CC BY
24
ISSN 2412—608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 4 (168), 2016
УДК 633.854.78:582.952.6
ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЗАРАЗИХИ, ПОРАЖАЮЩЕЙ ПОДСОЛНЕЧНИК В РОССИИ, ВЫЯВЛЯЕМАЯ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМИ МАРКЕРАМИ
С.З. Гучетль, кандидат биологических наук Т.С. Антонова, доктор биологических наук Т.А. Челюстникова, старший научный сотрудник
ФГБНУ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 Тел.: (861) 275-86-53 E-mail: [email protected]
Для цитирования: Гучетль С.З., Антонова Т.С., Челюстникова Т.А. Внутрипопуляционная изменчивость заразихи, поражающей подсолнечник в России, выявляемая микросателлитными маркерами // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. - 2016. - Вып. 4 (168). - С. 10-18.
Ключевые слова: подсолнечник, заразиха, популяция, генетическое разнообразие, микроса-теллитные маркеры.
Информация о структуре популяций заразихи подсолнечника и динамике их изменчивости помогает селекционерам в выработке стратегии борьбы с этим паразитом. Целью настоящего исследования было изучение дискриминационного потенциала системы микросателлитных маркеров для определения внутрипопуляционной изменчивости О. cumana, паразитирующей на подсолнечнике в России, анализ генетического разнообразия, структуры, степени сходства и различия современных её популяций и их сравнение с популяциями из Испании и Румынии. Для работы использованы зрелые семена O. cumana восьми популяций, собранных в 2003-2014 гг. на полях подсолнечника Краснодарского, Ставропольского краёв, Ростовской области России, а также провинции Кордова в Испании и Калараши в Румынии. Исследования выполнены c применением методов определения расового состава популяций заразихи, ПЦР анализа с 10 микросателлитными локусами и анализа генетического разнообразия с
помощью программы GenAffix 6.5. Установлено, что дискриминационный потенциал использованной системы маркеров достаточно информативный для определения внутрипопуляционной изменчивости заразихи, произрастающей на территории России. Основные показатели генетического разнообразия продемонстрировали небольшой уровень внутрипопуляционного полиморфизма как российских, так и иностранных популяций заразихи. Не обнаружено явной связи между расовым составом и генетическим разнообразием популяций. Из российских популяций наибольшую генетическую изменчивость показали кагальницкая и крыловская, наименьшую -привольненская. Российские популяции отличались большей внутрипопуляционной изменчивостью, чем испанская и румынская. Генетические дистанции между российскими популяциями в основном были меньше, чем их расстояние от испанской и румынской. Уровень генетической дифференциации между исследованными популяциями, вычисленный при помощи AMOVA, оказался довольно высоким, большая часть выявленного генетического разнообразия (57 %) приходилась на межпопуляционную составляющую, внутрипопуляционная изменчивость составила 38 %, а дисперсия между индивидами внутри каждой популяции - 6 %. Различия между популяциями, вычисленные с помощью F-статистики Райта (Fst = 0,565), также свидетельствуют об их генетической дифференциации.
UDC 633.854.78:582.952.6
Intrapopulation variability of broomrape affecting
sunflower in Russia which can be discovered by
microsatellite markers.
S.Z. Guchetl, candidate of biology
T.S. Antonova, doctor of biology
T.A. Tchelustnikova, senior researcher
FGBNU VNIIMK
17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia Те1.: (861) 275-86-53 E-mail: [email protected]
Key words: sunflower, broomrape, population, genetic diversity, microsatellite markers.
