CC BY
42
Орипнальы досл1дження
Original Researches
УДК 616.833.58-089:615.84:616-073.97-092.9 DOI: 10.22141/1608-1706.2.19.2018.130645
Цимбалюк В.1.12, neTpiB Т.1.2, Медведев В.В.1, Цимбалюк Ю.В.2, l<Aiменко П.П.3-4, Васильев Р.Г.34, Татарчук М.М.2
1Нащональний медичний ун1верситет ¡мен1 акад. О.О. Богомольця, м. КиТв, Укра!на 2ДУ «1нститутнейрох1рург1Т 1м. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра'Тни», м. КиТв, УкраТна 3ДУ «1нститут генетичноТ та регенеративноТ медицини НАМН Укра'Тни», м. КиТв, УкраТна 4Бютехнолопчна лабораторя ilaya.regeneration, медична компан1я ilaya®, м. КиТв, УкраТна
Рант результати в1дновлення
и ■ ■■ ■
морфолопчно! структури адничного нерва з використанням засобш тканинно! шженери июля його повного перетину в експеримент
Резюме. Актуальшсть. Травми опорно-рухового апарату, навпь незначнь можуть супроводжуватися ушкодженням периферичнихнервiв \ призводити до частковоТ чи повно'Твтрати функцм юн^вок. Юлькють таких па^енлв з кожним роком зростае у зв'язку зi зб'<льшенням кiлькостi техногенних травм /' склад-них поеднаних ушкоджень опорно-рухового апарату. Бурхлива урба^за^я призводить до зростання загального нейротравматизму в середньому на 2 % на рк. У структур травм опорно-рухового апарату ушкодження периферичних нервiв становлять в'<д 1,5 до 6 %, /'з них 90 % — верхньо'Т юн^вки. П'<д час в'<йськових д':й цей показник становить 12 % i спостер'гаеться у 2,8-5 % па^енлв /'з пол/'травмою. Мета: дослдити раннi результати в'<дновлення адничного нерва щура з використанням тканинно-нженерного п'<дходу п'юля його повного перетину в експеримент'1. Матер'юли та методи. Сформовано 4 експериментальн групи: група 1 — перетин адничного нерва (невротом'я) та негайна автоней-ропластика (п = 14); група 2 — невротом'я та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фiбриновим гелем (п = 15); група 3 — невротом'я та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фiбриновим гелем з вм/'стом мультипотентних стовбурових кл'тин — поздних нервового гребе-ня (п = 16); група 4 — несправжньооперован тварини (п = 7). На 30-ту добу половину тварин з кожноТ групи (1-ша — п = 7, 2-га — п = 7, 3-тя — п = 7, 4-та — п = 3) виводили з експерименту шляхом тракцИ' за ростральний кнець та для св'плооптично'Т м'кроскопн г'ютолопчний матер'юл адничний нерв опе-рований р'зними видами тканинно-нженерних пiдходiв, що вказан вище) фксували протягом доби в 10% розчин нейтрального формалiну, промивали зразки, зневоднювали у серн спирт'т, помщали Тх у парафiн та отримували зр'зи товщиною 5 мкм на м'кротом'!. Полм зр'зи депараф'н'зували у ксилол та 'мпрегнували азотнокислим ср'блом зпдно з методом Бльшовського, що дозволяе вiзуалiзувати структурн елементи периферичноТ нервовоТ системи. Результати. Пiсля перетину адничного нерва /' автонейропластики в 'мплантованому у зону пошкодження тканинно-нженерному провднику на 30-ту добу на тл посиленого розростання волокнистоТ сполучноТ тканини спостергалося формування коротких тяжiв нервових волокон, а також упорядкування Тх розмщення. того, у регенерат формувалися тоню перемички м'ж дiлянками тяжiв нервових волокон, що призводило до утворення безперервного зв'язку м'ж регенеруючими тяжами нервових волокон на р'зних рiвнях зони пошкодження адничного нерва. При застосуванн порожнистого колагенового пров'<дника, заповненого фiбриновим гелем для замщення дефекту адничного нерва, на 30-ту добу в'1дм'1чалося формування незначноТ кiлькостi тонких, хаотично розташованих нервових волокон i слабко виражене формування волокнистоТ сполучноТ тканини. При використанн тканинно-нженерного пров'<дника в цей же часовий пер'юд в'<дбувалося значне розростання нервових волокон, Тх гiпертрофiя /' утворення розгалужень нервових волокон,
© «Травма» / «Травма» / «Trauma» («Travma»), 2018
© Видавець Заславський О.Ю. / Издатель Заславский А.Ю. / Publisher Zaslavsky O.Yu., 2018 Для кореспонденци: Петр1в Тарас 1горович, вщдшення виновно! нейрохфурги, Державна установа «1нстатут нейрохфурги iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни», вул. Платона Майбо-роди, 32, м. КиТв, 04050, УкраТна; e-mail: [email protected]
For correspondence: Taras Petriv, Department of restorative neurosurgery, State Institution "Institute of Neurosurgery named after Academician A.P. Romodanov of the NAMS of Ukraine'; Platona Mayborody st., 32, Kyiv, 04050, Ukraine; e-mail: [email protected]
Травма
ор'ентованих у р1зних напрямках. Також при застосуванн инженерного проводника в'дм'чено б!льш слабке формування волокнистоi сполучноi тканини пор1вняно з першою i другою експериментальни-ми групами. Висновки. В результат проведеного дослдження встановлено, що найб'1льшу подiбнiсть до архпектон'ки адничного нерва нтактних тварин мае регенерат нервових волокон, що утворюеться при застосуванн автонейропластики. У цьому регенерат утворювалися дiлянки нервових волокон, що за своею архiтектонiкою найб'1льш близько в'1дпов'1дали нервовим волокнам у нативному адничному нервi. Кр'м того, у дiлянцi пошкодкення формувалися тонк в'1дростки, що зв'язували дiлянки регенеру-ючих нервових волокон на р'зних рiвнях. При цьому спостер'галося посилене розростання волокнистоi' сполучноi' тканини. Найбiльш виражено формування нервових волокон, а саме гiпертрофiя нервових волокон i значне '¡х розгалуження з формуванням сiтки, виявлено при застосуванн тканинно-нженерного провдника. При цьому в тканинно-нженерному пров'1днику на фон ппертрофм регенеруючих волокон в'дм'чено слабке формування пухко'волокнисто'сполучно'тканини. Отже, длявизначенняпереваг одного з двох тканинно-нженерних пiдходiв, використаних для регенерацИ адничного нерва, необидно провести вивчення результату процесу регенерацИ в б'1льш пiзнiй часовй точц^.
