CC BY
81
INJ]
М1ЖНАРОДНИЙ НЕВРОЛОГ1ЧНИЙ ЖУРНАЛ
INTERNATIONAL NEUROLOGICAL JOURNAL 1
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ ОРИГШАЛЬШ ДОСЛЩЖЕННЯ /ORIGINAL RESEARCHES/
УДК 616.833.58-089:615.84:616-073.97-092.9 DOI: 10.22141/2224-0713.1.95.2018.127407
Цимбалюк В.1.1, neTpiB Т.1.2, Васильев Р.Г.3-4, Медведев В.В.1, Молотковець ВЮ.1, Татарчук М.М.2, Драгунцова Н.Г.2
1Нац1ональний медичний ун1верситет ¡мен1 акад. О.О. Богомольця, м. Ки!в, Укра!на 2ДУ «1нститутнейроюрурп! 1м. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украми», м. Ки!в, Укра!на 3ДУ «1нститут генетично! та регенеративноÏ медицини НАМН Укра!ни», м. Ки!в, Укра!на 4Б1отехнолопчна лабораторя ilaya.regeneration, медична компан1я ilayaм. Ки!в, Укра!на
Вшновлення функцп адничного нерва з використанням 3aco6iB тканинно!' шженерп шсля його повного перетину в експеримент
Резюме. Актуальтсть. Частота травми периферйних Hepeie становить 0,3—0,5 на 10 000 населения, 60—75 %зякихсупроводжуються iнвалiдизацieюхворого. Найперспективншим шляхом виршення проблеми вiдновлeння периферичних нepвiв e тканинна тженергя з використанням бiоnолiмepiв i стовбурових клтин, зокремамультипотентних стовбурових клiтин-похiднихнервового гребеня (МСК-ПНГ). Мета: до^дити вiдновлeння функцп'Адничного нерва з використанням засобiв тканинно'1 тженерп тсля його повного перетину в eкспepимeнтi. MamepiaAU та методи. Сформовано 4 експериментальт групи: група 1 — перетин Адничного нерва (невротом1я) та негайна автонейропластика (n = 14); група 2 — невротомгя та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фiбpиновим гелем (n = 15); група 3 — невротом1я та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фiбpиновим гелем з вмктом МСК-ПНГ (n = 16); група 4 — не-справжньоопероват тварини (n = 7). Результати. У групах 1 i 3 спостеркали динамк SFI, що характе-ризувалася двофазшстю. Перша фаза включала практично лттне зростання показника вiд значення у —70 на 7-му добу спостереження до —35 станом на ктець 4-го тижня спостереження. Друга фаза тривала протягом 6-7-го та 5-7-го тижня у грут 1 та 3 вiдповiдно iхарактеризувалася вiдсутнiстю змт показника. Для групи 2характерним була наявшсть фази вiдсутностi приросту показника протягом 2-го тижня спостереження. У подальшому, протягом 3-4-го тижня виявляли вipогiднeзбльшення показника (р < 0,01; W-критерш Улкоксона), стабшзацт (протягом 5-6-го тижня), вipогiднe збльшення показника протягом 7-го тижня (р = 0,036 поpiвняно ji значенням станом на 5-й тиждень спостереження; W-критерй Уыкоксона). Протягом усього перюду спостереження мiж значеннями SFIгруп 1 та 3 вipогiдних вiдмiннос-тей не виявлено (р > 0,05; U-тест Манна — Утт). Статистично значущi вiдмiнностi (р < 0,05; U-тест Манна — Утш) мiж показниками групи 1 та 2, а також групи 2 та 3 на користь груп 1 i 3 вiдповiдно виявляли починаючи з 14-ï доби й до ктця експерименту. При поpiвняннi зрезультатами тестування тварин групи 4 показники груп 1, 2 i 3 виявилися вipогiдно (р < 0,05; U-тест Манна — Утш) меншими протягом усього пероду експерименту. Висновки. Пластика дефекту периферичного нерва трубчатим iмплантатом NeuraGen™, заповненим фiбpиновим гелем 1з вмктом стовбурових клiтин-похiдних нервового гребеня, з точки зору вiдновлeння стану м'язово-суглобового апарату паретично1' ктщвки eквiвалeнтнe класичнт авто-нейропластищ. Тривалкть пероду регенерацтного росту волокон травмованого нерва до моменту тщацп вiдновлeння функцп'паретично1'ктщвки суттево залежить вiд тканинного оточення у зот травматичного дефекту. Тривалкть активного вiдновлeння функцп паретично1' кiнцiвки за вiдтвоpeного ваpiанту травми обмежена першим мкяцем, не залежить вiд специфки тканинних процеав у зот пластики дефекту нерва. Ключовi слова: мультипотентт стовбуpовi клiтини-похiднi нервового гребеня; функщональний тдекс адничного нерва; матрикс; тест i-з бковою доpiжкою
© «Ммнародний невролопчний журнал» / «Международный неврологический журнал» / «International Neurological Journal» («Mezdunarodnyj nevrologiceskij zumal»), 2018 © Видавець Заславський О.Ю. / Издатель Заславский А.Ю. / Publisher Zaslavsky O.Yu., 2018
Для кореспонденци: Петрю Тарас 1горович, вщдшення виновно! нейрохфурги, Державна установа «1нститут нейрохфурги ¡м. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни», вул. Платона Майбо-роди, 32, м. КиТв, 04050, УкраТна; e-mail: [email protected]
For correspondence: Taras Petriv, Department of restorative neurosurgery, State Institution "Institute of Neurosurgery named after Academician A.P. Romodanov of the NAMS of Ukraine'; Platona Mayborody st., 32, Kyiv, 04050, Ukraine; e-mail: [email protected] Taras Petriv ORCID ID orcid.org/0000-0001-9160-8908
Вступ
Частота травми периферичних нервiв становить 0,3—0,5 на 10 000 населення [1]. В Укра!ш щорiчно рееструють 2,5—3 тис. випадыв травми периферичних нервiв, з яких 60—75 % супроводжуються швалщиза-щею хворого [2]. Середнiй вiк пащенпв (18—44 роки) та значна тривалють життя пiсля отримання травми обумовлюють значну соцiально-економiчну важ-нiсть проблеми вщновлення функцп травмованого нерва [3]. Незважаючи на значний технологiчний прогрес, створення умов для штенсивного росту пе-ретнутих нервових волокон через зону травми нерва залишаеться актуальною проблемою. Одним iз пер-спективних напрямкiв И виршення е залучення методу тканинно! iнженерii [4, 5, 11].
