CC BY
82
ВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ ПРИРОДА ДИВЕРТИКУЛОВ ТОЛСТОЙ КИШКИ ё
Б >
2 о
So 1_ ° OS
ое
щ а I- и Id
тш » ^
Q го
о|
L
IS
2 5
й
Потапова В. Б.1, Гудкова Р. Б.1, Левченко С. В.
1 Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии, Москва ®
2 ФПДО Московского государственного медико-стоматологического университета ¡Е
о ш
Левченко Светлана Владимировна, к. м.н., ассистент кафедры терапии, гериатрии га
и апитерапии ФПДО МГМСУ ш
Тел. (495) 304-30-36 Н
E-mail: sv [email protected]
резюме
На основании морфологического и иммунологического исследования биоптатов толстой кишки у больных с дивертикулезом выявлено, что микроскопический воспалительный процесс в области устья дивертикула характеризуется рядом особенностей, которые включают избыточную пролиферацию эпителия, преобладание макрофагальной реакции в развитии иммунного ответа, повышенную клеточную адгезию и необычное соотношение экспрессии цитокинов и других регуляторных молекул. Доказано, что дивертикул представляет собой локальное изменение стенки, без тенденции к генерализации. Изменения структуры ткани в области сформированных дивертикулов связаны с нарушением регуляции многих процессов тканевого метаболизма и формообразования. К ним относятся дисрегу-ляция клеточного обновления эпителия (повышенный уровень пролиферации эпителиоцитов и угнетение апоптоза), деградация компонентов межклеточного матрикса, умеренная сосудистая реакция. Все эти процессы протекают на фоне особой формы иммунных механизмов защиты и адаптации.
summary
On the basis of morphological and immunological study of biopsies of the colon in patients with diverticulo-sis was revealed that microscopic inflammation of the mouth of the diverticulum is characterized by several features that include excessive proliferation of the epithelium, the predominance of macrophage reaction in the development of the immune response, increased cell adhesion and unusual ratio between the expression of cytokines and other regulatory molecules. Changes in the structure of the formed diverticula tissue are associated with dysregulation of many processes of tissue metabolism and morphogenesis. These include the dysregulation of cell renewal of the epithelium (increased level of proliferation of epithelial cells and inhibition of apoptosis), degradation of extracellular matrix components, moderate vascular reaction. All these processes take place on the background a particular form of immune protection and adaptation mechanisms.
введение
Дивертикулы (ДВК) кишечника представляют собой грыжеподобные выпячивания слизистой оболочки или всех слоев стенки кишки. Образование ДВК лежит в основе развития дивертикулярной болезни (ДвБ), которая протекает бессимптомно не только на этапах формирования единичных, но нередко и при наличии множественных ДВК. Развитие ДвБ связывают с такими общими изменениями в стенке кишки, как миопатия, сопровождающаяся дистрофией и атрофией клеток мышечной пластинки, гипоплазия волокнистой стромы, дисцир-куляторные проявления. Эти процессы приводят
к потере эластичности ткани и ослаблению сопротивления стенки кишки к изменению внутрипрос-ветного давления [1; 2]. Вместе с тем образование ДВК — это нарушение строения стенки кишки на ограниченном участке, т.е. локальный процесс, обусловленный дисрегуляцией местных межтканевых взаимодействий и клеточных реакций. В предыдущих работах нами выявлены дистрофические и реактивные процессы в слизистой оболочке сигмовидной кишки в области ДВК, которые имели местное значение. Особое внимание обращалось на диспропорцию в активации иммунокомпетентных
о m
клеток и пролиферацию эпителия [3-5]. Однако механизмы, лежащие в основе медленно прогрессирующих изменений в течении ДвБ с возможным развитием осложнений, остаются неясными и требуют дальнейших исследований. В связи с этим задача настоящей работы — определить характер и значение выраженности воспалительных процессов, развивающихся в слизистой оболочке сигмовидной кишки при дивертикулезе.
материал и методы исследования
Проведено морфологическое и иммунологическое исследование слизистой оболочки толстой кишки у 43 больных ДвБ (мужчин — 11, женщин — 32; среди которых 16 больных в возрасте от 30 до 63 лет (53,6 ± 7,2 года) и 27 больных от 65 до 77 лет (71,9 ± 2,8 года). Диагноз ДвБ поставлен на основании клинического и рентгенологического исследований. Для морфологического анализа образцы ткани получены из неизмененной слизистой оболочки сигмовидной кишки во время диагностической ко-лоноскопии (22 биоптата взяты из устья ДВК, а 6 — вдали от ДВК). Образцы ткани вне ДВК получены также из ректосигмоидной области — 9 случаев и из стенки прямой кишки — 6. Ткань фиксировали 2%-ным глутаровым альдегидом и 1%-ным раствором четырехокиси осмия (рН 7,2-7,4), обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Для выявления гликозаминогликанов (ГАГ) проводили гистохимическую реакцию с рутением красным. Полутонкие и ультратонкие срезы просматривали при оптическом увеличении 240, 600 и 10 000. Пролиферацию эпителиоцитов, активацию эндотелиальных клеток, состояние перикриптальных миофибробла-стов оценивали в баллах (от 1 до 3). Количество лимфоцитов, макрофагов, плазмоцитов и крипт производили в 5 полях зрения при увеличении 240. В гомогенатах биоптатов иммуноферментным методом определяли IL-16, TNF-a, IL-8, IL-4, IFN-y Biosource International. В сыворотке крови иммуноферментным методом определяли изотипы IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 («Вектор Бест», РФ).