Ключовi слова: адничний нерв; тканинна iнженерiя; мультипотентн стовбуров'1 клтини—похiднi нервового гребеня
Вступ
Травми опорно-рухового апарату, навпъ незначш, можуть супроводжуватися ушкодженням перифе-ричних нервiв (ПН) i призводити до частково! чи по-вно! втрати функци кшщвок. Кшьысть таких пащен-пв з кожним роком зростае у зв'язку зi збтьшенням ктькосп техногенних травм i складних поеднаних ушкоджень опорно-рухового апарату [1, 2]. Бурхлива урбашзащя призводить до зростання загального ней-ротравматизму в середньому на 2 % на рк: [3].
У структурi травм опорно-рухового апарату ушко-дження периферичних нервiв становлять вiд 1,5 до 6 %, iз них 90 % — верхньо! кiнцiвки [4]. Пд час вiйськових дiй цей показник становить 12 % [5] i спостертаеться у 2,8—5 % пащентав iз полiтравмою [6].
Протягом останшх трьох десятилiть зроблено зна-чний прорив у вiдновленнi периферичних нервiв, зо-крема, завдяки впровадженню мiкрохiрурriчноl техш-ки, операцiйного мкроскопа, електростимуляцiйних методик, покращенню можливостей для реабштаци пацiентiв iз травмами периферичних нервiв [7]. Проте навiть адекватно виконане реконструктивне втручан-ня з використанням новгтшх досягнень дiагностики та лкування в бiльшостi випадюв не забезпечують по-вноцiнного вiдновлення функци кiнцiвки, i проблема вiдновлення втрачених функцш при ушкодженнi периферичних нервiв поки що далека вщ остаточного ви-рiшення.
На сьогодш золотим стандартом вiдновлення периферичних нервiв при !х великих дефектах е автонейро-пластика, проте вона мае низки недолшв. Для отри-мання автотрансплантата використовують в основному чутливi нерви, i найпоширенiшим як донор е п^игаШ. Використання чутливих нервiв як автотрансплантапв для пластики дефекпв рухових нервiв спричиняе мор-фологiчну невiдповiднiсть природного мiкрооточення, дiаметра аксонiв, що затримуе пролiферацiю шваншв-ських клiтин та !х здатнють мiелiнiзувати нервовi волокна [8—10].
Крiм цього, небажаними чинниками е додаткова операщя (для забору трансплантата), функцюнальний дефiцит в автономнiй зош нерва донора, утворення
двох зон нейрорафй', виникнення невром i рубщв, що утруднюе проростання аксонiв [11].
Перспективною альтернативою автонейропластищ е нейрошженерний пiдхiд, що передбачае використання бюсумюних бiодеградуючих матриксiв, стовбурових клгган i трофiчних факторiв, як1 можуть прискорювати вiдновлення ПН, а також запобГгати ретрограднiй деге-нерацй' ПН та вГдповГдних нейронiв спинного мозку у вiдповiдь на пошкодження на периферй' [12].
Критерй' iдеальних стовбурових клгган включа-ють швидкий та малошвазивний спосiб ix отриман-ня, швидке нарощування у культурi in vitro, здатнють до виживання, пролiферацii та iнтеграцii в тканини центральноi та периферичноi' нервовоi' систем (ПНС) рецишента, здатнiсть до стабтьно1 трансфекци вГраль-ними векторами та експреси вiдповiдниx екзогенних генiв [13, 14].
Одним iз найперспективнiшиx джерел стовбурових клгган е нервовий гребiнь (НГ). Нервовий гребшь — це транзиторна ембрюнальна структура, яка утворюеться шд час змикання нервових валикiв у нервову трубку (нейрулящя). В подальшому кштини нервового гребе-ня мГгрують в товщу тканини сомтв i дають початок клгганним елементам периферично! нервово! системи та структурам ненейронального типу [15]. Наявнiсть стовбурових кштин у нервовому гребенi було встановлено вгдносно недавно [16, 17].