Регенерацш травмованого нерва активно вивча-ють в умовах експерименту [7, 10]. За даними мета-аналiзу 1500 наукових публiкацiй iз ще! проблематики у межах бази даних PubMed, у 90 % випадшв досль дження здiйснено на моделi травми сiдничного нерва щура [6—9], що обумовлено доступнiстю бiологiчного матерiалу, простотою вiдтворення, наявнiстю засобiв кшьысно! оцiнки функцп нерва [6].
Важливим питанням тканинно! iнженерii е пошук доступного джерела автологiчних стовбурових клггин, як перспективних кандидатiв розглядають мультипо-тентнi стовбуровi клiтини-похiднi нервового гребеня (МСК-ПНГ), що мютяться у бульбарному регюш волосяного фолiкула, мають здатнiсть до нейрогенного
диференцiювання [12—14]. Нервовий гребiнь — тим-часова структура, що утворюеться тд час нейруляцп i дае початок широкому спектру клгган нейтрального та мезенхiмного фенотипу [15]. У рядi дослщжень встановлено позитивний вплив МСК-ПНГ на регенерацш травмованого сщничного нерва [15, 16].
Травма сщничного нерва супроводжуеться пери-феричним парезом м'язiв стопи й змiною !! просто-рово! конфiгурацii; аналiз геометричних особливос-тей вiдбитка паретично! стопи щура е основою оцшки функци сщничного нерва [7]. У данiй робот наведено результати вiдновного нейроiнженерного лшуван-ня травми сiдничного нерва зршого щура за участю МСК-ПНГ iз застосуванням методу оцiнки вiдбитка паретично! стопи.
Мета: дослщити вiдновлення функци сiдничного нерва з використанням засобiв тканинно! iнженерii' пiсля його повного перетину в експерименть
Матерiали та методи
Дослщження виконано на 52 бших безпородних щурах-самцях (250 ± 25 г, 5—6 мiс.), утримуваних у стандартних умовах вiварiю ДУ «1нститут нейро-хiрургi! iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра!ни» з дотриманням чинних норм бюетики (директива Ради 6С 86/609/ЕЕС «Про наближення закошв, пiдзаконних та адмшютративних положень держав-членiв про захист тварин, як використовуються для експериментальних та iнших наукових цiлей» (1986), бвропейська конвенцiя про захист хребетних тварин,
Рисунок 1: А — бГова дор'жка; В — отримання вщбитюв стоп щур1в (кришка знята); С — провдники п'щготоваш до ¡мплантацИ; D — видлений СН щура; Е — сформований дефект СН; Ё — ¡мплантований
провщник (пояснення у текст'О
якi використовуються для експериментальних та на-укових цiлей (1986), Закон Укра!ни № 3447-IV «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» (2006)). Протокол дослщження схвалено комiтетом з бюетики ДУ «1нститут нейрохiрургi! iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра!ни».
Сформовано 4 експериментальш групи: група 1 — перетин сщничного нерва (невротомiя) та негайна автонейропластика (п = 14); група 2 — невротомiя та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фiбриновим гелем (п = 15); група 3 — невротомiя та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фiбриновим гелем з вмютом МСК-ПНГ (п = 16); група 4 — несправжньоопероваш тварини (п = 7).