результаты исследования
Морфологическое исследование биоптатов сигмовидной кишки показало, что слизистая оболочка в области устьев ДВК отличается широким диапазоном структурных изменений различной степени выраженности, что позволило разделить больных на две группы. У всех больных в поверхностном эпителии представлены каемчатые и бокаловидные клетки в произвольных соотношениях. В каемчатых клетках выявляются вакуолизация цитоплазмы, кариопикноз, нарушение межклеточных соединений и связи с базальной мембраной, что отражает развитие дистрофического процесса.
Изменения охватывают небольшие группы колоно-цитов. Бокаловидные клетки увеличены в размерах и содержат неравномерно окрашенный слизистый секрет, характеризующий нарушение химизма вырабатываемой слизи.
Отличительной особенностью у 17 из 22 больных (77,2%) является выраженная пролиферация эпителиальных клеток (2-3 балла) (табл. 1).
У больных старше 65 лет регенерация эпителия толстой кишки в области устья дивертикула была выявлена у 11 из 14 (78,5%). При этом преобладала высокая степень выраженности пролиферативного процесса у 8 из 11 больных (72,7%). Об изменении локальной иммунной реакции судили по активации макрофагов и усилению адгезии иммуноком-петентных клеток. Установлено, что при этом выраженность макрофагальной реакции выявлялась у 11 из 14 (78,5%) больных и была резко усилена у 10 (90,9%). Проявление иммунной реакции опосредовано также повышением степени адгезии у 13 из 14 больных (92,9%). При этом у 6 из 13 (45,1%) усиленная адгезия проявлялась в наибольшей степени. Клеточные ассоциации включали преимущественно лимфоциты и плазматические клетки и в меньшей степени — макрофаги. Во многих случаях в состав клеточных комплексов входили эритроциты. Выявленные изменения отражают процессы, определяющие проявления реакций врожденного иммунитета. Следует отметить, что у больных в области формирующихся дивертикулов при высокой степени активации иммунной системы выявлена выраженная пролиферация эпителиальных клеток с распространением низкодифференцированных эпителиоцитов в поверхностный отдел слизистой оболочки.
Этот процесс отмечается по всей длине крипт, где наряду с дифференцированными колоноцитами на базальной мембране расположены мелкие клетки с относительно крупным ядром и небольшой цитоплазмой. Количество мелких клеток существенно преобладает. Подсчет клеточных ядер в поперечных сечениях крипт показал, что соотношение дифференцированных и недифференцированных эпителиоцитов составляет 8-10 к 20-25. По мере приближения к поверхности слизистой оболочки увеличивается количество низкодифференцированных клеток, которые в устье ДВК образуют многоклеточные массивы (рис. 1).
Базальная мембрана эпителия в этих участках разрушена, в связи с чем такие массивы выходят за пределы устьев, заполняя значительное пространство в субэпителиальной области. Большинство клеток имеют полигональную форму и ядро с мелкодисперсным хроматином. Характерной чертой эпителиоцитов в таких многоклеточных структурах является наличие межклеточных соединений в виде отростков поверхности, что является фундаментальным признаком нормального эпителия (рис. 2).
Однако среди них встречаются клетки с кари-опикнозом, а также «темные» клетки с плотной
Рис. 1. Многоклеточный массив низкодифференцирован-ных клеток в устье дивертикула. Ув. 240.
Рис. 2. Межклеточные соединения в виде отростков поверхности эпителиоцита, что является фундаментальным признаком нормального эпителия. Ув. 10 000.
бесструктурной цитоплазмой. Такие эпителиоци-ты с дистрофическими изменениями сохраняют связь с себе подобными и нормальными соседними клетками.
Собственная пластинка слизистой оболочки вблизи ДВК характеризуется неоднородной плотностью межклеточного матрикса (ММ), что отражает разную степень обводнения ткани, связанного с белками-ферментами и углеводами. Гликозаминогликаны (ГАГ) распределены неравномерно в виде скоплений мелких глыбок, связывающих рутений. Скопления
ГАГ часто соединены с тонкими коллагеновы-ми фибриллами. В зонах выраженной отечности уменьшено количество фибробластов, что сочетается с обеднением ткани коллагеновы-ми волокнами. Эти структуры представлены в виде рыхлой сеточки, состоящей из тонких переплетающихся фибрилл
Перикриптальные миофибробласты/фи-бробласты (Мфбл/Фбл) плотно прилежат к базальной мембране крипт, повторяя их контур. Одни из этих клеток характеризуются довольно крупными размерами, содержат овальное ядро с мелкодисперсным хроматином, что свидетельствует об их активации. Другие Мфбл/Фбл имеют небольшие размеры, уплощенную форму, плотную цитоплазму и пикнотичное ядро, что отражает разные стадии их дистрофии и гибели. Сосудистая реакция выражена неравномерно в разных участках субэпителиальной области и в собственной пластинке в целом. Вблизи крипт встречаются участки сосудистой сети с резким расширением капилляров и венул, часто наблюдаемых при воспалительной реакции. Однако в просвете содержатся единичные форменные элементы (рис. 3).