Information about a structure of broomrape populations on sunflower and dynamics of it variability helps breeders to find out a strategy controlling this parasite plant. The purpose of the current research was to study a discriminating potential of a system of microsatellite markers used for determination of intrapopulation variability of О. cumana infesting sunflower crops in Russia, to analyze a genetic diversity, structure, similarity and discrepancy degree of modem
broomrape populations, and to compare populations from Russia and populations from Spain and Romania. For work we used the matured seeds of O. cumana from eight populations aollected in 20032014 in fields of Krasnodar, Stavropol and Rostov regions, as well as in provinces Cordoba, Spain and Kalarashi, Romania. During research there was determined a race structure of broomrape populations, was done PCR-analysis with ten microsatellite loci and genetic diversity was analyzed using a program GenAffix 6.5. A discriminating potential af used marker system is ascertained ta be quite informative far determination af intrapapalatian variability af braamrape, growing an the territory af Russia. The general traits af genetic diversity showed ta have a law level af intrapapulatian polymorphism bath in the Russian and foreign braamrape papulations. An obvious relation between race structure and genetic diversity af papulations was nat observed. Among the Russian papulations, kagalnitskaya and kiylavskaya appeared ta be the mast genetic variable, and prival-nenskaya ane is least variable. The Russian papulations were differed with mare intrapapulatian variability compared ta Spanish and Romanian. Genetic distances between the Russian papulations were generally less than the same ane with Spanish and Romanian. A level af genetic differentiation between studied papulations calculated by AMOVA appeared ta be rather high. The mast af revealed genetic diversity (57%) accrued ta interpapulatian part, intrapapu-latian variability was 38%, dispersion between individuals within each papulation is 6%. Differences between papulation calculated by Right's F-statistics (Fst = 0,565) also certify their genetic differentiation.
Введение. Заразиха, поражающая подсолнечник (Orobanche cumana Wallr.), -растение-паразит, в настоящее время расценивается как один из самых опасных факторов, влияющих на производство этой культуры во многих странах, где она произрастает. Образование новых, вирулентных рас заразихи происходит по мере создания и введения в производство устойчивых сортов и гибридов подсолнечника [1].
В связи с этим практический интерес представляют собой знания о процессах, происходящих в популяциях паразита. Информация о структуре популяций паразита и динамике их изменчивости помогает селекционерам в выработке стратегии борьбы с ним. Отвечая на потребность практической селекции в новых знаниях о развитии популяций
заразихи в отличающихся регионах возделывания подсолнечника, ученые разных стран проводят исследования генетического разнообразия внутри и между популяциями О. cumana с использованием различных типов молекулярных маркеров.
G. Gagne с соавторами [2] изучали генетическое разнообразие у восьми популяций этого вида заразихи из нескольких стран, используя RAPD-маркеры. Они определили большую межпопуляцион-ную и слабую внутрипопуляционную изменчивость, сделали вывод о существовании двух основных генофондов: один объединяет популяции из Восточной Европы, другой включает популяции из Южной Испании. R. Pineda-Martos с соавторами [3] определены два основных генофонда О. cumana в Испании, состоящие из популяций из долины Гвадалквивир (Южная Испания) и провинции Куэнка (Центральная Испания) соответственно. Обе группы были генетически далеки, но внутри- и межпопуляционная изменчивость были в целом крайне низки внутри каждого генофонда. Тем не менее некоторое число популяций показало большее генетическое разнообразие, которое было связано с перекрёстным опылением между особями из обоих генофондов. Моле-кулярно-генетическая вариабельность популяций заразихи изучалась также в Молдавии и Турции [4; 5].
В наших работах [6; 7; 8] была изучена генетическая изменчивость между популяциями заразихи O. cumana, паразитирующей на подсолнечнике в России, Румынии и Казахстане с использованием различных типов молекулярных маркеров. Была обнаружена небольшая дифференциация между популяциями из стран бывшего СССР и Румынии, независящая от их расового состава.
Целью настоящего исследования было изучение дискриминационного потенциала системы микросателлитных маркеров для определения внутрипопуляционной изменчивости О. cumana, паразитирую-
щей на подсолнечнике в России, анализ генетического разнообразия, структуры, степени сходства и различия современных её популяций и их сравнение с популяциями из Испании и Румынии.
Материалы и методы. Зрелые семена O. cumana восьми популяций были собраны в 2003-2014 гг. на полях подсолнечника в Краснодарском, Ставропольском краях и Ростовской области России, а также в провинции Кордова в Испании и Калараши в Румынии и хранились при -18 оС. Для определения расового состава популяций пользовались методикой, описанной в 2014 г. в нашей работе [6]. Для анализа использовали молодые цветоносы заразихи с корней растений подсолнечника сорта ВНИИМК 8883, восприимчивого ко всем современным расам заразихи. Для изучения внутрипопуляци-онного разнообразия в качестве матрицы для амплификации ПЦР была использована ДНК из 10 индивидуальных, случайно отобранных растений.