Рисунок 2. Автонейропластика: А — вщбиток правоI (iнтактноi') задньо/ к1нц1вки щура; В — вщбиток л1во/ задньоI (експериментальноI) к1нц1вки (ЛЗК) щура через 2 тижн1; С — вщбиток ЛЗК щура через 4 тижн1; D — вщбиток ЛЗК щура через 8 тижн1в (пояснения у тексл)
Рисунок 4. Пластика нерва колагеновим провщ-ником з МСК-ПНГ: А — вщбиток правоI (нтактно'О задньоI кiнцiвки щура; В — вщбиток лiвоi' задньо/ (експериментальноI) юн^вки (ЛЗК) щура через 2 тижн1; С — вщбиток лЗк щура через 4 тижн1; D — вщбиток ЛЗК щура через 8 тижн1в (пояснення у тексл)
Мультипотентш CT0B6yp0Bi клгтини-похщш нерво-вого гребеня видтеш методом експлантапв за SieberBlum et al. [14] з регюну bulge волосяного фолкула Bi6p^ безпорщних дорослих щурiв-самцiв (n = 3) вiварiю ДУ «1нститут нейрохiрургii iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши» на базi ДУ «1нститут гене-тичноi та регенеративноi медицини НАМН Украши».
Капсулу фолшула розрiзали вздовж, фолiкул пе-ресiкали поперечно вище та нижче потовщення, яке видшяли з капсули та помщали в чашку Петрi, вкриту колагеном. Шсля прикрiплення протягом однiei годи-ни експлантати заливали середовищем росту: aMEM (Sigma, США) з додаванням 5% фетальноi телячоi си-роватки (Sigma, США), 5 нг/мл основного фактора фiбробластiв (Sigma, США), 10 нг/мл ешдермально-го фактора росту (Sigma, США), 1% розчину вгтамь шв MEM (Sigma, США), 1% поживноi добавки ITS (Gibco, США), 2 мМ глутамiну, 100 од/мл пенщилшу, 100 мкг/мл стрептомiцину, 2,5 мкг/мл амфотерицину В. Культивування проводили в мультигазовому шку-баторi CB 210 (BINDER, Шмеччина) при температурi 37 °С у газовiй сушш^ що мала наступний склад: 90 % N2, 5 % O2 и 5 % СО2. Перший пасаж проводили на десяту добу в культуральний флакон 25 см2. Наступш перешви клгтин здiйснювали при досягненш культурою субконфлуентного стану. Заавна концентрацiя при пересiвах становила 1000 клгтин/см2. Пасажуван-ня проводили за допомогою 0,05% розчину трипсину
Рисунок 3. Пластика нерва колагеновим провщни-ком: А — вщбиток правоI (нтактно 'О задньоI к1нц1вки щура; В — вщбиток л1во/ задньоI (експерименталь -ноI) юн^вки (ЛЗК) щура через 2 тижн1; С — вщбиток ЛЗК щура через 4 тижн1; D — вщбиток ЛЗК щура через 8 тижн1в (пояснення у текст'О
-1-1-1-1-1-г
12345678
Тривалкть спостереження, тижн
Рисунок 5. Значення функцонального ¡нщекса сщничого нерва (SFI) у експериментальних групах протягом загального перющу спостереження. Данi щощо в1рогщност1 р1зниц1 показниюв навещено у текст
в 0,53 мМ розчинi Na2EDTA (Sigma, США). В експе-риментi використовували кпiтини 3—5 пасажiв.
Тканинно-iнженерний проводник для пластики дефекту периферичного нерва засОвали МСК-ПНГ за двоетапною техшкою. На першому етапi проводили зашв 200 тисяч МСК-ПНГ на внутршню поверх-ню колагенового проводника NeuraGenTM довжиною 1,2 см. Для цього закривали один кiнець трубки, вносили суспензш клiтин у поживному середовищi та закривали другий кшець. Для рiвномiрного роз-подiлу клггин провiдник помiщали у роллерну установку CellNest Roller D2 (SINO-BIOTOP, Китай), яка знаходилась у мультигазовому шкубатор^ та куль-тивували протягом 24 годин iз швидкiстю 20 оберпв в 1 хвилину. На другому еташ на наступну добу зашва-ли ще 800 тисяч МСК-ПНГ у порожнину проводника шляхом полОмеризаци фiбринового гелю, що був виготовлений iз кровi щурiв. Для виготовлення фь бринового гелю вод щурiв збирали кров: 1) у центри-фужнi пробiрки без антикоагулянту для виготовлення сироватки, що мютить тромбш; 2) у центрифужш пробiрки з антикоагулянтом ACD-A (Haemonetics, США) у спiввiдношеннi 9 : 1 для отримання збагаче-но! тромбоцитами плазми (ЗТП). Кров без антикоагулянту шкубували у термостат при 37 °С протягом години для li згортання. Потiм центрифугували 20 хв при 4 °С та 2300 g, вiдбирали супернатант (сироватка, що мютить тромбш) та заморожували при —80 °С до використання. Кров з антикоагулянтом обробляли центрифугуванням в два етапи: 1) 10 хв при 4 °С та 800 g (седиментацiя еритроцитiв i мононуклеарiв кро-вi, отримання плазми кровО); 2) 20 хв при 4 °С i 2300 g для седиментацп тромбоцитiв та отримання збагаче-но! тромбоцитами плазми. Попм ЗТП пiддавалась двом циклам заморожування — водтаювання i цен-трифугувалася 20 хв при 4 °С та 2300 g. Супернатант (крiолiзат ЗТП) вiдбирався та зберiгався при —80 °С до використання. Для формування фiбринового гелю клiтини ресуспендували у 900 мкл крiолiзату ЗТП, додавали 100 мкл сироватки з активованим тромбшом (сумш 750 мкл сироватки з тромбшом з 250 мкл 10% розчину СаСу i заповнювали цим розчином порожнину закритого з одного боку колагенового проводника, закривали другий кшець проводника та шкубували 20 хв у мультигазовому iнкубаторi при 37 °С до полОме-ризаци фiбринового гелю. Потiм засiяний клоганами провiдник помiщали у живильне середовище та куль-тивували протягом 24 годин до використання.