Эндотелиальные клетки в стенке таких сосудов немногочисленны и уплотнены. В нерасширенных микрососудах эндотелиоциты увеличены в размерах, выбухают в просвет. Их ядро имеет овальную форму и содержит мелкодисперсный хроматин, что отражает состояние активации клетки. Подтверждают воспалительный процесс обнаруженные нередко вблизи таких сосудов небольшие экстравазаты — группы эритроцитов, не отличающихся по форме и оптической плотности от эритроцитов, находящихся в просвете сосудов.
Преобладающими клеточными формами в слизистой оболочке вблизи ДВК являются иммунокомпе-тентные клетки. Самой многочисленной популяцией среди них являются макрофаги (Мф) (рис. 4).
Лимфоциты (Лф) и плазматические клетки обнаруживаются в небольшом количестве. Дендритные клетки выявлены в 20% случаев. Среди Мф выявлены клетки различных размеров. Активированные Мф — это крупные клетки с широкими недлинными выростами поверхности и плотными полиморфными гранулами в цитоплазме, количество которых достигает 10 и более (табл. 2).
У больных в возрасте моложе 65 лет в 50% случаев выявлен регенераторный процесс в эпителии. У всех этой подгруппы была высокая степень выраженности регенерации. В этих условиях иммунная реакция с активацией макрофагов обнаружена у 6 из 8 больных (75%), при этом степень ее выраженности в большинстве случаев была низкой (62,5%). Это проявлялось меньшим количеством клеток, образующих ассоциации. Адгезия иммунокомпетентных клеток определялась у всех больных, но степень выраженности была низкой у 6 из 8 (75%). Следует отметить, что в более молодой возрастной группе только у части
Б >
¡2 о
5 о 1_ ° ОЯ
<5 ое
щ о И и
11э
тш
0 го а! и га
I.
17
га
й <и Т 5 I-0 <и с га
-
ш
I-
ВЫРАЖЕННОСТЬ РЕГЕНЕРАЦИИ ЭПИТЕЛИЯ ТОЛСТОЙ КИШКИ И ЛОКАЛЬНОЙ ИММУННОЙ РЕАКЦИИ В ТКАНИ УСТЬЯ ДИВЕРТИКУЛА У БОЛЬНЫХ СТАРШЕ 65 ЛЕТ
№ Возраст (лет) Пролиферация эпителия (баллы) Активация макрофагов (баллы) Усиление адгезии (баллы)
1 77 3 3 2
2 68 2 2 1
о 5 3 74 3 2 1
4 75 3 3 2
5 68 3 3 2
5 6 70 3 3 1
* 7 71 0 0 0
8 68 3 2 2
9 77 2 0 1
10 73 0 0 1
11 75 1 1 1
12 70 1 3 2
13 72 0 3 2
14 69 1 2 1
Выявлено: 11/14 (78,5%) 11/14 (78,5%) 13/14 (92,9%)
Высокая степень 8/11 (72,7%) 10/11 (90,9%) 6/13 (46,1%)
Низкая степень 3/11 (27,2%) 1/11 (9,9%) 7/13 (53,2%)
Таблица 2
ВЫРАЖЕННОСТЬ РЕГЕНЕРАЦИИ ЭПИТЕЛИЯ ТОЛСТОЙ КИШКИ И ЛОКАЛЬНОЙ ИММУННОЙ РЕАКЦИИ В ОБЛАСТИ УСТЬЯ ДИВЕРТИКУЛА У БОЛЬНЫХ МОЛОЖЕ 65 ЛЕТ
№ Возраст (лет) Пролиферация эпителия (баллы) Активация макрофагов (баллы) Усиление адгезии (баллы)
1 38 2 0 1
2 58 3 1 1
3 63 0 0 1
4 59 0 1 1
5 62 0 1 3
6 64 0 1 1
7 30 3 2 2
8 55 3 1 1
Выявлено: 4/8 (50%) 6/8 (75%) 8/8 (100%)
Высокая степень 4/8 (50%) 1/8 (12,5%) 2/8 (25%)
Низкая степень 0/8 (0%) 5/8 (62,5%) 6/8 (75%)
больных выявлена высокая степень регенерации эпителия, однако проявление иммунного ответа у них развивается медленно, что может быть связано с незначительным изменением рецепторного профиля иммуноцитов в этих условиях.
В устьях ДВК в большинстве случаев (59% — в 13 из 22) активация Мф совпадает с избыточной пролиферацией эпителия. В случаях со слабой или не обнаруженной пролиферацией эпителия реакция
Мф выражена в меньшей степени (%). Среди Лф встречаются клетки разных размеров: обычных (Т-хелперы, В-лф), больших (ЕКК) и малых (В-лф). Многие плазматические клетки имеют небольшие размеры и нарушенную структуру ядерного хроматина, что указывает на сниженную синтетическую и секреторную активность. Практически во всех случаях с избыточной пролиферацией эпителия отмечается повышенная адгезия
Б >
2 о
5 о
|_ °
ОЯ
<5
щ а
I- и
11э
тш » ^
0 го а|
и га ь
17
га
й <и Т 5 I-0 <и с га
-
ш
I-
Рис. 3. Сосудистая реакция в собственной пластинке при воспалительной реакции в виде расширения капилляра с единичными форменными элементами в просвете. Ув. 600.
Рис. 4. Большое количество макрофагов с плотными включениями и плазмоцитов в слизистой вблизи устья дивертикула при воспалительной реакции. Ув. 600.