ДНК выделяли из замороженных цветоносов по методике J.J. Doyle и J.L. Doyle [9] с нашими модификациями. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мМ сульфата аммония; 1,5-3 мМ MgCh; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мМ дезок-сирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Москва, Сибэнзим). Для амплификации применяли термоциклер S1000™ (BioRad, США). Условия амплификации: начальная денатурация при 96 оС в течение 2 мин, затем 30 циклов при соблюдении температурно-времен-ного режима: отжиг при 60 оС в течение 40 с, элонгация - 1 мин при 70 оС, денатурация при 94 оС - 30 с, финальная элонгация - 2 мин. Использовали 12 SSR (simple sequence repeat) праймеров, которые были отобраны нами ранее [6].
Электрофорез продуктов амплификации проводили в полиакриламидном геле
(B %, 1 х ТБЕ) с использованием камеры VE-20 для вертикального электрофореза (Хеликон, РФ) при 100 V. Последующее окрашивание осуществляли бромистым этидием. Визуализация результатов электрофореза с помощью ультрафиолетового излучения и их документирование обеспечивались при помощи системы цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция). В качестве маркера молекулярного веса использовался 100-bp DNA ladder (Thermo Fisher Sciencific Inc, Lithuania). Подсчет размеров фрагментов после электрофореза был выполнен при помощи программного обеспечения Bio-Capture (Vilber Lourmat, Франция).
Индекс полиморфного содержания (PIC) [10] и эффективное число аллелей (ne) [11] для всех популяций в целом вычисляли по формулам:
PIC = 1 -ZJ=iP2 ' 0)
где - Р частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов;
*-1 /Zj= i (2)
Основные показатели генетической изменчивости популяций (число аллелей на локус Na, эффективное число аллелей Ne, полиморфность Р, наблюдаемая Но и ожидаемая Не гетерозиготность, информационный индекс Шеннона I), а также анализ молекулярной вариансы АMOVA (Analysis of Molecular Variance), показатели F статистики Райта, генетические дистанции и генетическое сходство по Нею определяли с помощью программы GenAffix б.5 [12].
Результаты и обсуждение. В результате идентификации расового состава популяций заразихи для каждого изучаемого варианта были определены расы, преобладающие в образце семян (табл. 1). Наименее вирулентная раса Е была выявлена в образце семян заразихи, собранных
в окрестностях станицы Привольная Краснодарского края в 2003 г. Также раса Е встречалась в образце семян, собранных в Ростовской области, в Азовском районе в 2012 г. Здесь же присутствовали также расы Б и О. Только раса Б была обнаружена в популяции заразихи из провинции Кордоба, Испания. В остальных популяциях преобладали расы Б и О. В образцах семян из Новоалександровского ЕСУ (Ставропольский край) и Калараши (Румыния), кроме выше указанных рас, встречалась и раса Н. В общем расовый состав семян заразихи из разных популяций отличался разнообразием.
Таблица 1
Характеристика образцов О. ситапа, использованных для анализа
Из 12 микросателлитных праймеров, использованных в работе, были отобраны 10, показавшие полиморфизм амплифици-рованных фрагментов ДНК. В результате амплификации десяти микросателлитных локусов у заразихи из восьми популяций было выявлено 22 аллеля, от 2 до 4 аллелей на локус. Для определения дискриминационного потенциала использованной системы маркеров были вычислены наблюдаемое и эффективное число аллелей и индекс полиморфного информационного содержания (PIC) по всем популяциям в целом (табл. 2).
