CC BY
28
УДК: 616-018.74-008.7
ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ СТРЕПТ030Т0ЦИН-ИНДУЦИР0ВАНН0Й ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ У КРЫС
А.И. Маяков1 М.В.Покровский2 Т.Г. Покровская2 A.C. Белоус2 АААрустамова1
Эндотелиальную дисфункцию моделировали посредством билатеральной овариэктомии самок, крыс линии Wistar и в течение 6 недель добавлением в корм фруктозы, удельный вес которой составляет 6о% от общего рациона, а также внутривенным введением стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг, однократно в течение 5 суток. При этом степень развития эндоте-лиальной дисфункции оценивали по коэффициенту эндотелиальной дисфункции, а формирование метаболических нарушений по изменению уровня гликемии в оральном тесте толерантности к глюкозе. Данная модель может быть использована для оценки фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции при воспроизведении метаболических нарушений у крыс.
М.В. Корокин2 О.С. Гудырев2 М.В.Маякова2
1)Белгородский
государственный
университет
2)Курский государственный медицинский университет
Ключевые слова: эндотелиальная дисфункция, стрептозотоцин, фруктозеодержащая диета, метаболические нарушения, инсулинорези-стентность.
e-mail: [email protected]
Введение. Сахарный диабет (СД) является одной нз наиболее актуальных проблем здравоохранения многих стран [у, 8, 21]. Каждые 10-15 лет число больных СД удваивается [и, 19]. При СД нарушаются большинство видов метаболизма и в разной степени поражаются многие ткани и органы. Развитие СД приводит к появлению серьезных осложнений, являющихся причиной инвалидности и высокой смертности. Артериальная гипертония (АГ) и эндотелиальная дисфункция (ЭД), которая отмечается у 8о% пациентов с СД, является самостоятельными фактороми, оказывающим непосредственное влияние на развитие и прогрессирование микроваскулярной патологии [3,12,15]. Общность метаболических расстройств, возникающих при СД, ЭД и АГ, способствует отягощению течения осложнений каждой патологии в отдельности. Инсулинорезистентность (ИР) и, как следствие, компенсаторная гиперинсулинемия, имеющая место у подавляющего большинства пациентов с СД, ведет к росту симпатической активности с увеличением сердечного выброса и повышению общего периферического сопротивления сосудов, пролиферации гладкомышечных клеток сосудов, росту внутриклеточного содержания Na и Ca, что сопровождается формированием ЭД и усугублением АГ [13, 14]. Предотвращение развития и дальнейшего прогрессирования микроваскулярной патологии диктует необходимость поиска новых звеньев патогенеза и возможных факторов, влияющих на пути их формирования.
Целью настоящего исследования явилось изучение стрептозотоцин - индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Методика исследования. Опыты проводились на 30-ти половозрелых белых самках линии Wistar массой 250-300 г. В первый день эксперимента у самок под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) хирургическим путем вскрывали брюшную полость и удаляли оба яичника. В дальнейшем на протяжении 6 недель в корм животных добавляли фруктозу, удельный вес которой равен 6о% от общего рациона пищи. На 6-ой неделе эксперимента в вену хвоста в течение 5 суток вводили стрептозотоцин в дозе 45 мг/кг, однократно. Еженедельно, однократно, в утреннее время, натощак, в течение всего срока эксперимента измеряли уровень глюкозы в крови, взятой из вены хвоста животных, при помощи глю-кометра Satellit Plus (Россия). На 6-й неделе эксперимента проводился тест толерантности к глюкозе, натощак, путем орального введения глюкозы (l мг/кг) и регистрации
уровня глюкозы на протяжении 120 минут при помощи глюкометра Satellit Plus (Россия). В течение кормления еженедельно измеряли показатели артериального давления с использованием неинвазивного датчика измерения кровяного давления у мелких животных на хвосте D0C-NIBP200A, производства Biopac System, Inc., США. На 42-й день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в правую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в левую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика TSD104A аппаратно-программного комплекса МРюо, производства Biopac System, Inc., США. Проводили следующие функциональные сосудистые пробы - эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВ) с внутривенным введением ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг и эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНЗВ) с внутривенным введением нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг. Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющее собой отношение площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП (ЭНВД) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ (ЭЗВД) [4].