Хiрургiчне втручання виконували за загального знеболення тварини (внутршньоочеревинне введен-ня розчину ксилазину 15 мг/кг та кетамшу 70 мг/кг маси). З лшшного розрiзу шыри по латеральнiй по-верхнi стегна видоляли й мобiлiзували сiдничний нерв на водсташ 20 ± 1 мм вод його виходу з порожнини малого тазу, висшали фрагмент довжиною 10 ± 2 мм. У груш 1 фрагмент повертали на 180° i фшсували мОж куксами нерва 3—6 ешневральними швами за допомо-гою атравматично! голки Оз монофоламентною полОа-модною ниткою 10/0. У груш 2 кшщ нерва фшсували
до трубчатого колагенового Омплантата, заповненого фОбриновим гелем, за допомогою 4 ешневральних швОв. У груш 3 кшщ нерва аналопчним чином фш-сували до трубчатого Омплантата, заповненого фОбри-новим гелем з МСК-ПНГ у кшькосп 1 х 106 клотин. У груш 4 перетин мобшзованого нерва не виконували. У вшх групах рану закривали пошаровими швами, профшактику шфекцшно-запальних ускладнень здшснювали за допомогою введення розчишв бщи-лшу-5 (1 млн ОД на 1 кг маси тша) та дексаметазону (6 мг/кг маси). Шсля вказаних маншуляцш тварин протягом 2—4 годин утримували в примщенш з под-вищеною температурою повотря (30 °C), у подальшо-му — у звичних умовах вОварш.
Для отримання водбитыв стоп щурОв використовували спещально розроблену конструкцш [23] у ви-глядО тунелю для односпрямованого руху тварини (висота — 10 см, ширина — 12 см, довжина — 120 см) з плоским дном, встеленим паперовим ношем, Оз за-слшкою на початку та облаштованим виходом у кли"-ку — у кшщ. Тварину Оз змоченими розчином фу-корцину подошвами задшх лап помщали у тунель, закривали заслшку; шсля самовольного перемщення тварини у клику паперовий носш Оз водбитками стоп висушували i залучали до аналОзу. Визначали наступш показники: print length (PL) — водстань вод п'яткового водбитка до водбитка кшця третього пальця стопи, toe spread (TS) — водстань мОж водбитками кшщв 1-го та до 5-го пальщв, intermediate toe spred (ITS) — водстань мОж водбитками кшщв 2-го та 4-го пальця. Показники обраховували для експериментально! (E) та штактно! (N) кшщвок.
Функцюнальний шдекс содничного нерва (Sciatic Functional Index — SFI) визначали за допомогою фор-мули Bain-Mackinnon-Hunter [7, 9]:
CE-f эо о (EPL-NPL\ , пп _ ETS-NTS EIT-NIT
SFI = —38,8 -1 + 109,5 (-) + 13,3 (-) - 8,8.
V NPL ) 4 NTS J NIT J
Показник розраховували для всОх тварин, визначали середне значення та середньоквадратичне вод-хилення. Нульове значення SFI водповодае штактнш кшщвщ, значення у —100 балОв — стану плегп за по-вно! водсутносп функцп содничного нерва.
ВОрогоднють рОзнищ показника мОж групами на кожному з термШв спостереження оцшювали за допомогою U-тесту Манна — Yorai. ВОрогоднють щотиж-невого приросту значення SFI у кожнш з експеримен-тальних груп оцшювали за допомогою W-критерш Уткоксона. У вшх випадках припущення щодо ста-тистично! значущост отриманого результату вважа-ли вОрним, якщо ймовОрнють нульово! гшотези була меншою, шж 0,05 (р < 0,05).
Результати та обговорення
У групах 1 i 3 спостерОгали схожу динамОку SFI, яка характеризувалася двофазнютю (рис. 5). Перша фаза включала практично лшшне зростання показника вод значення у —70 на 7-му добу спостереження до —35 станом на кшець 4-го тижня спостереження. У груш 1
статистично значуще щотижневе збiльшення показ-ника реестрували протягом 2-5-го тижня (р < 0,03; W-критерiй У!лкоксона), у груш 3 — протягом 2-4-го тижня. Друга фаза тривала протягом 6-7-го та 5-7-го тижня у груш 1 та 3 вщповщно i характеризувалася вiдсутнiстю змiн показника. Третю фазу спостериали протягом 8-го тижня: збшьшення показника групи 3 протягом цього перюду виявилося статистично зна-чущим (р = 0,01; W-критерiй У!лкоксона), показ-ник групи 1 станом на ынець 8-го тижня вiрогiдно (р = 0,046; W-критерiй У!лкоксона) переважав зна-чення, отримаш наприкiнцi 6-го тижня.