Таблица 2
Характеристика 10 микросателлитных локусов ДНК, использованных для оценки внутрипопуляционных генетических различий восьми популяций О. ситапа
Локус Размер фрагмента ДНК (пн) Количество аллелей Эффективное число аллелей PIC*
Ocum-52 114, 131 2 1,92 0,48
Ocum-59 90, 100 2 2,00 0,50
Ocum-70 120,127 2 2,00 0,50
Ocum-81 72, 90 2 1,54 0,35
Ocum-87 132, 136, 134,138 4 2,77 0,64
Ocum-108 144, 152 2 2,00 0,50
Ocum-141 186, 191 2 1,92 0,48
Ocum-196 192, 197 2 2,00 0,50
Ocum-197 104, 113 2 1,92 0,48
Ocum-174 186, 190 2 1,11 0,10
Среднее 2,2 1,91 0,45
*PIC - индекс полиморфного информационного содержания
Среднее число аллелей на локус для использованной системы маркеров составило 2,2. Показатели эффективного числа аллелей варьировали от 1,11 у локуса Ocum-174 до 2,77 у Ocum-87, со средним значением 1,91. Средняя величина эффективного числа аллелей немного ниже, чем среднее число аллелей по всем популяциям, что согласуется с результатами попу-ляционных исследований у других видов животных и растений. Полученные величины PIC находились в диапазоне от 0,10 у локуса Ocum-174 до 0,64 у Ocum-87. Среднее значение индекса полиморфного информационного содержания для изученной группы генотипов 0,45, что свидетельствует о достаточной информативности используемой маркерной системы. Наиболее высокий полиморфизм у изученных популяций выявила праймерная пара Ocum-87.
При изучении внутрипопуляционного генетического разнообразия было установлено, что процент полиморфных локусов для каждой российской популяции составил от 40 у привольненской до 80 у кагальницкой и крыловской (табл. 3). В сравнении с популяциями из России у популяций из Испании и Румынии - 0 и 20 %
Место сбора семян заразихи Страна Год сбора Расы, преобладающие в образце семян
Ростовская область, Кагальницкий район Россия 2012 G
Краснодарский край, ст. Привольная Россия 2003 E
Ставропольский край, ГСУ Новоалександровск Россия 2014 F, G, H
Волгоградская область, Новоаннинский район Россия 2013 F, G
Краснодарский край, Крыловский район Россия 2012 G
Ростовская область, Азовский район Россия 2012 E, F, G
Калараши Румыния 2014 F, G, H
Кордоба Испания 2014 F
соответственно. В среднем процент полиморфных локусов составил 50.
Таблица 3
Основные показатели генетического разнообразия популяций О. ситапа, выявленные по десяти микросателлитным локусам ДНК
Примечание: Na - число аллелей на локус; Ne -эффективное число аллелей; I - информационный индекс Шеннона; Ho - наблюдаемая гетерозигот-ность; He - ожидаемая гетерозиготность; % P -процент полиморфных микросаттелитных локусов
Отдельно для каждой популяции были вычислены основные показатели их генетической изменчивости, а также молекулярная варианса AMOVA (Analysis of Molecular Variance), F статистика Райта и генетические дистанции и сходство по Нею.
Анализ генетической изменчивости для российских популяций показал, что число аллелей на локус колебалось от 1,4 у популяции заразихи из станицы Привольной до двух у популяции из станицы Крыловской. Эффективное число аллелей составило от 1,14 у популяции заразихи из станицы Привольной до 1,64 у популяции из станицы Крыловской. Наибольшая величина информационного индекса Шеннона, отражающего внутрипопуля-ционное генетическое разнообразие, у крыловской популяции (0,50), наименьшее - в станице Привольной (0,16) (табл. 3). У азовской популяции паразита было самое высокое значение наблюдаемой ге-терозиготности Ho (0,11), в то время как у новоаннинской и крыловской оно равня-14
лось 0,00. Значения ожидаемой гетерози-готности Не (оценка уровня генетической изменчивости в популяции) колебались от 0,09 у привольненской популяции до 0,34 у кагальницкой. Все образцы заразихи из Испании были гомозиготны и мо-номорфны, следствием чего явились низкие показатели генетической изменчивости. Продемонстрирована их внутри-популяционная однородность (табл. 3). Популяция из Румынии в основном показала меньшее разнообразие, чем российские популяции.