Результаты подвергали статистической обработке путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±т) и оценки достоверности различий сравниваемых параметров с использованием t-test для групп с равной дисперсией, уровень значимости р<0,05.
Результаты исследования. Экспериментальные исследования проводили на следующих группах животных: интактные (И) - животные, у которых проводилась ложная операция (вскрытие брюшной полости с последующим ушиванием); животные с билатеральной овариэктомией (БО), получавших обычный пищевой рацион; животные с билатеральной овариэктомией, которым давалась фруктозсодержащая диета и на 6-ой неделе эксперимента внутривенно вводился стрептозотоцин (БОФС). Измерение уровня глюкозы натощак на протяжении 6 недель не выявило изменения значений в первых двух из указанных выше групп животных относительно нормальных показателей. В группе БОФС данный показатель был достоверно выше и составил в среднем и,1±1,з ммоль/л.
При проведении теста толерантности к глюкозе на 6-ой неделе эксперимента, наблюдался стойкий уровень гликемии к 120 минуте в группе БОФС относительно групп И и БО, этот показатель был достоверно выше и составил 13,7±о,7 ммоль/л. В группе И и БО таковые значения глюкозы крови приближались к исходным на 120 минуте и составляли - 4,8±о,2 и 4,6±1,2 ммоль/л соответственно (рис. 1).
При проведении исследований на наркотизированных животных с инвазивным определением параметров гемодинамики получили следующие данные: болюсное внутривенное введение АХ в течение 3-5 сек приводило к резкому падению артериального давления, достигающего пика у ложнооперированных животных (для систолического артериального давления (САД) 84,з±4,4, для диастолического артериального давления СДАД) - 38,7 ± 2,8 и для среднего артериального давления (СрАД) 53,9±2,7 мм рт. ст.). При этом в течение первых 2-3 сек развивалась резкая брадикардия до 130-150 ударов в минуту. Восстановление АД происходило в среднем за 42,2±о,8 сек. после нормализации сердечного ритма. ЭНЗВ также характеризовалась снижением САД до 83,0 ±3>7> ДАД ДО 42,1±4,4 и СрАД до 55,7±3>5 мм рт.ст. с последующим полным восстановлением в среднем в течение 45,1±1,о сек.
У животных с билатеральной овариэктомией, получавших обычный рацион, через 6 недель отмечалось достоверное увеличение цифр АД: САД - 160,0 ± 6,2; ДАД - 124,9 ± 5,5; СрАД - 135,9 ± 5>о мм рт. ст. по сравнению с интактной группой животных. ЭЗВ и ЭНЗВ характеризовались достоверно меньшим снижением.
16 п
2 -
0 Н-1-1-1-1-1-1-
0 10 20 30 6 0 90 120
м ин
Рис. 1. Динамика уровня глюкозы плазмы крови крыс в пероральном тесте толерантности
глюкозы на 6-й неделе эксперимента На рисунке изображено:
--- - группа животных с билатеральной овариэктомией, получавших фруктозсодержа-щую диету и внутривенное введение стрептозотоцина;
-■- - группа животных с билатеральной овариэктомией, получавших обычный рацион; -❖- - интактная группа.
Измерение уровня среднего артериального давления неинвазивным способом выявило достоверное его повышение в группах БО и БОФС, по сравнению с интактны-ми животными начиная с 4-ой недели развития патологии, и составило на 6-ой неделе 159,5±4>6 и 178,6±4,5 мм рт.ст. соответственно (табл. 1).
Таблица 1
Динамика уровня среднего артериального давления, определяемого неинвазивным способом, при моделировании стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции (п=ю, М±ш, мм рт.ст.)
Группы животных 1нед. 2 нед. Знед. 4 нед. 5 нед. 6 нед.
Интактные (И) 136,7±3,4 136,6±3,4 136,9±3,6 136,8±3,5 136,9±3,6 137,1±3,6
Билатеральная овариэк-томия (БО) 135,8±3,3 141,2±3,9 147,4±4,1* 153,9±4,4* 157,1±4,2* 159,5±4,6*
Билатеральная овариэк-томия + Фруктозсодержащая диета + Стрептозо-тоцин (БОФС) 135,1±3,1 141,3±4,1 148,5±4,8* 154,7±3,5* 162,3±4,4* 178,6±4,5*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных.
