CC BY
53
Б >
сг
So L 2
0 i
Я--
Щ ст
Hi
1 ^
о!
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СЫВОРОТОЧНЫХ ЦИТОКИНОВ £
ПРИ ДИВЕРТИКУЛЯРНОЙ БОЛЕЗНИ ТОЛСТОЙ КИШКИ *
У ПОЖИЛЫХ S
ш
Т
Гудкова Р. Б., Левченко С. В. £
ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ, Москва С
га а
Левченко Светлана Владимировна ju
111123, Москва, шоссе Энтузиастов, д. 86 Тел.: 8 (495) 304 3036 E-mail: sv_levchenko@list.ru
РЕЗЮМЕ
В работе продемонстрированы изменения уровня про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных старших возрастных групп с малосимптомной дивертикулярной болезнью толстой кишки. Рассмотрено одно из звеньев возможного патогенеза данной нозологии, затронут вопрос вклада инволютивных изменений в формирование особенностей неспецифического иммунитета и в развитие аутоиммунных реакций у больных пожилого возраста
Ключевые слова: дивертикулярная болезнь; неспецифический иммунитет; аутоиммунные реакции; провоспалительные и противовоспалительные цитокины.
SUMMARY
This article demonstrated changes in the level of pro-and anti-inflammatory cytokines in serum of patients of older age groups with small symptom diverticular disease of the colon. Was considered one of the links of the possible pathogenesis of this nosology, touched upon the contribution of involutive changes in the formation of the features of nonspecific immunity and the development of autoimmune reactions in elderly patients. Keywords: diverticular disease; nonspecific immunity; autoimmunity; inflammatory and anti-inflammatory cytokines.
Дивертикулярная болезнь — это хроническое заболевание, поражающее различные отделы пищеварительной трубки. В состав истинных (врожденных) дивертикулов входят все слои стенки кишки, и в настоящее время они рассматриваются как один из гастроэнтерологических вариантов недифференцируемых дисплазий соединительной ткани. В пожилом возрасте чаще выявляются так называемые «ложные» дивертикулы — в состав их стенки не входит мышечный слой. Локализуются такие дивертикулы преимущественно в сигмовидной кишке, и частота их выявления увеличивается с каждым десятилетием жизни. Среди причин формирования дивертикулов называют рацион с пониженным содержанием клетчатки, замедление транзита кала по кишке, повышение внутрикишечного давления, а также нарушение коллагеногенеза и аутоиммунные реакции, рост числа которых у пожилых связывают с ослаблением супрессорной функции тимуса [1]. Структурные изменения в стенке кишки связаны с нарушением процессов регенерации, обусловленных,
в частности, иммунным ответом на многочисленные антигены (бактерии, вирусы, пищевые белки). В физиологических условиях в результате взаимодействия антигена с эпителием и распознавания его То11-подобными рецепторами вырабатываются химические вещества, обладающие сигнальными и защитными свойствами, — дефенсины, интер-фероны и интерлейкины: ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1в, ФНО-а [2; 3]. Сигналы опасности передаются на локально расположенные макрофаги, дендритные клетки и фибробласты. Процесс не развивается, если макрофаги справляются с антигенным материалом. Если опасность большая, то информация поступает в капилляры на эндотелиальные клетки, которые начинают экспрессировать адгезины и интегрины — активирующие молекулы, на которые реагируют моноциты, лимфоциты и лейкоциты из кровотока. Эти иммунокомпетентные клетки через межэндо-телиальные щели проникают в слизистую оболочку кишки, и начинается воспалительный процесс с выработкой цитокинов как провоспалительных,
№12/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
со
CN
так и противовоспалительных [4]. При воспалении в толстой кишке патологический процесс связан с провоспалительным цитокином ФНО-а [5], а также с большим количеством бактериального липополи-сахарида (ЛПС), поступающего из просвета кишки [6; 7]. ФНО-а, синтезируемый макрофагами слизистой оболочки, вызывает нарушения в индукции апоптоза в эпителиоцитах с потерей устойчивости эпителия к регенерации [8; 9]. Также установлено, что в процессе моделирования иммунного ответа в кишке участвуют провоспалительные цитокины (ИЛ-ф, ФНО-а) [7].