Уровень генетической дифференциации между популяциями количественно оценили с помощью вычисления генетических дистанций Ней (табл. 4). Наименьшее расстояние среди российских популяций обнаружилось между крыловской и новоалександровской (0,126), наибольшее - между азовской и крыловской (0,940). Значительные дистанции от российских показала популяция из Испании -от 0,456 с кагальницкой до 0,970 с привольненской. У румынской популяции дистанции с российскими менее значительны - от 0,150 с крыловской до 0,894 с новоаннинской. Также значительна генетическая дистанция между румынской и испанской популяциями заразихи - 0,981.
Таблица 4
Показатели генетического расстояния (под диагональю) и сходства (над диагональю) между изучаемыми популяциями по микросателлитным маркерам
*Обозначения: Популяции: Popí - кагальницкая; Pop2 - привольненская; Pop3 - новоалександровская; Pop4 - новоаннинская; Pop5 - крыловская; Pop6 - азовская; Pop7 -Кордоба; Pop8 - Калараши
Популяции Na Ne I Ho He % P
Кагальницкая 1,80 ± 0,13 1,60 ± 0,12 0,49 ± 0,08 0,05 ± 0,02 0,34 ± 0,06 80
Привольненская 1,40 ± 0,16 1,14 ± 0,06 0,16 ± 0,07 0,04 ± 0,02 0,09 ± 0,04 40
Новоалександровская 1,70 ± 0,15 1,46 ± 0,12 0,39 ± 0,09 0,01 ± 0,01 0,27 ± 0,06 70
Новоанненская 1,70 ± 0,30 1,35 ± 0,14 0,30 ± 0,12 0,00 ± 0,00 0,19 ± 0,07 50
Крыловская 2,00 ± 0,25 1,64 ± 0,18 0,50 ± 0,11 0,00 ± 0,00 0,32 ± 0,06 80
Азовская 1,60 ± 0,16 1,34 ± 0,13 0,30 ± 0,09 0,11 ± 0,04 0,20 ± 0,06 60
Кордоба 1,0 ± 0,00 1,0 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0
Калараши 1,20 ± 0,13 1,16 ± 0,11 0,12 ± 0,08 0,02 ± 0,02 0,09 ± 0,06 20
Популяция Pop 1 Pop2 Pop3 Pop4 Pop5 Pop6 Pop7 Pop8
Pop1* - 0,752 0,769 0,634 0,761 0,788 0,773 0,740
Pop2 0,285 - 0,682 0,379 0,676 0,687 0,650 0,530
Pop3 0,263 0,383 - 0,603 0,765 0,882 0,664 0,656
Pop4 0,273 0,392 0,267 - 0,692 0,668 0,391 0,861
Pop5 0,238 0,376 0,126 0,329 - 0,404 0,778 0,558
Pop6 0,257 0,431 0,409 0,407 0,940 - 0,251 0,327
Pop7 0,456 0,970 0,507 0,501 0,720 0,665 - 0,409
Pop8 0,301 0,635 0,421 0,894 0,150 0,584 0,981 -
Распределение общей генетической изменчивости между исследованными популяциями и в их пределах изучали методом анализа молекулярной дисперсии (AMOVA). Анализ молекулярной вариан-сы продемонстрировал существенные различия между популяциями и несколько меньшие внутри популяций. Большая часть дисперсии (57 % от общей) была обусловлена различиями между популяциями. Значительная часть дисперсии (38 %) обусловлена различиями внутри популяций. И, наконец, дисперсия между индивидами внутри каждой популяции составила наименьшую величину - 6 % (табл. 5). Таким образом, уровень дифференциации между исследованными популяциями оказался довольно высоким, большая часть выявленного генетического разнообразия приходится на межпопу-ляционную составляющую.
