинолон (PQS) [24], которая участвует в контроле ряда свойств P. aeruginosa. Функционирование этих регуляторных систем взаимосвязано; все они принимают участие в регуляции формирования биопленок P. aeruginosa [9, 10].
Чтобы определить роль QS-систем в регуляции стимулирования образования биопленок при действии субингибиторных и/или слабо подавляющих рост концентраций Н2О2, мы исследовали влияние введения гетерологичного гена АГ-лактоназы aiiA в клетки P. aeruginosa PAO1 на образование биопленок при действии Н2О2. В клетки P. aeruginosa PAO1 были введены конъюгацией плазмиды pME6863 (несет ген aiiA) и векторная плазмида pME6000, в которой был клонирован ген aiiA. Селекцию трансконъюгантов проводили на среде с ампициллином и 200 мкг/мл тетрациклина гидрохлорида (такая высокая концентрация этого антибиотика была использована потому, что клетки PAO1 исходно были устойчивыми к тетрациклина гидрохлориду). Присутствие гена aiiA в клетках было подтверждено ПЦР.
Полученные штаммы с соответствующими плазмидами были проверены на синтез АГЛ. При анализе на чашках с биосенсором C. violaceum CV026 клетки, несущие плазмиду pME6863, не обнаруживали синтеза АГЛ, в то время как клетки с векторной плазмидой pME6000 его активно синтезировали. Эти данные показывают, что экспрессия гена гомосеринлактоназы приводила к отсутствию в клетках С4-ГЛ. При использовании сенсора A. tumefaciens NT1/pZLR4 в случае клеток с плазмидой pME6863 мы наблюдали небольшую продукцию АГЛ, т.е. некоторое количество основной сигнальной молекулы ^-системы P. aeruginosa PAO1 3-оксо-С12-ГЛ в культуре присутствовало. Такие же результаты были получены ранее в работе [25].
Эксперименты по изучению действия Н2О2 на
штаммы P. aeruginosa PAO1 с указанными плаз-мидами проводились на среде LB без тетрациклина гидрохлорида, т.е. в тех же условиях, что и для исходного штамма PAO1. Предварительно было проверено, что плазмиды pME6863 и pME6000 стабильно сохранялись в клетках на этой среде, по крайней мере, в течение двух суток роста.
При действии Н2О на образование биопленок P. aeruginosa PAO1 pME6000 наблюдалась та же закономерность, что и в случае штамма P. aeruginosa PAO1, т.е. формирование биопленок стимулировалось в условиях, когда происходило некоторое снижение планктонного роста по сравнению с контролем (до 2,3 раза) (рис. 2). Однако, когда было исследовано действие Н2О2 на образование биопленок штаммом, содержащим плазмиду pME6863, мы не наблюдали этого эффекта (рис. 3). Эти данные показывают, что эффект стимуляции формирования биопленок при действии концентраций Н2О2, слабо влияющих на планктонный рост, зависит от функционирования QS-систем PAO1, использующих АГЛ. Следует отметить при этом, что в случае штаммов P. aeruginosa, содержащих и не содержащих ген aiiA, отношение биомассы образованных биопленок к планктонному росту увеличивалось в интервале от 250 до 750 и от 125 до 375-500 мкг/ мл Н2О2 соответственно, т.е. процесс образования биопленок был менее чувствителен к действию Н2О2, чем планктонный рост, в обоих штаммах.
Неожиданным для нас было наблюдение, что штамм P. aeruginosa PAO1 pME6863, в котором было подавлено функционирование LasIR и RhIIR QS-систем вследствие деградации АГЛ АГ-лактоназой, демонстрировал увеличение уровня биопленок в контроле без Н2О2 по сравнению с уровнем биопленок в изогенном штамме, несущем векторную плазмиду pME6000. В 7 из 8 проведенных экспериментов, в которых сравнение биопленок в этих штаммах проводилось в одном и том же опыте, это увеличение варьировало от 1,5 до 3 раз (рис. 4). В одном опыте уровень биопленок в этих двух штаммах был практически одинаковым. В настоящее время мы не можем объяснить, почему снижение содержания АГЛ в культуре не вызывало снижения формирования биопленок, что казалось логичным. Было отмечено, что взаимоотношения QS-систем LasIR и RhIIR могут быть сложными [8]. Не исключено, что отсутствие С4-ГЛ при наличии некоторого количества не деградировавшего полностью 3-оксо-С12-ГЛ приводит к отсутствию репрессивного действия RhlIR системы на какой-то из многих процессов, ведущих к формированию биопленок. В работе [25] было показано, что введение в клетки P. aeruginosa PAO1 плазмиды, содержащей клонированный ген aiiA, не влияло на адгезию клеток к абиотической (поливинилхло-рид) поверхности, которая является первым этапом образования биопленок. Таким образом, согласно нашим данным, стимуляция образования биопленок P. aeruginosa PAO1 наблюдалась только при действии Н2О2 и функционировании QS, но не в условиях подавления QS-регуляции.