Однако остаются неизвестными соотношения концентрации цитокинов с их основными транспортерами — рецепторами интерлейкинов, которые могут определять развитие иммунного ответа у пожилых больных при дивертикулезе сигмовидной кишки. Все это послужило предпосылкой проведения настоящего исследования, целью которого было изучение взаимоотношений между провоспалительными ци-токинами (ФНО-а, ИЛ-1(3, ИЛ-2), их транспортером (ИЛ-IRA) и противовоспалительным цитокином (ИЛ-4) у больных пожилого возраста с единичными и множественными дивертикулами толстой кишки.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучено содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови 87 больных с дивертикулезом (Двк) толстой кишки без эндоскопических признаков воспаления, (средний возраст 67,6 ± 7,1 года). Диагноз подтвержден данными инструментальных методов исследования: эндоскопией толстой кишки и рентгенологическим методом. По количеству дивертикулов, выявляемых при контрастировании кишки бариевой взвесью, выделены две группы больных: с единичными (менее 10) дивертикулами и множественными (более 10). Группу с единичными дивертикулами (Двк 1) составили 35 больных, в группу с множественными дивертикулами (Двк 2) вошли 52 больных. В качестве контрольной группы использовали сыворотку крови 15 практически здоровых людей того же возраста, отобранных на основе плановой диспансеризации, не имевших в анамнезе кишечных заболеваний. Критериями исключения из исследования являлись острые воспалительные, аутоиммунные и опухолевые заболевания.
В сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) определяли концентрацию интерлейкинов: ИЛ-1(3, ИЛ-Ша (рецепторного антагониста), ИЛ-2Я, ИЛ-6, ИЛ-4, фактора некроза опухолей альфа (ФНО-а), ферритина. Использовали тест-систем фирм: ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово, Новосибирская область), Bio Source International. Порог чувствительности анализа составлял 2 пг/мл. При проведении исследований и обработке результатов использовали аппаратуру «Мультискан» (Россия). При статистической обработке полученных результатов достоверность
различий оценивали с использованием ¿-критерия Стьюдента, непараметрического (7-критерия Манна — Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное нами исследование показало, что концентрация ключевого провоспалительного цитокина ИЛ-ф при единичных Двк достоверно повышена у 17% больных. Однако была отмечена значительная вариабельность значений его концентраций, которые в среднем практически не отличались от контрольной группы. Вместе с тем выявлялось трехчетырехкратное увеличение содержания в сыворотке крови его рецепторного антагониста ИЛ-Ша, который продуцируется теми же клетками в ранние сроки распознавания антигена, что и ИЛ-ф. Подобная картина наблюдалась и при множественных Двк. Установлено, что у больных этой группы, повышена концентрация ИЛ-1(3 в 27,6% случаев, у остальных оставалась неизменной и не отличалась от показателей контрольной группы на фоне стабильно высокого уровня его антагониста ИЛ-Ша (табл.). Известно, что ИЛ-Ша подавляет активность ИЛ-1а и ИЛ-ф, конкурируя с ними за рецепторы связывания [10]. Можно предположить, что выявленный избыток ИЛ-Ша препятствует накоплению ИЛ-1(3 и, возможно, является причиной нарушенного иммунитета при Двк из-за его большого аффинитета к рецепторам этой группы цитокинов. Известно, что ИЛ-18, относящийся к семейству ИЛ-1, активно элиминируется из кровотока сходным с ИЛ-ф образом, их биосинтез ингибируется на генетическом уровне [11].
Результаты оценки уровня цитокинов в сыворотке крови больных с разными вариантами ди-вертикулеза представлены в таблице.
Анализ средних значений концентрации сывороточных провоспалительных цитокинов (ИЛ-ф, ИЛ-6, ФНО-а) отражает их участие в механизмах активации неспецифической и специфической иммунной защиты, являющейся общей иммунной реакцией на местное повреждение слизистой оболочки. В сыворотке крови больных 1-й группы повышен уровень ИЛ-ф (87,6 ± 19,8 пг/мл при норме 25,9 ± 5,7 пг/мл). Выявлен двукратный прирост содержания его рецепторного антагониста ИЛ-1РА, продуцируемого теми же клетками общевоспалительного назначения — макрофагами, эндотелио-цитами. Стабильно высокий уровень ИЛ-1РА приводит к подавлению активности ИЛ-ф, связанного с ингибированием его биосинтеза. То11-подобные рецепторы опосредованно усиливают продукцию П-Ша, регулятора иммунного ответа [11; 12].