Таблица 5
Результаты ЛЫОУЛ анализа общего генетического разнообразия в восьми популяциях О. ситапа
Таблица 6
Значения показателей F-статистики Райта: Fis, Fit, Fst для восьми популяций
Источник разнообразия Число степеней свободы df Сумма квадра тов Доля в общей дисперсии P*
абс. значения %
Между популяциями 7 204,156 1,361 57 <0,001
Внутри популяций 72 140,350 0,903 38
Между индивидуумами 80 11,500 0,144 6
Всего 159 356,006 2,407 100
* Р - вероятность
Вычисление показателей структуры подразделенной популяций (F-статистика Райта) показало высокое значение Fis, отражающего инбридинг особи относительно популяции. Это свидетельствует о том, что в изученных популяциях заразихи наблюдается дефицит (Fis = 0,863) гетерозиготных генотипов, вызванный инбридингом. Также значителен показатель, отражающий инбридинг особи относительно вида в целом: Fit = 0,940. Различия между популяциями (Fst = 0,565; табл. 6) свидетельствуют об их генетической дифференциации.
F-статистика Значение Вероятность(P)
Fst 0,565 0,001
Fis 0,863 0,001
Fit 0,940 0,001
Таким образом, основные показатели генетического разнообразия, выявленные по десяти микросателлитным локусам, продемонстрировали, что практически во всех популяциях эффективное число аллелей было ниже, чем число аллелей на локус. Наблюдаемая гетерозиготность Но у всех популяций не превышала ожидаемую. Анализ молекулярной вариансы AMOVA также показал, что дисперсия между индивидами внутри каждой популяции составила всего 6 %. Эти данные свидетельствуют о небольшом уровне внутрипопуляционного полиморфизма как двух иностранных, так и шести российских популяций заразихи. Не обнаружено явной связи между расовым составом и генетическим разнообразием популяций. При этом отмечено, что по показателям % Р, I и Не среди популяций из России наибольшее генетическое разнообразие показывают кагальницкая и крыловская, в состав которых входит лишь вирулентная раса G. Наименьшими значениями обладает популяция из окрестностей станицы Привольная, в состав которой входит лишь раса Е. В сравнении с популяциями из России, испанская и румынская показали меньшую генетическую изменчивость. Все образцы заразихи из Испании были гомозиготны и мономорфны. Показатели генетического разнообразия популяции из Румынии выше, чем у испанской, но ниже, чем у российских. Полученные данные о крайне низкой внутрипопуляционной изменчивости испанской популяции согласуются с результатами, полученными R. Pineda-Martos с соавторами [3]. В исследовании L. Molinero-Ruiz с соавторами [13], молекулярный анализ методом RAPD среди высоко вирулентных популяций О. сита-
na из Центральной Испании, Венгрии, Южной Испании и Турции выявил внут-рипопуляционную генетическую однородность паразита. Авторы предполагают, что малое генетическое меж- и внутрипо-пуляционное разнообразие испанских популяций заразихи возникло на основе общего их происхождения от ограниченного числа растений-родоначальников (эффект основателя).
Большее генетическое разнообразие российских популяций заразихи, в сравнении с румынскими, было отмечено в исследовании [6], выполненном для O. cumana, паразитирующей на подсолнечнике в России, Румынии и Казахстане, с использованием кодоминантных микросател-литных маркеров. Было высказано предположение, что внутрипопуляцион-ный полиморфизм российских популяций заразихи базируется на генетическом разнообразии сортов подсолнечника, которые возделывались в республиках бывшего СССР. В том же исследовании генетическое расстояние между объединенными пулами - российско-казахским и румынским, составило 0,137. В данной работе дистанции у российских популяций от испанской более значительны - от 0,456 до 0,970. У румынской популяции дистанции от российских менее значительны - от 0,150 до 0,894. G. Gagne с соавторами [2] при использовании RAPD-маркеров для изучения генетической изменчивости у популяций из Болгарии, Турции, Румынии и Испании установили, что испанские популяции были генетически отдалены от других восточноевропейских популяций. Наши исследования также показали значительную дистанцию между румынской (Калараши) и испанской (Кордоба) популяциями заразихи (0,981). В своем исследовании R. Pineda-Martos с соавторами [3] предполагают, что большое генетическое расстояние между популяциями из разных мест, географически отдаленных, может объясняться происхождением семян, интродуцированных из разных областей.
Полученные нами данные о генетических дистанциях свидетельствуют в пользу этой гипотезы.
Проведенные нами исследования выявили, что российские популяции паразита имеют большее генетическое родство по отношению друг к другу (за небольшим исключением) и меньшее - по отношению к иностранным. Это согласуется с данными ряда ученых, установивших, что популяции О. ситапа группируются соответственно географического происхождения, независимо от расового состава [2; 3; 6; 13].