Динамiка SFI у групi 2 суттево вiдрiзнялася вiд описано! для груп 1 i 3. Характерним була наяв-нiсть фази вiдсутностi приросту показника протягом
2-го тижня спостереження. У подальшому, протягом
3-4-го тижня виявляли вiрогiдне збiльшення показника (р < 0,01; W-критерiй У!лкоксона), стабшзацш (протягом 5-6-го тижня), вiрогiдне збшьшення показника протягом 7-го тижня (р = 0,036 порiвняно зi значенням станом на 5-й тиждень спостереження; W-критерiй У!лкоксона). Протягом 8-го тижня вь рогiдних змiн показника не виявляли, однак спосте-риали зникнення значущостi рiзницi iз показником 5-го тижня.
Отже, як i у групах 1 та 3, у випадку iмплантацri колагеново! трубки, заповнено! фiбриновим гелем (група 2), прирют SFI вiдбуваеться двоетапно, його тривалють, а також тривалiсть промiжно! фази плато вкорочена, результативнiсть менша. Отриманi данi свiдчать, що менший кiнцевий результат вщновно-го процесу у цш групi обумовлений вщсутнютю позитивно! динамiки протягом 2-го тижня спостере-ження.
Протягом усього перюду спостереження мiж зна-ченнями SFI груп 1 та 3 вiрогiдних вiдмiнностей не виявлено (р > 0,05; и-тест Манна — У!тш). Статистично значущi вiдмiнностi (р < 0,05; и-тест Манна — У!тш) мiж показниками групи 1 та 2, а також групи 2 та 3 на користь груп 1 та 3 вщповщно виявляли почи-наючи з 14-! доби й до ынця експерименту. Порiвняно з результатами тестування тварин групи 4 показники груп 1, 2 i 3 виявилися значущо (р < 0,05; и-тест Манна — У!тш) меншими протягом усього перюду екс-перименту.
У нашому та шших [17] дослщженнях значний по-зитивний результат виновного процесу, пов'язаний з решервашею регенеруючими аксонами м'язiв, вщ-мiчали уже станом на 14-ту добу.
Лiнiйна динамiка значення SFI, виявлена нами у групах 1, 2 i 3, може вiдображати динамiку кiлькостi нервових волокон, що решервують м'язи паретично! кiнцiвки. Лшшне збiльшення кiлькостi таких волокон можливе за умови нерiвномiрностi !х росту з юнуван-ням сукупного фронту росту — розташування конушв росту окремих волокон у товщi нерва — нахиленого шд певним кутом до ос нерва. За таких умов, вра-ховуючи сталу швидысть росту, однак нерiвномiрну iнiцiацiю цього процесу серед регенеруючих волокон,
першими досягають м'яза авангардш конуси росту, у подальшому збшьшення кшькосп волокон, що до-сягли цш, зростатиме зi сталою швидыстю, лiнiйно. У рамках тако! моделi зменшення швидкостi росту волокон з часом може компенсуватися пластичними перебудовами на рiвнi центрально! нервово! системи, а також галузшням аксонiв, що досягли цш, у товщi м'яза. У таый моделi регенерацiйна пауза протягом перших 2 тижшв у груш 2 свщчить про суттево ниж-чу швидкiсть росту авангардних волокон, шж у групах 1 i 3; пiсля доростання авангардних волокон до цiлi швидкiсть росту у груш 2 стае аналопчною групам 1 i 3. Отже, у групах 1 i 3 юнують бiльш сприятливi умови для направленого росту аксошв, i якщо у випадку автонейропластики (група 1) таы умови слщ пов'язувати з тунельованою структурою сполучно-тканинного каркаса автоiмплантата, частково запо-вненого кштинами шваншвсько! глп, то у випадку iмплантацii трубчатого резервуару МСК-ПНГ високу швидысть росту авангардних волокон можна поясни-ти швидкою векторизашею порожнини матриксу за участю сполучнотканинних та шваннiвських нащад-кiв iмплантованих стовбурових клiтин, стимулюючим впливом цих кштин на рiст аксональних конушв у бiк дистально! культi нерва.
У зв'язку з отриманими даними вщмггамо, що тс-ля перетину нерва деяы аксони проксимального кшця формують колби росту вже протягом першо! доби [18], через 24 год шсля травми поодинок волокна досягають дшянки травми, вростають у не! протягом 2—3-! доби; швидысть росту аксошв становить 0,25 мм/добу, з моменту досягнення дистально! культ — збшьшуеться до 1,0—8,5 мм/добу. За умов достатньо! васкуляризацп цей показник становить 3—4 мм/добу, в умовах слабко! васкуляризацп — 2—3 мм/добу.
1ншою шкавою рисою регенерацшного процесу, виявленою нами, е завершення його активно! фази до 5-го тижня спостереження, що е додатковою причиною низько! результативносп вщновного процесу у групi 2. Пояснення, на нашу думку, слш пов'язувати з особливютю молекулярних механiзмiв регенерацiй-ного росту аксонiв рухових нейрошв, !х центральних ланок, а також у явищi денервацiйноi' атрофп м'яза: незважаючи на пластичнiсть м'язово! тканини, пе-рiод результативно! його регенерацп обмежений [19-22].