Ежедневное, однократное, внутривенное введение стрептозотоцина в течение 5 суток и фруктозсодержащая диета на фоне гипоэстрогении спустя 6 недель вызывало значимую артериальную гипертензию (САД - 175,1±з,7, ДАД - 123,7±6,1, СрАД -149,4±5,2 мм рт. ст.) и приводила к меньшему снижению показателей АД после введения АХ (САД до 85,2±2,7, ДАД до 5б,4±4,8, СрАД до 70,8±2,7 мм рт. ст.) и НП (САД до 9б,1±9,4, ДАД до 53,4±5,3 и СрАД до 74,7±4,7 мм рт. ст.) по сравнению с интактными животными и животными с билатеральной овариэктомией, получавших обычный рацион. Восстановление АД при введении АХ и НП происходило в среднем за 37,7±4,4 сек и 105,1±10,4 сек после нормализации сердечного ритма соответственно (табл. 2).
Таблица 2
Показатели, отражающие степень эндотелиальной дисфункции на фоне стрептозотоцин-индуцированной модели (п=10, М±ш)
Группы животных Функциональные пробы Прирост падения сосудистой реакции по СрАД (мм рт.ст.) Время сосудистой реакции (сек.) Площадь сосудистой реакции (усл. ед.) Отношение площадей сосудистой реакции АХ к НП
Интактные (И) АХ 59,9±2,9 42,2±0,8 12б8,0±74,8 1,1±0,1
НП 61,0±3,0 45,1±1,0 1375,3±93,7
Билатеральная овариэктомия (БО) АХ 67,8±7,3 33,0±5,4 1022,5±131* 2,1±0,2*
НП 70,0±6,0 4б,0±4,5 2157,3±1б7*
Билатеральная овариэктомия + Фруктозсодержащая диета + + Стрептозотоцин (БОФС) АХ 70,8±2,7 37,7±4,4 1312,2±237,2 2,8±0,2**
НП 74,7±4,7 105,1±10,4 3б74,1±б42,1
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных;
** - р<0,05 в сравнении с группой животных, у которых проводилась билатеральная овариэктомия и получавших обычный пищевой рацион.
> ь^ии ' - - ел
I л. ^.тжг^,* ъ*.
Интеграл сосудистой реакции САД на ацетилхолин и нитропруссид
Интеграл сосудистой реакции ДАД на ацетилхолин и нитропруссид
:-
■- ■■■■ ................ ТВД1Ч |ЧЦиГ*'.Т1 * ^ _ 1 1 ||1й1 и.....
'1 п Г 1
Рис. 2. Показатели сосудистой реакции у интактных животных
Значения КЭД составили: 1,1±0,1 - в группе интактных животных, 2,1±о,2 - в группе животных с билатеральной овариэктомией, получавших обычный пищевой рацион, а в группе животных с билатеральной овариэктомией, которым проводилась фруктозсодержащая диета и внутривенно вводился стрептозотоцин, - 2,8±о,2, что достоверно больше в сравнении с вышеуказанными группами (рис. 2, з, 4).
Обсуждение. Известно, гипоэстрогения, которая возникает в менопаузе, играет роль пускового фактора в развитии комплекса тесно связанных между собой метаболических нарушений [2, 4, ю]. Это позволило ряду авторов предложить для обозначения этого состояния термин "менопаузальный метаболический синдром" [15,17,18]. Он включает в себя:
1. Развитие дислипопротеинемии, которая определяет до 30% заболеваний сердечно-сосудистой системы в постменопаузе. В этот период происходит дисбаланс между атерогенными липопротеинами (липопро-теинами низкой плотности — ЛПНП) и антиатерогенными липопротеинами (липопротеинами высокой плотности — ЛПВП), что активирует атерогенез в артериальной стенке.