Каков же механизм стимулирующего действия концентраций Н2О2, слабо подавляющих рост бак-
ОП595
2,6-
2,4-
2,2-
2
1,8-
1,6-
1,4-
1,2- гЬ
1-
0,8-
0,6-
0,4-
0,2-
0н
fil
nh
Ш
Г*1
г1~1
ш
2 3 4 5 6 7 8 Номер эксперимента
Рис. 4. Сравнение уровней образования биопленок P. aeruginosa PAO1 pME6863 (светлые столбцы) и P. aeruginosa PAO1 pME6000 (темные столбцы).
По оси абсцисс — номера экспериментов, по оси ординат — ОП595.
терий, на формирование биопленок? Как известно, действие Н2О2 на клетки вызывает окислительный стресс, в результате которого повреждается целый ряд клеточных компонентов — липиды мембран, белки, нуклеиновые кислоты. При оксидативном стрессе индуцируется синтез большого количества белков, обеспечивающих защиту клеток, таких как каталазы, алкил-гидропероксид редуктазы, супероксиддисмутазы. Основным регулятором, осуществляющим глобальную регуляцию ответа на окислительный стресс, является OxyR; недавно было показано, что его мишени включают до 56 генов [17, 28, 33]. Биопленки более устойчивы к действию перекиси водорода [5, 13, 14], и могут защищать бактерии от ее воздействия. Поэтому среди белков, индуцируемых в ответ на окислительный стресс, могут быть те, которые участвуют в образовании биопленок.
Показано, что при окислительном стрессе OxyR требуется для регуляции миграции клеток по поверхности среды (swarming, сворминг), которая способствует образованию биопленок, и участвует в регуляции синтеза рамнолипидов, необходимых для формирования биопленок P. aeruginosa [29]. Действие на биопленки PAO1 Н2О2 приводило к появлению мукоидных вариантов, которые продуцируют в 2—6 раз больше альгината (альгинат входит в состав матрикса биопленок) [21]. Т.е. стимуляция образования биопленок в присутствии Н2О2 — это механизм защиты бактерий от ее действия.
При формировании биопленок при действии Н2О2 важна QS-регуляция: было показано, что устойчивость к Н2О2 P. aeruginosa в биопленках зависит от QS [5]. Если QS блокирован мутациями в генах QS-систем или ингибиторами QS, устойчивость биопленок к Н2О2 снижается (как и планктонных клеток). QS позитивно регулирует экспрессию многих факторов, участвующих в образовании биопленок: синтез полисахаридов (экспрессия pel оперона), синтез альгината, внеклеточной ДНК (компонент матрикса биопленок), рамнолипидов [9].
Таким образом, приведенные данные показывают, почему может происходить стимуляция формирования биопленок в присутствии Н2О2 и почему она зависит от QS. Эти данные, по-видимому, не исчерпывают всех механизмов влияния Н2О2 на образование биопленок. Необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения этого вопроса.
Стимуляция формирования биопленок при су-бингибиторных концентрациях антибактериальных агентов была показана ранее для некоторых антибиотиков, например, аминогликозидов, тетрациклина [16, 20]. В наших работах было обнаружено, что увеличение формирования биопленок P. aeruginosa PAO1 происходит в присутствии в среде субинги-биторных концентраций лекарственных препаратов нитрофурановой природы [35] и фенольных соединений растительного происхождения, которые входят в состав фитопрепаратов. В последнем случае было показано, что стимуляция формирования биопленок происходит параллельно увеличению синтеза АГЛ. Данные о стимуляции образования биопленок при действии антибактериальных агентов важны для медицины: стимуляция формирования биопленок патогенными бактериями может способствовать их выживанию после лечения с применением антибактериальных средств, когда низкие концентрации этих препаратов остаются в организме человека.
Работа частично финансировалась Госконтрактом Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 8307).
Сведения об авторах:
Плюта Владимир Александрович — аспирант РХТУ им. Д.И. Менделеева; e-mail: [email protected];
Андреенко Юлия Вячеславовна — студентка РХТУ им. Д.И. Менделеева;
Кузнецов Александр Евгеньевич — канд. техн. наук, доцент, зам. зав. кафедрой биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева; e-mail: [email protected];
Хмель Инесса Александровна — д-р биол. наук, зав. лаб. регуляции экспрессии генов микроорганизмов ФБУН ИМГ РАН; e-mail: [email protected].
ЛИТЕРАТУРА
1. Липасова В.А., Атамова Э.Э., Веселова М.А., Тарасова Н.Н., ХмельИ.А. Генетика. 2009; 45(1): 38—42.
2. Смирнова Т. А., Диденко Л. В., Азизбекян Р. Р., РомановаЮ. М. Микробиология. 2010; 79(4): 435—46.
3. ХмельИ.А. Микробиология. 2006; 75: 457—64.
4. Хмель И.А., Метлицкая А.З. Молекулярная биология. 2006; 40: 195—210.