Висновки
1. Пластика дефекту периферичного нерва трубча-тим iмплантатом NeuraGenTM, заповненим фiбрино-вим середовищем iз вмiстом стовбурових клгган-по-хiдних нервового гребеня, з точки зору вщновлення стану м'язово-суглобового апарату паретично! ынщв-ки еквiвалентна класичнш автонейропластицi.
2. Тривалiсть перiоду регенерацшного росту волокон травмованого нерва до моменту шщацп вщновлення функцп паретично! ыншвки суттево зале-жить вiд тканинного оточення у зош травматичного дефекту.
3. Тривалють активного вiдновлення функцй' паре-тично! кiнцiвки за вщтвореного BapiaHTy травми об-межена першим мюяцем, не залежить вiд специфши тканинних пpоцесiв у 30Hi пластики дефекту нерва.
Конфлжт штереив. Автори заявляють про вщсут-нiсть конфлшту iнтеpесiв при пiдготовцi дано! статть
1нформащя про вклад у роботу кожного автора
Концепщя i дизайн дослщження — В. Цимбалюк, Т. Петpiв.
Моделювання травми, автонейропластика, iM^ лaнтaцiя колагенового матриксу, у тому чи^ з МСК-ПНГ — Т. Петpiв.
Отримання та культивування МСК-ПНГ, створен-ня ткaнинно-iнженеpних конструкпв — Р. Васильев.
Визначення функцюнального iндексy сiдничного нерва, первинна обробка даних — Т. Петpiв, В. Мо-лотковець, М. Татарчук.
Статистична обробка даних — Н. Драгунцова.
1нтерпретащя отриманих результапв — В. Цимбалюк, Т. Петpiв, В. Медведев.
Написання тексту та редагування — В. Цимбалюк, Т. Петpiв, В. Медведев.
Список лператури
1. Torres R. Epidemiology of Traumatic Peripheral Nerve Injuries Evaluated by Electrodiagnostic Studies in a Tertiary Care Hospital Clinic / Torres R., Miranda G. // Boletin de la Asociacion Medica de Puerto Rico. — 2015. — Vol. 3, № 107. — P. 79-84.
2. Bidnoene хiрургiчне лжуеання нашдте ушкодження довгих глок плечоеого сплетення з еикористанням триеалоi електростимуляцй / Ю.П. Зозуля, 1.Б. Третяк, Ю.В. Цимбалюк, М.А. Сапон // Украгнський нeйрoхiрургiчний журнал. — 2013. — № 2. — С. 19-22.
3. Rasulic L. et al. The epidemiology of forearm nerve injuries — a retrospective study //Acta Clin. Croat. — 2015. — Vol. 54, № 1. — P. 19-24.
4. Battiston et al. Peripheral Nerve Defects: Overviews of Practice in Europe//Hand Clinics. — 2017. — Vol. 33, № 3. — P. 545550.
5. Safa B. Autograft Substitutes: Conduits and Processed Nerve Allografts/ Safa B, Buncke G. //Hand Clinics. — 2016. — Vol. 32, № 2. — P. 127-140.
6. Kappos Е.А. et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment ofc functional nerve recovery in small animal models//Brain Behav. — 2017. — Vol. 7, № 7. — Р. e00723, eCollection 2017.
7. Sarikcioglu L. Walking track analysis: an assessment method for functional recovery after sciatic nerve injury in the rat / L. Sarikcioglu, B.M. Demirel, A. Utuk//Folia Morphol. — 2009. — Vol. 68, № 1. — P. 1-7.
8. Jonsson S. et al. Effect of Delayed Peripheral Nerve Repair on Nerve Regeneration, Schwann Cell Function and Target Muscle Recovery // PLoS ONE. — 2013. — Vol. 8, № 2. —Р. e56484. Epub 2013 Feb 7.
9. Цимбалюк B.I., Третяк 1.Б., Гацький О.О., Вернигород-ський С.В. Пстоморфометрична ощнка eфeктиeнoстi rnM6i-ноеаног пластики адничного нерва при його великому дeфeктi
у uypie в eKcnepuMeHmi// Укранський нейрохiрургiчний журнал. — 2012. — № 3. — С. 48-51.
10. Lemke A. et al. A novel experimental rat model of peripheral nerve scarring: reliably mimicking post-surgical complications and recurring adhesions // Disease Models & Mechanisms. — 2017. — Vol. 10, № 8. — P. 1015-1025. Epub 2017 May 26.
11. Sullivan, R., Dailey, T., Duncan, K., Abel, N., Borlon-gan C.V. Peripheral nerve injury: Stem cell therapy and peripheral nerve transfer // International journal of molecular sciences. — 2016. — Vol. 17, № 12. — Р. E2101.
12. Vasyliev R.G. et al. Effects of Neural Crest-Derived Multipotent Stem Cells on Regeneration of an Injured Peripheral Nerve in Mice // Neurophysiology. — 2015. — T. 47, № 1. — P. 80-83.