Власне термш «стовбуровГ кштини нервового гребе-ня» (СКНГ) вперше використали Stemple та Anderson, шсля того як видГлили культуру клгган НГ шляхом флуоресцеш-активованого сортингу тканин ембрюна щура, використовуючи антитiла проти низькоафш-ного рецептора росту нерва р75 [18]. Наступне куль-тивування цих кштин показало, що бшьшють Гз них стали нейронами та невелика кшькють — незрглими шваншвськими кштинами. У популяцй' кштин наступ-ного клона виявлялися клггани нейронального типу i неспецифГчш ненейрональш клггани Гз здатнютю да-вати генерацш мультипотентних субклошв. Згодом у такий самий спошб авторам вдалося видглити СКНГ, що представляли постмГграторну популяцш, Гз феталь-ного сгдничного нерва щура. Кштини постмГграторно1
культури СКНГ in vitro диференцшвалися у нейрони, шваннiвськi клiтини, мiофiбробласти. При трансплан-тацГ! ще! культури без перюду культивування безпосе-редньо в курячi ембрiони спостерiгався рют нейрональ-них i глiальних структур у рiзних вщдлах ПНС [19].
Стовбуровi клiтини нервового гребеня рострально! частини НГ дають початок бшьшосп ыстково-хря-щових структур обличчя, нервовим ганглшм та гладким мюцитам судин голови, вагусно! та сакрально! частин — нейронам стшки кишечника, трункусно! — структурам периферично! нервово! системи, шгмент-ним клiтинам шири, ендокринним клгганам наднир-никiв [19, 20].
Також на сьогодш вгдомо, що i3 стовбурових клiтин нервового гребеня утворюються не тiльки клггани rai-ального та нейронального типу, а й фiбробласти ендо-неврш, тобто утворення всiх елементiв периферичного нерва залежить вiд мультилiнiйно! диференщаци одного типу клiтин — похгдних нервового гребеня [20].
Волосяний фолшул складаеться i3 концентрич-но розташованих цилiндрiв, що мiстять клггани, якi продукують високоспецiалiзованi проте!ни, зокрема кератин, основний компонент волосся, i перебувае у постшному динамiчному станк фаза росту (анаген), перехiдна фаза (катаген), фаза спокою (телоген). Та-кий активний життевий цикл передбачае наявшсть стовбурових клiтин [21, 22].
Бульбарний репон волосяного фолiкула — шша для епiдермальних i меланоцитарних стовбурових клгган. Також у волосяному фолiкулi е популяцiя клiтин, яы е похiдними нервового гребеня, що мають надзвичайно широкий потенцiал до диференцшвання й експресу-ють нестин, маркер стовбурових клгган нейрального типу [18, 19, 22].
Група вчених шд керiвництвом Sieber-Blum вгдкри-ли !х у 2004 рощ i довели походження цих клгган Гз нервового гребеня [23].
На сьогодш доведено, що стовбуровГ клггани нервового гребеня, видшеш Гз волосяного фолшула, можуть диференцшватися у нейрони, тальш клггани, кера-тиноцити, гладком'язовГ клггани, меланоцити in vitro [17, 18, 20]. Фенотип та особливост культивування стовбурових клгган нервового гребеня доводять, що вони мають високий пролГферативний потенщал, здат-ш до мультилшшного диференцшвання, експресують антигени, характерш для мультипотентних стовбурових клгган (CD44, CD73,CD90 i Sca-1) i CD117 (маркер мГгруючих клгган нервового гребеня). У культурГ in vitro СКНГ демонструють здатшсть до клонального росту та самооновлення [21—23]. Видшеш Гз волосяних фолшу-лГв гризушв та людини стовбуровГ клггани нервового гребеня залежно вгд умов культивування перетворюва-лися у нейрони та S100-iмунопозитивнi глюцити, що експресували p-3-тубулш та кислий глГальний проте!н фГбрил (GFAP) [23].
Таким чином, мультипотентш стовбуровГ клггани-похгдш нервового гребеня разом Гз бюсумюними поль мерами е складовими перспективного тканинно-шже-нерного пГдходу до вгдновлення периферичних нервГв.
Мета: дослiдити paHHi результати вгдновлення мор-фологiчноï структури сгдничного нерва з використанням засобГв тканинно! iнженерiï пiсля його повного перетину у експериментг
Матер1али та методи
Дослгдження виконано на 52 бглих безпородних щурах-самцях (середня маса — 250 ± 25 г; 5—6 Mic.), утримуваних у стандартних умовах вiварiю ДУ «1нсти-тут нейрохiрургiï iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши» з дотриманням чинних норм бюетики (Директива Ради 6С 86/609/ЕЕС «Про наближення зако-нiв, пiдзаконних та адмiнicтративних положень дер-жав-членiв про захист тварин, яы використовуються для експериментальних та шших наукових цiлей» (1986), бвропейська Конвенцiя про захист хребетних тварин, яы використовуються для експериментальних та наукових цглей (1986), Закон Украши № 3447-IV «Про захист тварин вгд жорстокого поводження» (2006)). Протокол доcлiдження схвалено Комггетом з бiоетики ДУ «1нститут нейрохiрургiï Гм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши».
Сформовано 4 експериментальш групи: група 1 — перетин сгдничного нерва (невротомГя) та негайна автонейропластика (n = 14); група 2 — невротомГя та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фГбриновим гелем (n = 15); група 3 — невротомГя та негайна пластика колагеновою трубкою, заповненою фГбриновим гелем з вмютом мультипотентних стовбурових клгган — похгдних нервового гребеня (МСК-ПНГ) (n = 16); група 4 — несправжньоопероваш тва-рини (n = 7).
Мультипотентш стовбуровГ клггани — похгдш нервового гребеня видглеш методом експлантапв за Sieber-Blum et al. [14] з репону bulge волосяного фоль кула вГбрис безпородних дорослих самщв щурГв (n = 3) вГварш ДУ «1нститут нейрохГрургй' Гм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши», на базГ ДУ «1нститут генетич-но'1 та регенеративно!' медицини НАМН Украши».