5. Bjarnsholt T., Jensen P.0., Burm0lle M. et al. Microbiology. 2005; 151: 373—83.
6. Cha C, GaoP., Chen Y.C. et al. Mol. Plant-Microbe Interact. 1998; 11: 1119—29.
7. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Science. 1999; 284: 1318—22.
8. DaviesD.G., ParsekM.R., Pearson J.P. et al. Science. 1998; 280: 295—8.
9. De Kievit T.R. Environ Microbiol. 2009; 11: 279—88.
10. Diggle S.P., Cornelis P., Williams P. et al. Int. J. Med. Microbiol. 2006; 296: 83—91.
11. Dong Y, Wang L, Xu J. et al. Nature. 2001; 411: 813—7.
12. Dong Y., Xu J., Li X. Zhang L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 3526—31.
13. Elkins J.G., Hassett D.J., Stewart P.S., et al. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 4594—600.
14. Hassett D.J., Elkins J.G., Ma J.F., McDermott T.R. Methods Enzymol. 1999; 310: 599—608.
15. HentzerM., GivskovM. J. Clin. Invest. 2003; 112: 1300—7.
16. Hoffman L.R., D'Argenio D.A., MacCoss M.J. et al. Nature. 2005; 436: 1171—5.
17. Imlay J.A. Annu. Rev. Biochem. 2008; 77: 755—76.
18. Leadbetter J., GreenbergE. J. Bacteriol. 2000; 182: 6921—6.
19. Lin Y, Xu J., Hu J. et al. Mol. Microbiol. 2003; 47: 849—60.
20. Linares J.F., Gustaffson I., Baquero F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 19484—9.
21. Mathee K, Ciofu O, Sternberg C. et al. Microbiology. 1999; 145: 1349—57.
22. McCleanK.H., WinsonM.K., FishL. et al. Microbiology. 1997; 143: 3703—11.
23. MillerM.B., BasslerB.L. Annu. Rev. Microbiol. 2001; 55: 165—99.
24. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 11229—34.
25. Reimmann C., Ginet N., Michel L. et al. Microbiology. 2002; 148: 923—32.
26. Schuster M., Lostroh C.P, Ogi T., Greenberg E.P. J. Bacteriol. 2003; 185: 2066—79.
27. Shaw P.D., Ping G., Daly S.L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94; 6036—41.
28. Storz G, Imlay J.A. Curr. Opin. Microbiol. 1999; 2: 188—94.
29. Vinckx T, Wei Q., Matthijs S, Cornelis P. Microbiology. 2010; 156: 678—86.
30. Wagner V.E., BushnellD., PassadorL. et al. J. Bacteriol. 2003; 185: 2080—95.
31. Walker T.S., Bais H.P., Deziel E. et al. Plant Physiol. 2004; 134: 320—31.
32. Waters C., BasslerB. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2005; 21: 319— 46.
33. Wei Q., Minh P.N., Dotsch A., et al. Nucl. Acids Res. 2012; 40: 4320—33.
34. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 13904—9.
35. Zaitseva J., Granik V., Belik A., Koksharova O., Khmel I. Res. Microbiol. 2009; 160: 353—7.
nocTynuna 09.04.13
FORMATION OF THE PSEUDOMONAS AERUGINOSA PA01 BIOFILMS IN THE PRESENCE OF HYDROGEN PEROXIDE; THE EFFECT OF THE AIIA GENE
V. A. Plyuta12, J. V Andreenko2, A. E. Kuznetsov2, and I. A. Khmel',*
'Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 2Mendeleev Russian University of Chemistry and Technology, Moscow, Russia
In the natural ecosystems, most bacteria exist as specifically organized biofilms attached to various surfaces; the biofilms have a complex architecture and are surrounded by an exopolymeric matrix. The bacteria in the biofilms are extremely resistant to antibacterial agents. The ability of the pathogenic bacteria to produce biofilms causes serious problems in medicine. Therefore, the study of the action of different compounds with antibacterial activity is of great interest. In this work, we studied the effect of the hydrogen peroxide (H202) on the formation of biofilms by Pseudomonas aeruginosa PAO1. It was shown that H202 in concentrations that do not suppress bacterial growth (or suppress it only weakly) stimulates the formation of the biofilms. At higher concentrations, H202 inhibits the formation of the biofilms. In order to determine if the stimulation of the biofilm formation depends on Quorum Sensing (QS) regulation, the plasmid pME6863 containing the heterologous gene aiiA encoding the N-acyl-homoserine lactonase AiiA was introduced into P. aeruginosa PAO1. The synthesis by cells of this enzyme degrading N-acyl-homoserine lactones (AHL), signaling molecules of the QS systems, led to the absence of the stimulation of the biofilm formation by the action of H202. This fact indicates that the stimulation of the biofilm formation in the presence of H202 depends on the functioning of the QS systems of the gene expression regulation of P. aeruginosa PAO1. Key words: biofilms, hydrogen peroxide, Pseudomonas aeruginosa