Таблица 3
СОДЕРЖАНИЕ ИЗОТИПОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА О: 1С О1, 1С О2, 1С О3, 1С О4 В СЫВОРОТКЕ БОЛЬНЫХ ДВК
Показатели О4 (г/л) Больные СРК (п = 15), М ± т Концентрация (г/л) подклассов сывороточного ^ О у больных ДВК (п = 32)
группа больных с невыраженной пролиферацией эпителия (п = 25), М ± т диапазон концентраций группа больных с выраженной пролиферацией эпителия (п = 12), М ± т диапазон концентраций
^ С1 (К 4,9-11,4) 6,28 ± 0,05 (п = 15) 5,64 ± 1,73 (п = 25) 4,1-9,0 19,04 ± 0,05 (п = 7/12) 19,0-19,2
^ С2 (К 1,5-6,4) 5,11 ± 0,01 (п = 15) 4,30 ± 1,14 (п = 25) 2,4-6,1 17,08 ± 1,79 (п = 7/12) 12,6-18,3
^ сз (К 0,2-1,1) 0,36 ± 0,03 (п = 15) 0,8 ± 0,17 (п = 20/25) 0,6-1,1 1,81 ± 0,25 (п = 12) 1,3-2,2
^ С4 (К 0,08-1,4) 0,19 ± 0,02 (п = 15) 0,8 ± 0,2 (п = 20/25) 0,5-1,3 1,87 ± 0,33 (п = 12) 1,6-2,7
иммунокомпетентных клеток. Это проявляется образованием своеобразных клеточных коопераций (кластеров), включающих до 10 иммуноцитов. В состав таких коопераций могут входить эритроциты, которые во многих случаях обнаруживаются в ткани вне сосудистого русла.
В другой группе больных (22,8%) пролиферативный процесс в эпителии вблизи ДВК выражен слабо (0-1 балл). Низкодифференцированные эпителиальные
клетки в криптах и в устьях ДВК выявляются в небольшом количестве и не выходят за пределы базальной мембраны. Мф содержат единичные гранулы в цитоплазме. Адгезия иммуноцитов выражена незначительно или отсутствует (0-1 балл). Лф и плазматические клетки не обнаруживают структурных изменений. Кровеносные сосуды в основном не изменены, лишь в отдельных участках отмечается незначительное их расширение. Однако эндотелиоциты увеличены
СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОКИНОВ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПРИ ДИВЕРТИКУЛЕЗЕ
Цитокины СРК (П = 15), M ± m СРК, диапазон концентраций ДВК (П = 15), M ± m ДВК, диапазон концентраций
1Ь-1Р (пг/мл) 21,2 ± 0,5 19,5-22,5 31,6 ± 5,6 21-42
1Ь-8 (пг/мл) 34,4 ± 1,6 31,2-38,1 47,4 ± 13,5 16-70
ТОТ-а (пг/мл) 9,2 ± 0,8 7,6-10,8 299,3 ± 34,5* 230-368
1БК-у (пг/мл) 32,2 ± 7,8 16,6-47,8 248,8 ± 16,1* 217-281
1Ь-4(пг/мл) 20,3 ± 5,6 9,1-31,5 92,2 ± 34,1* 25-152
!БК-у/!Ь-4 1,58 ± 0,13 2,69 ± 0,38
* — р < 0,05.
в размерах, и ядро выбухает в просвет, что отражает различную степень их активации.
Почти в половине изученных случаев — в 10 из 22 (45,4%) — вблизи ДВК отмечена выраженная пролиферация крипт (9-13 крипт в поле зрения) по сравнению с контролем (4-5). Как проявление нормальной орга-носпецифической регенерации пролиферация крипт наблюдается в участках с минимальной пролиферацией эпителиоцитов и незначительной активацией иммунокомпетентных клеток.
Вне связи с ДВК слизистая оболочка исследована в разных отделах толстой кишки: в сигмовидной, в ректосигмоидной области и в стенке прямой кишки. Изменения, которые обнаружены в устьях ДВК, в этих отделах практически не выявляются. Лишь в единичных случаях в сигмовидной кишке, ограничивающейся областью крипт, отмечалась пролиферация эпителия (1 балл) и низкая степень активации иммуноцитов (1 балл). В 4 случаях из 6 в слизистой оболочке в этом отделе кишки выявлена выраженная пролиферация крипт (2-3 балла). В ректосигмоидном отделе и в стенке прямой кишки отмечались незначительные изменения: пролиферация эпителия и активация иммунокомпетентных клеток (0-1 балл), реакция кровеносных сосудов и пролиферация крипт не обнаружены.
Различная степень активации иммунокомпетентных клеток, ассоциированных со слизистой оболочкой толстой кишки, опосредует развитие медленно текущего хронического воспалительного процесса, приводящего к заболеванию кишечника. При ДВК в слизистой оболочке толстой кишки в области, прилежащей к дивертикулу, обнаружена пролиферация макрофагов, функция которых осуществлять защиту от антигенов. Для оценки иммунного ответа на корпускулярные и бактериальные антигены проведено изучение подклассов Бе-фрагмент которых является основным рецептором макрофагов (БеуБ), обеспечивающим распознавание и ликвидацию чужеродных структур. В связи с этим проведено изучение 4 подклассов 1§С1, 1§С2, 1§С3, 1§С4 у больных ДвБ (табл. 3).