Капсулу фолшула розрГзали вздовж, фолшул перестали поперечно вище та нижче вгд потовщення, яке видшяли з капсули та помщали в чашку ПетрГ, вкриту колагеном. Шсля прикршлення протягом од-ше1 години експлантати заливали середовищем росту: aMEM (Sigma, США) з додаванням 5% фетально! телячо! сироватки (Sigma, США), 5 нг/мл основного фактора фГбробласпв (bFGF, Sigma, США), 10 нг/мл ешдермального фактора росту (EGF, Sigma, США), 10 нг/мл шсулшоподГбного фактора росту (IGF, Sigma, США), 1% поживно! добавки ITS (Gibco, США), 2 мМ глютамшу, 100 од/мл пенщиль ну, 100 мкг/мл стрептомщину, 2,5 мкг/мл амфотери-цину В. Культивування проводили в мультигазовому шкубаторГ CB 210 (Binder, Шмеччина) при темпера-турГ 37 °С у газовш сумшГ, що мала наступний склад: 90 % N2, 5 % O2 и 5 % СО2. Перший пасаж проводили на 10-ту добу в культуральний флакон 25 см2. На-ступш перешви клгган здшснювали при досягненш культурою субконфлуентного стану. Зашвна кон-
центрацiя при nepeciBax становила 1000 клгган/см2. Пасажування проводили за допомогою 0,05% роз-чину трипсину в 0,53 мМ розчиш Na2EDTA (Sigma, США). В експеримента використовували кштини 3-го пасажу.
Тканинно-iнженерний провiдник для пластики дефекту периферичного нерва зашвали МСК-ПНГ за двохетапною техшкою. На першому етапi проводили зашв 200 тисяч МСК-ПНГ на внутршню поверхню колагенового провiдника NeuraGen® довжиною 1,0 см. Для цього закривали один кiнець трубки, вносили сус-пензiю клiтин у живильному середовищi та закривали другий кiнець. Для рiвномiрного розподiлу клiтин проводник розмiщали у ролерну установку CellNest Roller D2 (SINO-BIOTOP, Китай), яка знаходилась у мульти-газовому шкубатор^ та культивували протягом 24 годин iз швидкiстю 20 обертав за 1 хвилину. На другому еташ на наступну добу зашвали ще 800 тисяч МСК-ПНГ у порожнину провiдника шляхом полiмеризацii фiбринового гелю, що був виготовлений iз кровi щурiв. Для виготовлення фiбринового гелю вiд щурiв збира-ли кров: 1) у центрифужш пробiрки без антикоагулянту для виготовлення сироватки, що мютить тромбш; 2) у центрифужнi пробiрки з антикоагулянтом ACD-A (Haemonetics, США) у сшввщношенш 9 : 1 для отри-мання збагаченоi тромбоцитами плазми (ЗТП). Кров без антикоагулянту шкубували у термостатi при 37 °С протягом години для ii згортання. Потам центрифугу-вали 20 хв при 4 °С та 2300 g, вiдбирали супернатант (сироватка, що мютить тромбш) та заморожували при —80 °С до використання. Кров за антикоагулянтом об-робляли центрифугуванням в два етапи: 1) 10 хв при
4 °С та 800 g (седиментацiя еритроцитав та мононукле-арiв кровi, отримання плазми кровi); 2) 20 хв при 4 °С та 2300 g для седиментаци тромбоцитiв та отримання збагачено'1' тромбоцитами плазми. Потам ЗТП поддавалась двом циклам заморожування — вiдтаювання i центрифугувалася 20 хв при 4 °С та 2300 g. Супернатант (крюл!зат ЗТП) вiдбирався та зберiгався при —80 °С до використання. Для формування ф!бринового гелю кль тини ресуспендували у 900 мкл крюл!зату ЗТП, додавали 100 мкл сироватки з активованим тромбшом (сумш 750 мкл сироватки з тромбшом з 250 мкл 10% розчину СаСу та заповнювали цим розчином порожнину за-критого з одного боку колагенового проводника, за-кривали другий кiнець провiдника та шкубували 20 хв у мультигазовому шкубатор! при 37 °С до пол!меризаци ф16ринового гелю. Пот1м зашяний клгганами провщ-ник розмщували у живильне середовище та культивували протягом 24 годин до використання.
Для оцшки життездатноста та адгези клгган проводили комбiноване фарбування флуоресцеш дiацетатом (FDA, Sigma, США) i проп1д1ум йодидом (PI, Sigma, США). Для цього видаляли культуральне середовище, вщмивали зразки три рази розчином Хенкса (Biowest, France) i заливали розчином Хенкса, що мютив 1 мкг/мл FDA i 2 мкг/мл PI. Час шкубаци становив для гранул
5 хвилин; 3D-гiдрогелiв i бiфазних конструкц1й — 10 хвилин. Пюля iнкубацii розчин барвникiв видаляли,
вщмивали 3 рази розчином Хенкса. Пюля шкубаци розчин барвниюв видаляли, вщмивали 3 рази розчином Хенкса та дослщжували за допомогою флуоресцентного швертованого мiкроскопа. FDA забарвлюе жив1 кл1тини яскраво-зеленим кольором. PI проникае в мертвi клггани i забарвлюе ядро в червоний кол1р.
Для св1тлооптично! мшроскопи гютолопчний матерiал фшсували протягом доби в 10% розчиш нейтрального формалшу, промивали зразки, зне-воднювали у серп спиртав, помщали !х у парафш та отримували зр1зи товщиною 5 мкм на мшротомг По-т1м зр1зи депарафМзували у ксилол1 та 1мпрегнували азотнокислим ср16лом зг1дно з методом Бшьшов-ського, що дозволяе в1зуал1зувати структурн1 еле-менти нервово'1' системи.