13. Amoh Y. et al. Nestin-positive hair follicle pluripotent stem cells can promote regeneration of impinged peripheral nerve injury // J. Dermatol. — 2012. — Vol. 39. — P. 33-38.
14. Sieber-Blum M., Grim M., Hu Y., Szeder V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle // Dev. Dyn. — 2004. — Vol. 231, № 2. — P. 258-269.
15. Najafz,adeh N., Esmaeilzade B., Dastan Imcheh M. Hair follicle stem cells: In vitro and in vivo neural differentiation // World J. Stem. Cells. — 2015. — Vol. 7, № 5. — P. 866-872.
16. Neil G. Fairbairn, Amanda M. Meppelink, Joanna Ng-Glazier, Mark A. Randolph, Jonathan M. Winograd. Augmenting peripheral nerve regeneration using stem cells: A review of current opinion // World J. Stem. Cells. — 2015. — Vol. 7, № 1. — P. 11-26.
17. Jung Y., Ng J.H., Keating C.P., Senthil-Kumar P., Zhao J., Randolph M.A., Winograd J.M., Evans C.L. Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model // PLoS One. — 2014. — Vol. 9, № 4. — P. e94054. eCollection 2014.
18. Antoniadis G. Nerve regeneration/Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. // Modern concepts of peripheral nerve repair. — Springer International Publishing, 2017. — Р. 8-10.
19. Washabaugh C.H., Ontell M.P., Kant J.A. et al. Effect of chronic denervation and denervation-reinnervation on cytoplasmic creatine kinase transcript accumulation // Journal of Neurobiology. — 2001. — Vol. 47, № 3. — P. 194-206.
20. Lapalombella et al. Persistence of regenerative myogenesis in spite of down-regulation of activity-dependent genes in long-term denervated rat muscle// Neurology Research. — 2008. — Vol. 30, № 2. — P. 197-206.
21. Artioli G.G. et al. Embryonic stem cells improve skeletal muscle recovery after extreme atrophy in mice // Muscle Nerve. — 2015. — Vol. 51, № 3. — P. 346-352.
22. Rochkind S., Shainberg A. Muscle response to complete peripheral nerve injury: changes of acetylcholine receptor and cre-atine kinase activity over time // Journal of Reconstructive Microsurgery. — 2017. — Vol. 33, № 5. — P. 352-357.
23. Патент Украти на корисну модель № 118156, МПК: G09B 23/28. «Cnoci6 визначення функцюнального тдексу cid-ничного нерва у щурiв» /Цимбалюк Вталш 1ванович (UA); Мо-лотковець Вталш Юршович (UA); Петрiв Тарас 1горович (UA); Медведев Володимир Вжторович (UA); Лузан Борис Мико-лайович (UA). — Заявка № u201701183; Заявл. 09.02.2017; Опубл. 25.07.2017, Бюл. № 14.
Отримано 03.01.2018 ■
ЦымбалюкВ.И.1, Петрив Т.И.2, Васильев Р.Г3,4, Медведев В.В1, Молотковец В.Ю.1, ТатарчукМ.М.2, Драгунцова Н.Г.2 Национальный медицинский университет имени акад. А.А. Богомольца, г. Киев, Украина 2ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины», г. Киев, Украина 3ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины», г. Киев, Украина 4Биотехнологическая лаборатория ilaya.regeneration, медицинская компания ilaya®, г. Киев, Украина
Восстановление функции седалищного нерва с использованием средств тканевой инженерии после его полного пересечения в эксперименте
Резюме. Актуальность. Частота травмы периферических нервов составляет 0,3—0,5 на 10 000 населения, 60—75 % из которых сопровождаются инвалидизацией больного. Наиболее перспективным путем решения проблемы восстановления периферических нервов является тканевая инженерия с использованием биополимеров и стволовых клеток, в частности мультипотентных стволовых клеток-производных нервного гребня (МСК-ПНГ). Цель: исследовать восстановление функции седалищного нерва с использованием средств тканевой инженерии после его полного пересечения в эксперименте. Материалы и методы. Сформированы 4 экспериментальные группы: группа 1 — пересечение седалищного нерва (невротомия) и немедленная аутонейропластика (п = 14); группа 2 — невротомия и немедленная пластика коллагеновой трубкой, заполненной фибриновым гелем (п = 15); группа 3 — невротомия и немедленная пластика коллагеновой трубкой, заполненной фибриновым гелем с содержанием МСК-ПНГ (п = 16); группа 4 — ложнооперированные животные (п = 7). Результаты. В группах 1 и 3 динамика SFI характеризировалась двуфазно-стью. Первая фаза включала практически линейное нарастание значения от —70 на 7-е сутки наблюдения до —35 состоянием на конец 4-й недели наблюдения. Вторая фаза длилась в течение 6-7-й и 5-7-й недель в группе 1 и 3 соответственно и характеризовалась отсутствием изменений значения БП. Для группы 2 характерным было наличие фазы отсутствия прироста показателя в течение 2-й недели наблюдения. В дальнейшем, в течение 3-4-й недель наблюдали достоверное увеличение показателя (р < 0,01; W-критерий Уилкоксона), стабилизацию