В группе больных ДВК с невыраженной пролиферацией эпителия у 20 из 25 выявлены нормальные
показатели содержания подклассов 03 и 04
и у всех — 01 и 02. В группе больных ДВК с выраженной пролиферацией эпителия были повышены значения всех изотипов 1§0. Так, по сравнению с больными СРК при ДВК у 7 больных, вошедших во вторую группу, повышен в 3,1 раза уровень 01 (19,04 ± 0,05 при СРК 6,28 ± 0,05 г/л) и в 3,4 раза ^ 02 (17,08 ± 1,79 при СРК 5,11 ± 0,01 г/л). При ДВК повышен в 5 раз уровень 03 (1,81 ± 0,25 при СРК 0,36 ± 0,03 г/л) и ^ 04 (1,87 ± 0,33 и при СРК 0,09 ± 0,02 г/л) — у 12 больных. Выявленные изменения свидетельствуют о воспалительном процессе, обусловленном активацией различных популяций иммунокомпетентных клеток в слизистой оболочке толстой кишки в областях, расположенных в устье дивертикула.
01 и 03 выявляются при язвенном колите в период обострения воспалительных процессов в результате активации Тх2 и В-лимфоцитов под действием ИЛ-5. При болезни Крона активируются Тх1, синтезирующие ИНФ-у, и Тх2, секретирующие ИЛ-4, активируют плазматические клетки и синтез 02. Выработка этих субклассов иммуноглобулинов наблюдается в активную фазу заболевания, что свидетельствует о прогрессировании воспалительного процесса [6].
^04 определяется при пищевой аллергии, которая связана с активацией лимфоцитов — Т-хелпер-2, часто — при гельминтной инвазии. При атопических заболеваниях определяются 1дБ и ^04 [7]. Частота выявления 1§04 при различных воспалительных заболеваниях обусловлена структурой молекулы, которая усиливает взаимодействия через Беу-рецептор и через протеин-дисульфидную изомеразу, присутствующих на тромбоцитах, В-клетках, Т-лимфоцитах и эндоте-лиальных клетках [8]
Кроме этого, 0 принимает участие в активации ранних этапов иммунных реакций, так как элиминация антигенного материала осуществляется через Бе-рецептор 0 на макрофагах, нейтрофилах и естественных клетках-киллерах. Активация иммунокомпетентных клеток усиливается с выработкой и секрецией цитокинов. Для регуляции иммунного
ответа макрофаги продуцируют цитокины, которые действуют на расположенные рядом клетки и ткани. Так, TNF-a и IFN-y обеспечивают дифференци-ровку и пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, IL-1, IL-8, IL-15, IL-18 — межклеточные взаимодействия. Макрофаги секретируют компоненты комплемента и таким образом осуществляют раннее распознавание и элиминацию антигенов. Макрофаги имеют множество рецепторов: распознающие и передающие сигналы (TLR), для цитокинов (IFN-y, IL-2, IL-1, TNF). В механизмах, ответственных за межклеточные взаимодействия и определяющих различные этапы иммунного распознавания антигенов и развития иммунных реакций, важную роль играют провоспалительные цитокины. В экстрактах ткани, полученной от больных ДВК с избыточной пролиферацией эпителия толстой кишки, нами выявлены изменения содержания провоспалительных цитокинов (данные представлены в табл. 4).
Как видно из таблицы, при ДВК содержание IL-1ß и IL-8 незначительно повышено (р < 0,05). Однако одновременная выработка IL-1ß и хемоаттрактанта IL-8, медиаторов доиммунного воспаления, способствует запуску начальных этапов иммунного ответа, приводящему к активации антиген-пред-ставляющих клеток, в частности макрофагов, количество которых повышено в слизистой оболочке толстой кишки в области дивертикула. Активация макрофагов сопровождается усиленной выработкой TNF-a, концентрация которого при ДВК достоверно выше, чем при СРК (соответственно 299,3 ± 34,5 и 9,2 ± 0,8 пг/мл). Установлено, что активация макрофагов и индукция синтеза TNF-a в ткани толстой кишки связаны с бактериальными продуктами (мурамилди-пептидом, протеазами, липополисахаридом), образующими белковые комплексы с рецепторами CD14 макрофагов и дендритных клеток [13]. Интенсивная выработка TNF-a в слизистой оболочке усиливает пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником [9]. Выявленная нами повышенная концентрация IFN-y при ДВК по сравнению с СРК (соответственно 248,8 ± 16,1 и 32,2 ± 7,8 пг/мл) отражает выраженную активацию Тх1-зависимого иммунитета, определяющего в слизистой оболочке продукцию факторов роста, которые регулируют пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток и вступление их в апоптоз [10; 11]. Наши исследования показали, что при ДвБ, протекающей с повышенной пролиферацией эпителиоцитов, изменено соотношение про-воспалительных цитокинов в ткани, что отражает дисрегуляцию иммунного ответа. Это подтверждается увеличением при ДВК индекса девиации в 2,7 раза по сравнению с СРК. О нарушении регулятор-ного процесса в развитии иммунной реакции при ДВК свидетельствует также повышенная выработка IL-4 — противовоспалительного цитокина, который усиливает регенерацию. Отрицательный эффект тканевых цитокинов в толстой кишке при ДВК проявляется усиленной регенерацией эпителиоцитов
и отсутствием адекватной их дифференци-ровки. Y. Yu и соавт. [12] выявили цитокины в разных участках толстой кишки после операции по поводу болезни Крона, язвенного колита и рака. Межэпителиальные лимфоциты (МЭЛ) и лимфоциты из собственной пластинки при культивировании в большом количестве спонтанно продуцировали цитокины: IL-4, IFN-y, IL-10 и TNF-a. Внутрицитоплазматический IFN-y был определен с помощью проточной цитометрии после РМА-стимуляции. Среди лимфоцитов преобладали Т-хелперы-1, свидетельствующие о воспалении.