Хiрургiчне втручання виконували за загального зне-болювання тварини (внутршньоочеревинне введення розчину ксилазину 15 мг/кг та кетамiну 70 мг/кг маси). З лшшного розр1зу шк1ри по латеральнш поверxнi стегна вид1ляли й мобшзували шдничний нерв на вщсташ 20 ± ± 1 мм вщ його виходу з порожнини малого таза, виш-кали фрагмент довжиною 10 ± 2 мм. У груп1 1 фрагмент повертали на 180° i фiксували м1ж куксами нерва 3—6 епiневральними швами за допомогою атравматично! голки 1з монофтаментною полiамiдною ниткою 10/0. У груш 2 кшщ нерва фшсували до трубчатого колагенового iмплантанта, заповненого ф16риновим гелем, за допомогою 4 ешневральних шв1в. У груш 3 кшщ нерва аналопчним чином фшсували до трубчатого iмплантата, заповненого ф16риновим гелем з МСК-ПНГ у илькоста 1 • 106 клгган. У груп1 4 перетин мобшзованого нерва не виконували. В ушх групах рану закривали пошаровими швами, профтактику iнфекцiйно-запальниx усклад-нень здшснювали за допомогою введення розчин1в бь цил1ну-5 (1 млн ОД на 1 кг маси тала) та дексаметазо-ну (6 мг/кг маси). Пюля вказаних маншуляцш тварини протягом 2—4 годин утримували в примщенш з пщви-щеною температурою повпря (30 °C), у подальшому — у звичних умовах вiварiю.
Результати та обговорення
На поздовжних зрiзаx нативнi нервовi волокна, що складають шдничний нерв, утворюють звивист1 цшсш тяж1 з прошарками пухкого волокнистого сполучнот-канного матриксу (рис. 2А).
Пюля перетину шдничного нерва i наступно'1' авто-нейропластики в iмплантованому у зону пошкодження бiоiнженерному конструкт! на 30-ту добу на тл1 поси-леного розростання волокнисто! сполучно'1' тканини спостериалося формування коротких тяж1в нервових волокон, а також упорядкування !х розмiщення. Кр1м того, у регенерата формувалися тонк1 перемички м1ж дiлянками тяж1в нервових волокон, що призводило до утворення неперервного зв'язку м1ж регенеруючими тяжами нервових волокон на р1зних р1внях зони пошкодження шдничного нерва (рис. 2Б).
При застосуванш тканинно-iнженерного провщ-ника 1з ф16риновим гелем для замщення дефекту шд-ничного нерва на 30-ту добу вiдмiчалося формування
незначно! кiлькостi тонких, хаотично розташованих нервових волокон i слабко виражене формування волокнисто! рихло! сполучно! тканини (рис. 2В).
При використанш тканинно-iнженерного проводника в цей же часовий перюд водбувалося значне роз-ростання нервових волокон, !х гiпертрофiя О утворення розгалуджень нервових волокон, орОентованих у рОзних напрямках. Також при застосуванш шженерного проводника водмОчено больш слабке формування пухко! волокнисто! сполучно! тканини порОвняно з першою О другою експериментальними групами (рис. 2Г).
Висновки
1. У результата проведеного дослодження встанов-лено, що найбшьшу подОбшсть до архогектошки сод-ничного нерва штактних тварин мае регенерат нервових волокон, що утворюеться при застосуванш автонейропластики. У цьому регенерата утворюва-лися долянки нервових волокон, яы за своею архь тектошкою найбшьш близько водповодали нервовим волокнам у нативному содничному нервь КрОм того, у дтянщ пошкодження формувалися тоны водрос-тки, що зв'язували дшянки регенеруючих нервових волокон на рОзних рОвнях. При цьому спостериалося посилене розростання пухко! волокнисто! сполучно! тканини.
2. Однак найбольш виражено формування нервових волокон, а саме гшертрофОя нервових волокон О значне !х розгалуження з формуванням сотки, виявлено при застосуванш тканинно-шженерного проводника. При цьому в тканинно-шженерному проводнику на фош гшертрофо! регенеруючих волокон водмОчено слабке формування пухко! волокнисто! сполучно! тканини.
3. Отже, для визначення переваг одного з двох тка-нинно-шженерних подходОв, використаних для ре-генерацо! содничного нерва, необходно провести ви-вчення результату процесу регенерацп в больш шзнш часовш точц!
Конфлiкт штереав. Автори заявляють про водсут-нють конфл1кту iнтересiв при п1дготовц1 дано'о' статтi.
1нформашя про вклад у роботу кожного автора: кон-цепця i дизайн дослiдження — В. Цимбалюк, Т. Петрiв; моделювання травми, автонейропластика, iмплантацiя тканинно-iнженерного проводника, забiр тканинно-ш-женерного проводника для пстолопчного дослiдження — Т. Петрiв; отримання та культивування МСК-ПНГ, ство-рення тканинно-шженерних проводников — Р. Васильев; проведення пстолопчного дослодження — П. Ктменко; 1нтерпретац1я отриманих результат1в — В. Цимбалюк, П. Кшменко, Т. Петр1в, В. Медведев, Р. Васильев; написания тексту та редагування — В. Цимбалюк, Т. Петр1в, П. Кл1менко, В. Медведев, Р. Васильев.