2. Развитие инсулинорезистентности и гиперинсулинемии является одним из патогенетических механизмов менопаузального метаболического синдрома. Параллельно развитию гипоэстрогенемии происходит снижение чувствительности периферических тканей к инсулину, с формированием резистентности, что ведет к повышению его уровня в крови. Следствием чего может быть развитие сахарного диабета II типа. Инсулинорезистентность оказывает неблагоприятное влияние на эндотелий сосудов, активирует пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток, процесс липо-генеза в сосудистой стенке, угнетает процессы фибринолиза, ведет к повышению артериального давления вследствие резистентности сосудов, негативно влияет на распределение жировой ткани.
j^uuLLjusiui ui»iriajtfd
Рис. 3. Показатели сосудистой реакции у животных, которым проводилась билатеральная овариэктомия
При этом многие женщины подходят к периоду менопаузы с имеющимися заболеваниями эндокринной системы [5]. Коморбидность климактерического синдрома и заболеваний эндокринной системы, в том числе развивающийся инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), создает условия для возможного взаимоотягощения, маскировки клинических проявлений заболеваний или изменения течения основного эндокринного заболевания как самого по себе, так и на фоне лечения.
Как известно, инсулинзависимый сахарный и экспериментальный диабет (стреп-тозотоцин-индуцированный диабет, мыши линии NOD, С57В1, ВВ-крысы) является аутоиммунным заболеванием, с прогрессирующей деструкцией b-клеток и развитием абсолютной инсулиновой недостаточности [ю, 13].
Ямамото и соавторы продемонстрировали, что в обработанных стрептозотоцином островковых клетках поджелудочной железы ингибирование ПАРП з-аминобензамидом предотвращает падение уровня НАД и подавление проинсулинового синтеза без изменения уровня повреждений ДНК. Основываясь на этих наблюдениях, логично предположить, что образование единичных разрывов ДНК, вызванных генерацией N0 и перокси-нитрита, лежит в основе активации ПАРП и последующего повреждения островковых клеток в ответ на действие стрептозотоцина. В соответствии с этим островковые клетки, полученные из дефицитных по гену ПАРП мышей, в сравнении с островковыми клетками дикого типа устойчивы к повреждениям, вызываемым N0- и генераторами пероксинит-рита [6,16].
Проведенные исследования показали также, что ПАРП вовлекается в различные типы других локальных или системных воспалительных состояний. В моделях, связанных с экспрессией изоформ ЫО-синтаз и продукцией пероксинитрита, ингибирование ПАРП 3-аминобензамидом приводят к утрате способности кровеносных сосудов реагировать на вазоконстрикторные агенты (васкулярная гипореактивность), миокардиальной дисфункции и ослабляет внутриклеточные энергетические процессы, что заканчивается многочисленными органическими повреждениями. Эксперименты на грызунах показали, что активация ПАРП играет важную роль в патогенезе сосудистой недостаточности и клеточной энергетической дисфункции - эндотелиальной дисфункции [20].
Рис. 4. Показатели сосудистой реакции стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции
В результате настоящего исследования выявлено достоверное повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции, отражающего степень развития дисфункции эндотелия, в группе животных с билатеральной овариэктомией, которым проводилась фруктозсодержащая диета и вводился стрептозотоцин, по сравнению с группой интактных животных. Оценка метаболических нарушений по изменению уровня гликемии к 120-й минуте в оральном тесте толерантности к глюкозе выявило формирование гипергликемического ответа в этой же группе животных по сравнению с другими исследуемыми группами.
Таким образом, стрептозотоцин-индуцированная модель развития эндотелиальной дисфункции на фоне воспроизведения метаболических нарушений может быть использована для оценки фармакологической коррекции.
Литература
1. Балаболкин, М.И. Лечение сахарного диабета и его осложнений / М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская. — М.: Медицина, 2005. — 512 с.
2. Вихирева, О.В. Артериальная гипертензия: проблемы и решения / О.В. Вихирева // Международный медицинский бюллетень. - 2003. - № 15. - С. 17.
3. Галенок, ВА. Тер. Архив. / В.А. Галенок, Е.А. Жук //Терапевтический Архив. - 1995. -№ 12. -С.80-84.
4. Дедов, И.И. Эндокринология / И.И. Дедов, И.А. Абугова, М.Ш. Шамхалова // Пробл. эндокринол. - № 4. - С.43-48.
5. Дедов, И.И. Кардиоренальный синдром при сахарномдиабете 1-го типа: роль дисфункции эндотелия. / И.И. Дедов, А.А. Александров, М.В. Шестакова // Kardiologia. - 2005. -№ 6. - С. 35-41.