Содержание основного провоспалительного цитокина — ФНО-а при обеих формах Двк было достоверно повышено по сравнению с контролем. Необходимо отметить, что концентрация данного цитокина при множественных Двк была несколько выше, чем при единичных дивертикулах. Повышение
ПОКАЗАТЕЛИ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ БОЛЬНЫХ ДИВЕРТИКУЛЕЗОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ
Показатель Контрольная группа Двк 1 Двк 2
ИЛ-lß, пг/мл 25,9 ± 5,7 87,6 ± 19,8 105,9 ± 26,7*
ИЛ-lRa, пг/мл 115,3 ± 7,6 231 ± 35,0* 372 ± 53,7*
ИЛ-6, пг/мл 16,3 ± 3,2 26,7 ± 5,5 67,1 ± 18,4*
ФHOa, пг/мл 23,8 ± 6,5 62,8 ± 19,6* 187,8 ± 19,5*
ИЛ-4, пг/мл 34,3 ± 8,2 244,4 ± 38,6* 109,6 ± 53,9*
ИЛ-2R, пг/мл 22,6 ± 3,8 37,1 ± 4,5 29,7 ± 5,2
Ферритин, нг/мл 145,6 ± 31,2 326,4 ± 45,2* 286,7 ± 35,9*
Примечание: * — сравнение средних значений с контрольной группой. Различия достоверны при р < 0,05.
Б >
а
So L о
<£ о і
Я--
U о
т
И
и
га
L
Б
га
V
Ü
ш
т
S
I-
0
ш
с
га
а
ш
I-
уровней провоспалительных цитокинов в сыворотке крови обычно рассматривают как фактор, утяжеляющий течение заболевания [13]. Уровень ИЛ-6, хотя и относится к провоспалительным цитокинам, при Двк 1 не отличался от нормы (соответственно 26,7 ± 5,5 и 16,3 ± 3,2 пг/мл), но был повышен при Двк 2 (67,1 ± 18,4 пг/мл). Аналогичные противоречивые данные были получены при воспалительных заболеваниях толстой кишки, когда авторы наблюдали увеличение концентрации данного ци-токина только при выраженном обострении язвенного колита, а не при болезни Крона [14]. Это можно объяснить тем, что ИЛ-6 находится в оппозитных отношениях с классическими провоспалительными цитокинами, так как блокирует активацию их генов через систему транскрипционных факторов 8ТАТ и, следовательно, передачу сигнала с рецепторов. ИЛ-ф как конвертирующий фермент является специфической протеазой, участвующей в молекулярной регуляции начальных этапов апоптоза [4]. Можно предположить, что это явление лежит в основе подавления синтеза цитокинов семейства ИЛ-1 и частично ФНО-а при множественных очагах воспаления у больных Двк. В свою очередь противовоспалительные цитокины могут блокировать ген ИЛ-6 через систему ОТ-кр, так как только активация нуклеарного фактора вызывает экспрессию генов цитокинов с последующей продукцией про-воспалительных цитокинов и молекул адгезии [2; 10]. Вследствие сложных механизмов экспрессии генов цитокинов низкая концентрация, выявленная при небольших очагах воспаления, остается неизменной, а при крупных очагах увеличивается.
У больных Двк повышена концентрация ИЛ-4, что составило 244,4 ± 38,6 (в контроле 34,3 ± 8,2 пг/мл). ИЛ-4 снижает аллергические реакции и обеспечивает проявление хелперных функций Т-лимфоцитов на В-клеточное звено иммунитета, обеспечивающего выработку иммуноглобулинов и антител. Влияние ИЛ-4 на В-лимфоциты связано главным образом с регуляцией секреции ИГ Е антител. Увеличение уровня ИЛ-4 может быть связано
как с его гиперпродукцией, так и с регуляторным дисбалансом со стороны других цитоки-нов, что проявляется в форме повышенной иммунологической реактивности с выработкой антител различной специфичности [15].
Повышение концентрации ферритина при Двк свидетельствует об активации процессов неспецифической защиты при локальном нарушении гемостаз в слизистой оболочке толстой кишки.