Кроме этого, цитокины, продуцируемые макрофагами, оказывают иммунорегулятор-ное действие на клетки, расположенные удаленно от клеток-продуцентов, обуславливая полиорганные поражения.
обсуждение полученных результатов
При исследовании слизистой оболочки сигмовидной кишки в области дивертикулов обнаружены избыточная пролиферация эпителия крипт, нарушение структуры межклеточного матрикса и реакция им-мунокомпетентных клеток. В результате усиленной пролиферации эпителия возникает пул низкодиф-ференцированных эпителиальных клеток, которые выявляются по всей длине крипт, скапливаются в их устьях и в виде многоклеточных массивов могут располагаться в субэпителиальной области. Высокая пролиферация эпителия направлена на восстановление барьерной функции. Тот факт, что основная масса пролиферирующих эпителиоцитов не вступает в стадию дифференцировки, свидетельствует о нарушении регуляции эпителиального гомеостаза, т.е. жизненного цикла эпителиоцитов, включающего механизм их деления (асимметричный митоз), пролиферацию, миграцию и апоптоз. Молекулярные процессы, вызывающие повреждение эпителия кишки при воспалительном процессе, связаны с ли-гандом — TNF a-опосредующим апоптоз (TRAIL). TRAIL — член семейства TNF — является гомологом TNF-a, так как оказывает антитуморальное действие через индукцию апоптоза в опухолевых клетках без повреждения нормальных. TRAIL в низком значении экспрессируется эпителиальными клетками кишки и в лимфоцитах собственной пластинки, но под влиянием IFN-y и TNF-a его выработка увеличивается [9; 14]. При воспалении TRAIL быстро и мощно удаляет эпителиальные клетки через апоптоз путем активации внутриклеточного каскада каспаз. Этот механизм может включаться в повреждение эпителиальных клеток при воспалении, включая ВЗК и инфекции.
В основе жизнеспособности эпителия лежит баланс проапоптогенных и противоапоптоген-ных факторов, решающее значение среди которых
Б >
¡2 о
So 1_ о од
ое
щ CT
I- и Id
тш
Q го а|
и га
L
IS
га
ü
ш j
S I-0 ш с га
-
ш и
принадлежит белкам семейства Вс1-2. Активация проапоптогенных факторов (мутация генов, агрессивные условия среды, экспрессия цитокинов, дефицит факторов роста и др.) приводит к включению каскада специфических протеаз семейства каспаз и последующему распаду клетки [11; 16]. Избыточная пролиферация эпителия напрямую связана с угнетением апоптоза. К ингибиторам апоптоза относят избыток таких цитокинов, как ТОТ-а и 1Ь-1б, действие которых реализуется через активацию гена Ве1-2 с синтезом определенных гомологов этого белка, а также белков, подавляющих апоптоз, — Ве1-Х, !ар-1, те1-1 и мутацию р53 [24]. Следствием этих процессов является повышение пролиферативной активности эпителиоцитов. Активация противоапоптозных механизмов может происходить под влиянием различных внешних воздействий на организм, включая ряд инфекций
[14]. По мнению ряда исследователей, избыточная пролиферация эпителия отражает развитие воспалительного процесса [15]. Ранее эта точка зрения была высказана на основании фактов, полученных в экспериментах с моделированием воспалительного процесса [16]. Важно отметить, что при гнойном воспалении и при выраженном фиброзе вокруг очага хронического воспаления в желудочно-кишечном тракте избыточная пролиферация эпителия с образованием скоплений недифференцированных эпителиоцитов не выявляется.
В сложной регуляции эпителиального гомео-стаза активное участие принимают компоненты межклеточного матрикса. Это структурные и растворимые белки и гликопротеиды, подвергшиеся воздействию ферментов, экспрессированных активированными стромальными клетками и макрофагами. Обнаруженные в области дивертикулов гипоплазия волокнистой стромы и деградация гликопротеидов являются результатом действия специфических ферментных систем, включая ме-таллозависимые матриксные протеиназы и же-латиназы (ММР) -1, —2, —9, —12 и др., секреция которых усиливается в условиях воспаления [17]. Фрагменты разрушенных белковых молекул (низкомолекулярные пептиды) и полисахарид-ных комплексов расширяют спектр метаболитов-регуляторов, оказывающих влияние на многие процессы в ткани, включая миграцию клеток, их пролиферацию и апоптоз [18-20]. Действие про-теолитических и гликолитических ферментных систем контролируется с помощью цитокинов и факторов роста, уровень которых в ткани связан с усилением функции клеток моноцитарно-макро-фагального ряда и некоторых стромальных клеток, активность которых возрастает при воспалении
[15]. Это согласуется с выявленной в области дивертикулов активацией иммунокомпетентных клеток: пролиферацией (преимущественно Мф) и усиленной адгезией Мф, Т- и В-Лф, а также с повышенным уровнем в ткани провоспалительных цитокинов — !Ь-1б, ТОТа и хемоаттрактанта !Ь-8,