6. Дзяк, Г.В. Вплив дефщиту естрогешв та замшно! гормонально! терапИ на функцю серцево-судинно у системи / Г.В. Дзяк, З.М. Дубоссарська // ПАТ. - 1999. - № 2. - С. 77-81.
7. Маяков, А.И. Эндотелиальная дисфункция на фоне фруктоз-индуцированной модели метаболических нарушений у крыс / А.И. Маяков, Т.Г. Покровская, М.В. Покровский // XVII Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство». Сборник материалов конгресса. -М. - 2010. - С. 676-677.
9. Маяков, А.И. Фруктоз-индуцированная модель эндотелиальной дисфункции у крыс / А.И. Маяков, К.А. Шуклина, В.Ю. Цепелев // Материалы 74-й межвузовской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых: Молодежная наука и современность, посвященной Году молодежи в России. 21-22 апреля 2009 года. В 3-х частях. Часть II. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ. - 2009. - С. 193.
10. Патент С 22301015 RU А 61 В5/02. Способ оценки эндотелиальной дисфункции / Покровский М.В., Покровская Т.Г., Кочкаров В.И. // № 2005113243/14; Заявл. 04.05.2005/17 Изобретения (Заявки и патенты). - 2007. - №17.
11. Покровский, М.В. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская // Российский журнал иммунологии. - М. -2006. - Т. 9. - С. 60-61.
12. Покровский, М.В. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская // Кубанский научно-медицинский вестник. - Краснодар. - 2006. - №10. - С.72-77.
13. Профилактика сахарного диабета: Доклад исследовательской группы ВОЗ. (Сер. техн. докл. ВОЗ 844) - Женева, 1995.
14. Bersofsky, J.A. Intrinsic and extrinsic factors in protein antigenic structure / J.A. Bersof-sky. Science. - 1985. - V. 229. - Ш4717. - P. 939-940.
15. Golay, A. Effect ofobesity on ambient plasma glucose, free fatty acid, insulin, growth hormone, andglucagon concentrations / A. Golay, A.L.M. Swislocki, Y.D.I. Chen, J.B. Jaspan et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1986. - №63. - P.481-484.
16. Meredith, I.T. Role of impaired endotheliuin-dependent vasodilatioii in iscnemic manifestations ot coronary artery disease / I.T. Meredith, A.C. Yeung, F.F. Weidinger et al. // Circulation. -1993. - №87 (S.V). - P. 56-66.
17. Schiffrin, E.L. Angiotensin II Receptor antagonists Eds. M. Epstein, H.R. Brunner / E.L. Schiffrin, D. Hayoz // Philadelphia: Hanley Belfus INC. - 2001. - P.279- 289.
18. Stratton, I.M. Endothelium dusfunction: endocrinology deaseas / I.M. Stratton, A.L. Adler, H.A. Neil et al. // BMJ. —2000. —V. 321. —P. 405—412
19. Ubink-Veltman, L.J. Prevalens, incidence and mortality of type 2 diabetes mellitus revisited: a prospective populacion-based study in the Netterlands (ZODIAC-1) / L.J. Ubink-Veltman, H.J. Bilo, K.H. Groenier et al. // Eur JEpidemiol. - 2003. - №18(8). - P. 793-800.
REPRODUCTION OF THE STREPTOZOTOTSIN-INDUCED ENDOTHELIAL
DYSFUNCTION AT RATS
A.I.Mayakov1
M.V.Pokrovsky2
T.G.Pokrovskaya2
A.S.Belous2
AAArustamova1
M.V.Korokin2
O.S.Gudyrev2
M.V.Mayakova2
1) Belgorod State University
2) Kursk State Medical University
e-mail: [email protected]
Endothelial dysfunction modelled by means of bilateral ovariectomy females, rats of line Wistar and within 6 weeks addition in the fructose forage which specific gravity makes 60 % from the general ration, and also intravenous introduction streptozototsin in a dose of 45 mg/kg, unitary within 5 days. Thus degree of development of endothelial dysfunction estimated on factor of endothelial dysfunction, and formation of metabolic disturbances on change of level of a glycemia in an oral glucose loading. The given model can be used for an estimation of pharmacological correction of endothelial dysfunction at reproduction of metabolic disturbances at rats.
Key words: endothelial dysfunction, streptozototsin, fructose diet, metabolic disturbances, insulin resistance.