Повышенный уровень ИЛ-ф и низкая концентрация ФНО-а при Двк характерны для начальных этапов развития иммунных реакций. У больных высокое содержание ИЛ-4, являющегося естественным ингибитором провоспалительных цитокинов — ИЛ-ф, ФНО-а и ИФ-у, играет, с одной стороны, положительную роль, направленную на ограничение воспалительных и деструктивных процессов в слизистой оболочке толстой кишки. С другой стороны, развивается опосредованное воздействие ИЛ-4, усиливающее стимуляцию Т-хелперов и В-лимфоцитов. Высокая концентрация ИЛ-4 у больных поддерживает выработку антител к белку, усиливающему проницаемость, к маннанам Sacharomyces cevericy, к тканевой трансглутаминазе [17]. Следовательно, антибактериальная терапия уменьшит возможные осложнения [18]. Полученные нами данные позволяют прийти к заключению о том, что система провоспалительных цитокинов активизируется при обеих формах Двк, а также модулируется механизмом частичного подавления их синтеза в совокупности с блокированием генов провоспалительных цито-кинов и их рецепторных антагонистов.
Синтез ИЛ-2 осуществляется преимущественно Т-хелперами под влиянием антигенной стимуляции [3]. ИЛ-2 наряду с цинкзависимым гормоном тимулином отвечает за активацию натуральных киллеров [2; 19]. Поскольку при обеих формах Двк концентрации ИЛ-2Б. не отличаются от показателей контрольной группы, можно полагать, что при данном заболевании не происходит активации системы натуральных киллеров, что согласуется с результатами наблюдений I. Р1егеу и соавт. [15]. Как известно,
О
cg
№12/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
цитокины самостоятельно не способны проникать в клетки-мишени [13]. Для этого необходимо образовывать транспортный комплекс с их носителем — универсальным ингибитором протеиназ макроглобулина, который после присоединения гидролаз становится нейтральным, теряет флотирующие характеристики и, подобно преципитату антиген-антитело, оседает на рецепторы эндоцитоза клеток-мишеней. Образовавшийся суперкомплекс вновь утрачивает заряд и проваливается сквозь цитоплазматическую мембрану внутрь клетки-мишени, где цитокин, достигнув ее ядра, и может реализовать свои регуляторные свойства [4; 7]. Если допустить, что комплекс способен транспортировать более одной молекулы цитокина, его количества с избытком хватает для связывания и транспортировки всех возможных цитокинов. Кроме того, при Двк из очага воспаления высвобождаются различные гидролазы, значительная часть которых связывается макроглобулином, являющимся универсальным ингибитором протеиназ. Соответственно транспортный потенциал макроглобулина по отношению к цитокинам при Двк способен существенно возрастать, так у больных образуются антитела к протеиназам (матриксной металлопротеиназе 2).
Из изложенного выше следует, что при Двк ФНО-а является фактически единственным про-воспалительным цитокином из группы маркеров острых форм течения воспалительного процесса, так как уровень его возрастал вне зависимости от формы. Другие провоспалительные цитокины подавлялись, видимо, путем блокады транскрипции на уровне гена при конкуренции с белками антагонистами и из-за блокады рецепторов эндоцитоза.
Система противовоспалительных цитокинов независимо от формы Двк активирована, но была недостаточна для подавления синтеза ФНО-а и хемотаксиса. В связи с этим можно предположить, что макрофаги играют при Двк большую роль, чем Т-хелперы-2, активация которых не выявлена [16]. По характеру изменений концентрации цитокинов и их транспортеров при Двк с множественными и единичными поражениями слизистой оболочки толстой кишки демонстрируются существенные различия. В первом случае наблюдаются классические элементы острой воспалительной реакции, в которой выявлен доминирующий эффект ФНО-а, но не провоспалительных цитокинов семейства ИЛ-1: ИЛ-1(3 и ИЛ-1РА. Эти интерлейкины на этапе острой фазы воспаления подавляют синергическое влияние блокаторов рецепторов эндоцитоза — противовоспалительных цитокинов, что выявлено при Двк и что определяет ограничение развития системного воспалительного процесса.
Таким образом, проведенное исследование выявило участие провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в патогенезе дивертикулеза толстой кишки. Отмечено повышение концентраций ФНО-а вне зависимости от количества дивертикулов. С начала воспаления отмечено увеличение при единичных дивертикулах содержания ИЛ-1(3, а при множественных — ИЛ-6. По нашему мнению, выявленные различия могут быть использованы в качестве дополнительных критериев при дифференциальной диагностике степени воспаления в толстой кишке у пожилых больных при дивертикулезе. Оценка содержания цитокинов с функционально различными свойствами является качественным показателем адекватности иммунного ответа.