Список л1тератури
1. Torres R. Epidemiology ofTraumatic Peripheral Nerve Injuries Evaluated by Electrodiagnostic Studies in a Tertiary Care Hospital Clinic / Torres R., Miranda G. //Boletin de la Asociacion Medica de Puerto Rico. - 2015. - Vol. 3, № 107. - P. 79-84.
2.Puzovic V. Etiology and mechanisms of ulnar and median forearm nerve injuries / Puzovic V., Samardzic M, Jovanovic M., Zivkovic B., Savic A., Rasulic L. // Vojnosani-tetskipregled. - 2015. - Vol. 72, № 11. - P. 961-967.
3. Rasulic L. The epidemiology of forearm nerve injuries — a retrospective study / Rasulic L., Puzovic V., Rotim K, Jovanovic M, Samardzic M, Zivkovic B., Savic A. // Acta Clinica Croatica. - 2015. - Vol. 54, № 1. - P. 19-24.
4. Ullah I. et al. Transplantation of Human DentalPulp-De-rived Stem Cells or Differentiated Neuronal Cells from Human Dental Pulp-Derived Stem Cells Identically Enhances Regeneration of the Injured Peripheral Nerve/ Ullah I. et al. // Stem. Cells Development. - 2017. - Vol. 26, № 17. - P. 1247-1257.
5. Guo J. Promoting potential of adipose derived stem cells on peripheral nerve regeneration / Guo J., Guo S., Wang Y., Yu Y. // Molecular Medicine Report. - 2017. - Vol. 16, № 5. - P. 7297-7304.
Рисунок 1. А — морфолопя МСК-ПНГ в культур'1. Фазово-контрастна м1кроскоп1я, збльшення х 50; Б — оц!нка життездатност кл1тин в тканинно-1нженерному провднику. Забарвлення FDA/PI. 48 годин культивування, флуоресцентна мiкроскопiя, збльшення х 200
Рисунок 2. Пстолопчне дослдження структури сдничного нерва. Забарвлення ¡мпрегнац1ею азотнокислим ср'блом. Збльшення х 400. А — контрольний ¡нтактний нерв; Б — автонейропластика; В — пластика сдничного нерва тканинно-нженерним провдником на основi колагену, ф!бринового гелю; Г — пластика сдничного нерва тканинно-нженерним провдником на основi колагену,
фiбринового гелю та МСК-ПНГ
6. Цимбалюк В.1. Елекmрофiзiологiчна дiагностика за-критого травматичного ураження плечового сплетення, поеднаного з черепно-мозковою травмою / Цимбалюк В.1., Чеботарьова Л.Л., Дубина T.I. // Украгнський нейрохiрур-гiчний журнал. — 2004. — Vol. 4. — С. 65-68.
7. Sebben A.D. Peripheral nerve regeneration: cell therapy and neurotrophic factors. / Sebben Alessandra Deise, Martina Lichtenfels and Jefferson Luis Braga da Silva // Revista Brasileira de Ortopedia (English Edition). — 2015. — Vol. 46, № 6. — P. 643-649.
8. Belanger K. Recent strategies in tissue engineering for guided peripheral nerve regeneration / Belanger Kayla // Macromo-lecular bioscience. — 2016. — Vol. 16, № 4. — Р. 472-481.
9. Цимбалюк B.I. До^дження ефективностi комбто-ваног пластики адничного нерва за його великого дефекту шляхом кыьшсног оцтки ступеня функционального вiднов-лення в експериментiу щурiв/Цимбалюк B.I., Третяк 1.Б., Гацький О.О. // Украгнський нейрохiрургiчний журнал. — 2012. — Vol. 3. — С. 48-51.
10. Whitlock E.L. Processed allografts and type I collagen conduits for repair of peripheral nerve gaps / Whitlock E.L., Tuffaha S.H., Luciano J. P. // Muscle Nerve. — 2009. — Vol. 39, № 6. — Р. 787-799.
11. Paczkowska E. Humoral activity of cord blood-derived stem/progenitor cells: implications for stem cell-based adjuvant therapy of neurodegenerative disorders / Paczkowska E. // PLoS One. — 2013. — Vol. 8, № 12.
12. Квопросу об истории хирургических операций при ранениях периферических нервов / А.С. Золотое, О.И. Пак // Травматология и ортопедия России. — 2013. — № 3. — С. 162-166.
13. Ramburrun P. et al. A review of bioactive release from nerve conduits as a neurotherapeutic strategy for neuronal growth in peripheral nerve injury / Ramburrun P., Kumar P., Choonara Y.E., Bijukumar D., du Toit L.C., Pillay V. // BioMed Research International. — 2014. — 132350.
14. Гацький О.О. Комбтована пластика периферич-них нервiв при ¡х великих дефектах (експериментальне
до^дження): Автореф. дис... канд. мед. наук: 14.01.05/ О.О. Гацький; НАМН Украти, 1н-т нейрохiрургii ш. А.П. Ромоданова. — К., 2015. — 23 c.
15. Achilleos A, Paul A. Trainor. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy / Achilleos A, Paul A. Trainor // Cell. Research. — 2012. — Vol. 22, № 2. — Р. 288-304.
16. Neil G. Fairbairn, Amanda M. Meppelink, Joanna Ng-Glazier, Mark A. Randolph, Jonathan M. Winograd. Augmenting peripheral nerve regeneration using stem cells: A review of current opinion // World J. Stem. Cells. — 2015. — Vol. 7, № 1. - P. 11-26.