(на протяжении 5-6-й недели), достоверное увеличение показателя в течение 7-й недели (р = 0,036 по сравнению со значением на 5-ю неделю наблюдения; W-критерий Уилкоксона). На протяжении всего периода наблюдения между значениями SFI групп 1 и 3 достоверных различий не выявлено (р > 0,05; и-тест Манна — Уитни). Статистически значимые различия (р < 0,05; и-тест Манна — Уитни) между показателями групп 1 и 2, а также групп 2 и 3 в пользу групп 1 и 3 соответственно наблюдали начиная с 14-х суток и до конца эксперимента. При сравнении с результатами тестирования животных группы 4 показатели групп 1, 2 и 3 оказались достоверно (р < 0,05; и-тест Манна — Уитни) меньше на протяжении всего периода эксперимента. Выводы. Пластика дефекта периферического нерва трубчатым имплантатом NeuгaGenTM, заполненным фи-бриновим гелем с наличием стволовых клеток-производных нервного гребня, с точки зрения восстановления состояния мышечно-суставного аппарата паретичной конечности эквивалентна классической аутонейропластике. Длительность периода регенерационного роста волокон травмированного нерва до момента инициации восстановления функции паретичной конечности существенно зависит от тканевого окружения в зоне травматического дефекта. Длительность активного восстановления функции паретичной конечности в данном варианте травмы ограничена первым месяцем, не зависит от специфики тканевых процессов в зоне пластики дефекта нерва. Ключевые слова: мультипотентные стоволовые клетки-производные нервного гребня; функциональный индекс седалищного нерва; матрикс; тест с беговой дорожкой
V.I. Tsymbaliuk1, T.I. Petriv2, R.G. Vasiliev3,4, V.V. Medvedev1, V.Yu. Molotkovets1, M.M. Tatarchuk2, N.G. Draguntsova2 1Bogomolets National Medical University, Kyiv, Ukraine
2State Institution "Institute of Neurosurgery named after Academician A.P. Romodanov of the NAMS of Ukraine", Kyiv, Ukraine 3State Institution "Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the NAMS of Ukraine", Kyiv, Ukraine 4Biotechnology Laboratory ilaya.regeneration, Medical Company ilaya®, Kyiv, Ukraine
Sciatic nerve functional recovery using tissue engineering after its complete transection in the experiment
Abstract. Background. The incidence of peripheral nerve injuries is 0.3—0.5 per 10,000 in general population, 60—75 % of them are accompanied by invalidisation of the patient. The most promising way to solve the problem of restoring peripheral nerves is tissue engineering using biopolymers and stem cells, in particular neural crest derived multipotent stem cells. The aim of the study was to investigate the function of the sciatic nerve with the use of tissue engineering after its complete intersection in the experiment. Materials and methods. Four experimental groups were formed: group 1 — sciatic nerve transection (neurotomy) and immediate autoneu-roplasty (n = 14); group 2 — neurotomy and immediate plasty with collagen tube filled with fibrin gel (n = 15); group 3 — neurotomy and immediate plasty with collagen tube filled with fibrin gel containing neural crest derived multipotent stem cells (n = 16); group 4 — sham operated animals (n = 7). Results. In groups 1 and 3, the dynamics of sciatic functional index (SFI) was characterized by two phases. The first phase included a practically linear increase in values, from —70 on day 7 of observation to —35 by the end of week 4. The second phase lasted for weeks 6—7 and 5—7 in groups 1 and 3, respectively, and was characterized by a lack of changes in the value of SFI. In group 2, there was a phase of absence of increment of the indicator during week 2 of observation. Subsequently, during week 3—4, there was a significant increase in the indicator (p < 0.01; Wilcoxon test); stabilization (during weeks 5—6); a sig-
nificant increase in the index during week 7 (p = 0.036 in comparison with the value on week 5 of observation; Wilcoxon test). During the entire observation period, no significant differences were found between SFI values for groups 1 and 3 (p > 0.05, Mann-Whitney U test). Statistically significant differences (p < 0.05; Mann-Whitney U test) between groups 1 and 2, as well as groups 2 and 3, in favor of groups 1 and 3, respectively, ranged starting from day 14 and to the end of experiment. Compared with the results of testing animals in group 4, the indicators of groups 1, 2, and 3 turned out to be significantly (p < 0.05; Mann-Whitney U test) less during the whole period of the experiment. Conclusions. Plasty of the peripheral nerve defect by a NeuraGen™ tubular implant filled with fibrin gel containing multipotent neural crest derived stem cells, in terms of restoring the muscular-articular apparatus of the paretic limb, is equivalent to classical autoneuroplasty. The duration of the period of regenerative growth of the traumatic nerve fibers until the initiation of the restoration of paretic limb function substantially depends on the tissue environment in the area of the traumatic defect. The duration of active restoration of the function of the paretic limb in this type of the trauma is limited to the first month, not dependent on the specificity of tissue processes in the area of nerve defect plasty.
Keywords: neural crest derived multipotent stem cells; sciatic functional index; matrix; walking track test