CD
m
ЛИТЕРАТУРА
1. Борисова А.М., Сепиашвили Р. И. Аутоиммунные заболевания в пожилом и старческом возрасте // Аллергология и иммунол. — 2009. — Т. 10, № 3. — С. 325-332.
2. Ковальчук Л. В., Хорева Р. В., Варивода А. С. Врожденные компоненты иммунитета. Toll-подобные рецепторы в норме и иммунопатологии // Журн. микробиол. — 2005. — № 4. — С. 96-104.
3. Фрейдлин И. С. Регуляторные Т-клетки: происхождение и функции // Мед. иммунол. — 2005. — Т. 7, № 4. — С. 347-354.
4. Хаитов Р. М., Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Роль паттернраспоз-нающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете // Иммунология. — 2009. — № 1. — С. 66-76.
5. Milner P., Crowey R., Kamm M.A. et al. Vasoactive intestinal polypeptide levels in sigmoid colon in idiopatic constipation and diverticular disease // Gastroenter. — 1990. Vol. 99. — P. 666-675.
6. Akazawa A., Sakaida J., Higaki S. et al. Increased expression of tumor necrosis factor-а messenger RNA in the intestinal mucosa of inflammatory bowel disease, particulary in patients with disease in the inactive phase // J. Gastroenterol. — 2002. — Vol. 37. — P. 345-353.
7. Plaen I. G., Han X-B., Liu X. et al. Lipopolysaccharide induces CXCL2 / macrophages inflammatory protein-2 gene expression in entero-cytes via NF-kB activation: independence from endogenous TNF-а and platelet-activating factor // Immunology. — 2006. — Vol. 118. — P. 153-163.
8. Underhill D. M., Ozinscy A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection // Curr. Opion. Immunol. — 2002. — Vol. 14. — P. 103-110.
9. Симбирцев А. С. Цитокины: классификация и биологические функции // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, № 2. — С. 16-21.
10. Mueller Cr. Tumor necrosis factor in mouse models of chronic intestinal inflammation // Immunology. — 2002. — Vol. 105. — P. 1-8.
11. Ткаченко Е. В., Варванина Г. Г., Дроздов В. Н. и др. Изменение морфологической структуры, регионального кровотока и содержания простагландинов в слизистой кишечника крыс под воздействием различных фармгрупп // Эксперим. и клинич. гастроэнтер. — 2010. — № 3. — С. 71-73.
12. Vasuda T. Hyaluronan inhibits cytokine production by lipopolysacar-ide-stimulated U937 macrophages through down-regulation of NF-kB via ICAM-1 // Inflammation Res. — 2007. — Vol. 56, № 6. — P. 246-253.
13. Abrea M. T., Fukata M., Arditi M. TLR signaling in the gut in health
and disease // J. Immunol. — 2005. — Vol. 174, № 8. — P. 4453-4460.
14. Царегородцева Т. М., Серова Т. И. Цитокины в гастроэнтерологии. — М.: Анахарсис, 2003. — 96 с.
15. Piercy J., Petrova S., Tchilin E. Z. et al. CD45 negatively regulates tumour necrosis factor and interleukin-6 production in dendric cells // Immunology. — 2006. — Vol. 118. — P. 250-256.
16. Левченко С. В., Гудкова Р. Б., Потапова В. Б., ЛазебникЛ. Б. Реакция иммунокомпетентных клеток и структурные изменения слизистой оболочки толстой кишки у больных дивертикулярной болезнью // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2009. — № 5. — С. 17-20.
17. Гудкова Р. Б., Левченко С. В., Парфенов А. И. и др. Особенности иммунного ответа на эндогенные пептиды при болезни Крона и дивертикулезе толстой кишки // Аллергол. и иммунол. — 2009. — Т. 10, № 2. — С. 264-265.
18. Лутков И. В. Изучение эффективности препарата альфа-нормикс (рифаксимин) в лечении пациентов с дивертикулярной болезнью, ассоциированной со средним и тяжелым дисбактериозом кишечника // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2009. — № 2. — С. 99-103.
19. Peek E. J., Richards D. F., Faith A. et al. Intrleukin-10 — secreting regulatory T cells induced by glucocorticouds and |32-agonist // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. — 2005. — Vol. 33. — P. 102-111.