обладающего проадгезивными свойствами. Вместе с тем усилена экспрессия IFN-y и IL-4 — цитокинов про- и противовоспалительного действия, что обусловлено активацией различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток — Тх1 и Тх2, участвующих в развитии иммунного ответа и своеобразном проявлении воспалительной реакции. Из стромальных клеток, расположенных в области дивертикулов, обращали на себя внимание перикриптальные миофибробласты/фибробла-сты (Мфбл/Фбл), среди которых выявлялись как активированные формы, так и клетки с признаками дистрофии, что может отражаться на регуляции эпителиального гомеостаза. Это связано со значительной ролью перикриптальных Мфбл/ Фбл в регуляции пролиферативной активности эпителиоцитов. Располагаясь непосредственно под базальной мембраной эпителия крипт, Мфбл осуществляют связь эпителиоцитов с иммунной системой и с фибробластами глубоких отделов слизистой оболочки [10]. Перикриптальные Мфбл/ Фбл секретируют цитокины и хемокины (IL-16, TNF-a, IL-8, IFN-y), факторы роста (TGF-6, platelet-derived GF, stem cell GF и другие), различные про-теиназы, большое количество молекул ММ [22], с помощью которых модулируются фактически все ключевые функции эпителия. Эти своеобразные стромальные клетки накапливают вазоинтести-нальный пептид (VIP), являющийся мощным регулятором функции эпителиальных клеток. Через специальные VIP-рецепторы на поверхности эпителиоцитов этот пептид проникает внутрь клетки и контролирует их пролиферативную активность [21]. В свою очередь, Мфбл/Фбл чувствительны к провоспалительным цитокинам, повышенный уровень которых поддерживается пролиферацией и активацией макрофагов. Воздействие цитокинов приводит к деструкции Мфбл/Фбл или к их дедифференцировке, которая проявляется исчезновением a-гладкомышечного актинина. В обоих случаях утрачиваются специфические свойства Мфбл/Фбл и они выпадают из системы регуляции функции эпителия, что может приводить к угнетению апоптоза и связанной с этим избыточной пролиферации эпителиоцитов в криптах [10]. На этом фоне развивается сосудистая реакция с активацией эндотелиальных клеток и избирательной миграцией элементов крови во внесосудистое пространство, что мы наблюдали в виде экстравазатов вблизи расширенных венул и групп эритроцитов, адгезированных к поверхности иммунокомпетентных клеток. Выявленные вблизи ДВК изменения слизистой оболочки в виде дистрофического процесса в поверхностных эпителиоцитах, нарушения межэпителиальных соединений, а также появление на месте функционально активных колоноцитов недифференцированных клеток, приводят к повышенной проницаемости эпителиального барьера. При этом возрастает проникновение в стенку кишки бактерий их токсинов и фрагментов, чем
поддерживается умеренный воспалительный процесс в качестве защитной (адаптивной) реакции организма. Однако локальное усиление этих процессов приводит к развитию длительного хронического воспаления, которое наряду с нарушением регуляторных тканевых механизмов способствует образованию ДВК и их длительному существованию. Усиление имеющихся или возникновение дополнительных патогенных факторов может активизировать воспаление вокруг ДВК и привести к развитию осложнений в виде кровотечений или перфораций с распространением острого воспаления. Изменения, развивающиеся в области ДВК, но выраженные в значительно меньшей степени, обнаруживаются вне ДВК в разных участках толстой кишки. Это свидетельствует о том, что в кишечнике (постепенно, возможно, с возрастом) развиваются процессы (пре- или провоспалительного характера), предрасполагающие на каком-то этапе к нарушению местных формообразовательных процессов и образованию ДВК. Это может быть связано также с изменениями общего характера, такими как дистрофический процесс в мышечной пластинке стенки кишки, гипоплазия ее эластического каркаса, ослабление реактивного потенциала организма в пожилом возрасте.
заключение
Таким образом, выявленные изменения в стенке сигмовидной кишки в области дивертикулов отражают воспалительный процесс, характеризующийся рядом особенностей, которые включают избыточную пролиферацию эпителия, преобладание ма-крофагальной реакции в развитии иммунного ответа, повышенную клеточную адгезию и необычное соотношение экспрессии цитокинов и других регуляторных молекул. Дивертикул представляет собой локальное изменение стенки, без тенденции к генерализации. Изменения структуры ткани в области сформированных дивертикулов связаны с нарушением регуляции многих процессов тканевого метаболизма и формообразования. К ним относятся дисрегуля-ция клеточного обновления эпителия (повышенный уровень пролиферации эпителиоцитов и угнетение апоптоза), деградация компонентов межклеточного матрикса, умеренная сосудистая реакция. Все эти процессы протекают на фоне особой формы иммунных механизмов защиты и адаптации.
Б >
¡2 о
So 1_ о OS
<S ое
щ CT
I- и Id
тш
Q го а|
и га
L
IS
га
ü
ш j
s
In <u с га а ш
I-
литература
1. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника / Л. И. Аруин, Л. Л. Капуллер, В. А. Исаков. — М.: Триада-Х, 1998. — 365 с.
2. Parra-Blanco, A. Colonic Diverticular Disease: Pathophysiology and Clinical Picture // Bacterial Flora in Digestive Disease. Focus on Rifaximin / Eds. C. Scarpignato, A. Lanas. — Basel-Freiburg-Paris-London-New York et al.: Karger, 2006. — P. 71-88.
3. Gudkova, R.B. Comparative characteristics of immune responses in Crohn's disease and diverticulosis / R. B. Gudkova, S.V., Levchen-ko A. I. Parfenov, V. B. Potapova, L. B. Lazebnik // Int. J. Immunorehabilitation. — 2009. — Vol. 11, No. 2. — P. 209-213.