17. Mii S. et al. Nestin-Expressing Hair-Follicle-Associated Pluripotent (HAP) Stem Cells Promote Whisker Sensory-Nerve Growth in Long-Term 3D-Gelfoam® Histoculture/Mii S., Duong J., Tome Y., Uchugonova Al., Liu F., Amoh Y, Saito N., Katsuoka K., Hoffman R.M. // Methods in Molecular Biology. - 2016. - № 1453. - P. 39-47.
18. Hoffman R.M. Introduction to Hair-Follicle-Associated Pluripotent Stem Cells/Hoffman R.M. //Methods in Molecular Biology. - 2016. - № 1453. - P. 1-5.
19. Hoffman Robert M. Nestin-expressing hair follicle-accessible pluripotent stem cells for nerve and spinal cord re-
pair / Hoffman Robert M. // Cells Tissues Organs. — 2014. — Vol. 200, № 1. — P. 42-47.
20. Vasyliev R.G. et al. Effects of Neural Crest-Derived Multipotent Stem Cells on Regeneration of an Injured Peripheral Nerve in Mice /R.G. Vasyliev, A.E. Rodnichenko, S.N. Sha-malo, A.S. Demidchouk, I.F. Labunets, Yu.B. Chaikovskii, GM. Butenko // Neurophysiology. — 2015. — Vol. 47, № 1. — P. 80-83.
21. Васильев Р.Г. Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2012. — Vol. 22, № 2. — С. 165-68.
22. Amoh Y. et al. Multipotent nestin-positive, keratin-negative hair-follicle-bulge stem cells can form neurons / Y. Amoh, L. Li, K. Katsuoka, S. Penman, R.M. Hoffman//Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. — 2005. — Vol. 102, № 15. — Р. 5530-5534.
23. Sieber-Blum M. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle / Sieber-Blum M., Grim M., Hu Y., Sze-der V. // Developmental Dynamics. — 2004. — Vol. 231, № 2. — P. 258-269.
Отримано 30.01.2018 ■
Цымбалюк В.И12, Петрив Т.И.2, Медведев В.В.1, ЦымбалюкЮ.В.2, Клименко П.П.34, Васильев Р.Г.34, Татарчук М.М.2
Национальный медицинский университет имени акад. А.А. Богомольца, г. Киев, Украина 2ГУ «Институтнейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины», г. Киев, Украина 3ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины», г. Киев, Украина 4 Биотехнологическая лаборатория ilaya.regeneration, медицинская компания ilaya®, г. Киев, Украина
Ранние результаты восстановления морфологической структуры седалищного нерва с использованием средств тканевой инженерии после его полного пересечения в эксперименте
Резюме. Актуальность. Травмы опорно-двигательного аппарата, даже незначительные, могут сопровождаться повреждением периферических нервов и приводить к частичной или полной потере функции конечностей. Количество таких пациентов с каждым годом растет в связи с увеличением количества техногенных травм и сложных сочетанных повреждений опорно-двигательного аппарата. Бурная урбанизация приводит к росту общего нейротравматизма в среднем на 2 % в год. В структуре травм опорно-двигательного аппарата повреждения периферических нервов составляют от 1,5 до 6 %, из них 90 % — верхней конечности. Во время военных действий этот показатель составляет 12 % и наблюдается у 2,8—5 % пациентов с политравмой. Цель: исследовать ранние результаты восстановления седалищного нерва крысы с использованием тканево-инженерного подхода после его полного пересечения в эксперименте. Материалы и методы. Сформированы 4 экспериментальные группы: группа 1 — пересечение седалищного нерва (невротомия) и немедленная аутонейропластика (п = 14); группа 2 — невротомия и немедленная пластика коллагеновой трубкой, заполненной фибриновым гелем (п = 15); группа 3 — невротомия и немедленная пластика коллагеновой трубкой, заполненной фибриновым гелем с содержанием мультипотентных стволовых клеток — производных нервного гребня (п = 16); группа 4 — ложнооперированные животные (п = 7). На 30-е сутки половину животных из каждой группы (1-я — п = 7, 2-я —
п = 7, 3-я — п = 7, 4-я — п = 3) выводили из эксперимента путем тракции за клювовидный конец и для светооптиче-ской микроскопии гистологический материал (седалищный нерв оперирован различными видами тканево-инженерных подходов, указанными выше) фиксировали в течение суток в 10% растворе нейтрального формалина, промывали образцы, обезвоживали в серии спиртов, заключали их в парафин и получали срезы толщиной 5 мкм на микротоме. Затем срезы депарафинизировали в ксилоле и импрегнировали азотнокислым серебром по методу Бильшовского, что позволяет визуализировать структурные элементы периферической нервной системы. Результаты. После пересечения седалищного нерва и аутонейропластики в имплантированном в зону повреждения тканево-инженерном проводнике на 30-е сутки на фоне усиленного разрастания волокнистой соединительной ткани наблюдалось формирование коротких тяжей нервных волокон, а также упорядочение их размещения. Кроме того, в регенерате формировались тонкие перемычки между участками нервных волокон, что приводило к образованию непрерывной связи между регенерирующими тяжами нервных волокон на разных уровнях зоны повреждения седалищного нерва. При применении полого коллагенового проводника, заполненного фибриновым гелем для замещения дефекта седалищного нерва, на 30-е сутки отмечалось формирование незначительного количества тонких, хаотично расположенных нервных волокон и слабо
выраженное формирование волокнистой соединительной ткани. При использовании тканево-инженерного проводника в этот же временной период происходило значительное разрастание нервных волокон, их гипертрофия и образование разветвлений нервных волокон, ориентированных в разных направлениях. Также при применении инженерного проводника отмечено более слабое формирование волокнистой соединительной ткани по сравнению с первой и второй экспериментальными группами. Выводы. В результате проведенного исследования установлено, что наибольшее сходство с архитектоникой седалищного нерва интактных животных имеет регенерат нервных волокон, образующийся при применении аутонейропластики. В этом регенерате образовывались участки нервных волокон, которые по своей архитектонике наиболее близко соответствовали нервным волокнам в нативном седалищном нерве. Кроме того, в области повреждения формировались тонкие отростки, связы-
вающие участки регенерирующих нервных волокон на разных уровнях. При этом наблюдалось усиленное разрастание волокнистой соединительной ткани. Наиболее выражено формирование нервных волокон, а именно гипертрофия нервных волокон и значительное их разветвление с формированием сетки, выявлено при применении тканево-инже-нерного проводника. При этом в тканево-инженерном проводнике на фоне гипертрофии регенерирующих волокон отмечено слабое формирование волокнистой соединительной ткани. Следовательно, для определения преимуществ одного из двух тканево-инженерных подходов, использованных для регенерации седалищного нерва, необходимо провести изучение результата процесса регенерации в более поздней временной точке.