4. Левченко, С. В. Реакция иммунокомпетентных клеток и структурные изменения слизистой оболочки толстой кишки у больных дивертикулярной болезнью / С. В. Левченко, Р. Б. Гудкова, В. Б. Потапова, Л. Б. Лазебник // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2009. — № 5. — С. 17-20.
5. Потапова, В. Б. Особенности регенерации эпителия толстой кишки при дивертикулезе / В. Б. Потапова, Р. Б. Гудкова, С. В. Левченко, Л. Б. Лазебник, В. А. Рогозина // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2011. — Т. 152, № 12. — С. 708-711.
6. Plaen, I. G. Lipopolysaccharide induces CXCL2/ macrophages inflammatory protein-2 gene expression in enterocytes via NF-kB activation: independence from endogenous TNF-a and platelet-activating factor / I. G. Plaen, X-B. Han, X. Liu et al. // Immunology. — 2006. — Vol. 118. — P.153-163.
7. Медицинские лабораторные технологии: Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. проф. А. И. Карпищенко. 3-е изд. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. — 788 с.
8. Aalberse, R.C. IgG4 breaking the rules / R. C. Aalberse, J. Schuurenan // Immunology. — 2002. — Vol. 105. — P. 9-19.
9. Begue, B. Implication of TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand in Inflammatory Intestinal Epthelial Lesions / B. Begue, H. Wajant, J. — Ch. Bambon et al. // Gastroenterol. — 2006. — Vol. 130, No. 7. — P 1962-1974.
10. Francoeur, C. Degeneration of the Pericryptal Myofibroblast Sheath by Proinflammatory Cyitokines in Inflammatory Bowel Disease / C. Fran-coeur, J. Bouatrouss, A. Seltana et al. // Gastroenterol. — 2009. — Vol. 136. — P. 263.
11. Santos, A. S. The Central Executioner of Apoptosis: Multiple Connections between Protease Activation and Mitochondria in Fas /APO-1/ CD95- and Ceramide-induced Apoptosis / A. S. Santos, N. Zamzami,
M. Castedo et al. // J. Exp. Med. — 1997. — Vol. 186, No. 1. — P. 25-37.
12. Yu, Y. Involvement of tumor necrosis factor-a-related apoptosis — inducing ligand in enhanced cytotoxicity of lipopolysaccharide-stimu-lated dendric cells to activated T cells / Y. Yu, W. Wang, W. Song et al. // Immunology. — 2002. — Vol. 106. — P. 308-315.
13. Piercy, J. CD45 negatively regulates tumour necrosis factor and inter-leukin-6 production in dendrite cells / J. Piercy, S. Petrova, E. Z. Tchilin et al. // Immunology. — 2006. — Vol. 118. — P. 250-256.
14. Болезни двенадцатиперстной кишки / И. В. Маев, А. А. Самсонов. — М.: МЕДпресс-информ, 2005. — 512 с.
15. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation /
R. Medzhitov // Nature. — 2008. — Vol. 454. — P. 428-435.
16. De Vogel, J. Dietary heme injures surface epithelium resulting in hyperproliferation, inhibition of apoptosis and crypt hyperplasia in rat colon / J. De Vogel, W. — B. van-Eck, A. Sesink et al. // Carcinogenesis. — 2008. — Vol. 29, No. 3. — P. 398-403.
17. Sun, J. Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitor of Metallopro-teinases Are Essential for the Inflammatory Response in Cancer Cells / J. Sun // J. Signal Transduction. — 2010, Article ID 985132.
18. Борисенко, А. В. Идентификация регуляторных белков, биологически активных в сверхмалых дозах, и исследование их физико-химических свойств / А. В. Борисенко, В.П., Ямскова И. В. Благо-датских // Биол. мембраны. — 2007. — Т. 24, № 3. — С. 244-250.
19. Koslov, I. G. Collagen peptides are potent regulators of some central cell types particulating in inflammation / I. G. Koslov, A. J. Jemelyanova, N. K. Gorlina et al. // The Immulogist. — 1998. — Suppl. 1. — P. 506.
20. Lee, R-S. The degradation of glycosaminoglicans by intestinal mycro-flora determinates colitis in mice / R. — S. Lee, L. — V. Han, W. — J. Ryn et al. // Inflammation. — 2000. — Vol. 32, No. 1. — P. 27-36.
21. Rirayasu, J. Vasoactive intestinal peptide and its relationship to tumor stage in colorectal: immunohistochemical study / J. Hirayasu, M. Oga, T. Okuyama et al. // J. Gastroenterol. — 2002. — Vol. 37. — P. 336-344.
22. Pinchuk, I.V. PD-1 Ligand Expression by Human Colonic Myofibroblasts/Fibroblasts Regulates CD4+ T-cell Activity / I. V. Pinchuk, J. I. Saada, J. Beswick et al. // Gastroenterol. — 2008. — Vol. 135, No. 4. — P. 1228-1234.
23. Kaufman, J. Expression of CD154 (CD40 ligand) by Human Lung Fibroblasts: Differential Regulation by IFNy and IL13 and Implications for Fibrosis / J. Kaufman, P. J. Sime, P. Phipps // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172, No. 3. — P. 1862-1871
24. Hotchkiss, R. S. Cell Death / R. S. Hotchkiss, A. Strasser, J.E. McDunn, P. E. Swanson // NEJM. — 2007. — Vol. 361. — P. 1570-1583.