Ключевые слова: седалищный нерв; тканевая инженерия; мультипотентные стволовые клетки-производные нервного гребня
V.I. Tsymbaliuk12, T.I. Petriv1, V.V. Medvedev1, Yu.V. TsymbaUuk2, P.P. Klymenko34,
R.G. Vasiliev34, M.M. Tatarchuk2
1Bogomolets National Medical University, Kyiv, Ukraine
2State Institution "Institute of Neurosurgery named after Academician A.P. Romodanov of the NAMS of Ukraine", Kyiv, Ukraine
3State Institution "Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the NAMS of Ukraine", Kyiv, Ukraine 4Biotechnology Laboratory ilaya.regeneration, Medical Company ilaya®, Kyiv, Ukraine
Early results of sciatic nerve morphologic structure recovery using tissue engineering methods
after its complete transection in experiment
Abstract. Background. Injuries of the musculoskeletal system, even insignificant, may be accompanied by damage to the peripheral nerves and lead to partial or complete loss of limb function. The number of such patients grows every year due to an increase in the number of industry-related injuries and complex combined injuries of the locomotor system. Urbanization leads to an increase in total nerve damage by an average of 2 % per year. In the structure of injuries of the musculoskeletal system, damage to the peripheral nerves is 1.5 to 6 %, of which 90 % are the upper extremity injuries. In military operations, this figure is 12 %, and is observed in 2.8— 5 % of patients with polytrauma. The purpose of our study was to investigate the early results of sciatic nerve recovery in rat using tissue engineering methods after its complete intersection in the experiment. Materials and methods. Four experimental groups were formed: group 1 — transection of the sciatic nerve (neurotomy) and immediate autoneuroplasty (n = 14); group 2 — neurotomy and immediate plasty with collagen tube filled with fibrin gel (n = 15); group 3 — neurotomy and immediate plasty with collagen tube filled with fibrin gel containing multipotent neural crest derived stem cells (n = 16); group 4 — sham operated animals (n = 7). On day 30, a half of the animals from each group (7, 7, 7 and 3 rats in groups 1, 2, 3 and 4, respectively) were excluded from the experiment by traction by the rostral end, and for optical microscopy, histopathologic sample (the sciatic nerve operated by various types of tissue-engineering approaches mentioned above) was fixed overnight in 10% neutral formalin solution, samples were washed, dehydrated in a series of alcohols, put in paraffin, and 5-^m sections on microtome were obtained. The sections were then deparaffinized in xylene and impregnated with nitrous oxide silver according to the Bilshovsky method, which allows visualization of the structural elements of the peripheral nervous system. Results. After the transection of the sciatic nerve and autoneuroplasty, in tissue-engineering conduit implanted in the damaged zone on day 30 against the background of increased growth of fibrous connective tissue, the formation of short
nerve fibers was noted, as well as the ordering of their placement. In addition, in the regenerate, thin junctions were formed between the sections of the nerve fibers, which led to the formation of a continuous connection between the regenerating strands of the nerve fibers at different levels of the sciatic nerve damage zone. When using hollow collagen conduit filled with fibrin gel to replace the defect of the sciatic nerve, the formation of a small number of thin, randomly located nerve fibers and a weakly expressed formation of fibrous connective tissue was observed on day 30. With the use of tissue-engineering conduit, in the same time period, there was a significant increase in nerve fibers, their hypertrophy and the formation of branches of nerve fibers oriented in different directions. Also, with the use of the tissue-engineered conduit, weaker fibrous connective tissue formation was noted compared with the first and second experimental groups. Conclusions. As a result of the study, it was found that a regenerate of nerve fibers, which is formed when using autoneuroplasty, has the greatest similarity to the architecture of the sciatic nerve of intact animals. In this regenerate, areas of nerve fibers were formed which, according to their architectontics, most closely corresponded to nerve fibers in the native sciatic nerve. In addition, in the area of damage, thin processes were formed that bind regions of regenerating nerve fibers at different levels. At the same time, there was an increased growth of fibrous connective tissue. The most pronounced formation of nerve fibers, namely, hypertrophy of nerve fibers and their significant branching with the formation of a mesh, was revealed when using tissue-engineering conduit. At that, in the tissue-engineering conduit, under the background of hypertrophy of regenerating fibers, weak formation of a fibrous connective tissue was noted. Therefore, to determine the benefits of one of two tissue-engineering approaches used to regenerate the sciatic nerve, it is necessary to study the result of the regeneration process at a later time point.
Keywords: sciatic nerve; tissue engineering; multipotent neural crest derived stem cells