Уровень генетической дифференциации между исследованными популяциями, вычисленный при помощи AMOVA и F-cтaтиcтики Райта, оказался довольно высоким, большая часть выявленного генетического разнообразия приходится на межпопуляционную составляющую. Ранее в нашей работе [7] не было выявлено существенной дифференциации между популяциями заразихи юга России, Казахстана и Румынии, проанализированных с использованием RAPD-лoкycoв. Микросателлитные маркеры позволили с большей точностью дифференцировать генетические пулы заразихи, показав различия между популяциями из Румынии и стран бывшего СССР [6], хотя эти различия были признаны также незначительными. Результаты данной работы показали большую дифференциацию между исследованными восемью популяциями. Это может объясняться несколькими причинами. Во-первых, изучение внутрипопуляционной структуры методом анализа отдельных особей позволяет точнее определить различия внутри и между популяциями. Во-вторых, для анализа был использован другой набор популяций заразихи. Использование в сравнительном исследовании популяции из Испании, наиболее удаленной от российских, увеличило значение показателя генетической дифференциации. Свой вклад внесла и популяция из станицы Привольная. Образец её семян был соб-
ран более 10 лет назад, чем семена других популяций, и она отличалась наименьшими вирулентностью и внутрипопуля-ционным генетическим разнообразием. Таким образом, высокий уровень дифференциации может быть обусловлен пространственной и временной изоляцией данных популяций друг от друга. Высокая оценка Fst (0,565) также характерна для видов самоопылителей [2; 14]. И хотя недавнее исследование с использованием гена, который определяет отсутствие ан-тоциановой пигментации, выявило возникновение относительно высокой частоты перекрестного опыления у растений О. cumana (от 14,8 до 40,0 %) [15], основываясь на малом внутрипопуляци-онном генетическом разнообразии [2] и структуре цветка [16] ранее было сделано заключение о преобладании у заразихи процессов самоопыления. Наше исследование подтверждает этот вывод.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что дискриминационный потенциал использованной системы маркеров достаточно информативный для определения меж- и внутрипопуляционной изменчивости заразихи, произрастающей на территории России. В целом популяции характеризуются невысоким уровнем внутрипопуля-ционного генетического разнообразия и высокой степенью межпопуляционной дифференциации. Из российских популяций наибольшую генетическую изменчивость показывают кагальницкая и крыловская, наименьшую - привольнен-ская. Российские популяции отличаются большей внутрипопуляционной изменчивостью, чем испанская и румынская. Генетические дистанции между российскими популяциями в основном меньше, чем их расстояние от испанской и румынской.
Список литературы
1. Antonova T.S., Araslanova N.M., Strelnikov EA., Ramazanova S.A., Tchelustnikova S.A., Guchetl S.Z. Distribution of highly virulent races of sunflower broomrape (Orobanche cumana Wallr.) in the south-
ern regions of the Russian Federation // Russian Agricultural Sciences. - 2013. - Т. 39. - С. 46.
2. Gagne G., Roeckel-Drevet P., Grezes-Besset B., Shindrova P., Ivanov P., Grand-Ravel С., Vear F., Tourvieille de Labrouhe D., Charmet G., Nicolas P. Study of the variability and evolution of Orobanche cumana populations infesting sunflower in different European countries // Theor. and Appl. Genet. -1998. - V. 96. - P. 1216-1222.
3. Pineda-Martos R., Ve lasco L., Fernandez-Escobar J., Fernandez-Martinez J. M., and Perez-Vich B. Genetic diversity of Orobanche cumana populations from Spain assessed using SSR markers // Weed Research. - 2013. - V. 53. - P. 279-289.
4. Sestacova T., Cucereavii A., Tabara O., Port A., Duca M. Genetic variability of broomrape populations from republic of Moldova // Proc. of 19th International Sunfl. Conf., Edirne, Turkey, June. - 2016. -P. 608.
5. Ziadi S., Ay din Y., Evci G., Altinkut Uncuoglu A. The molecular genetic diversity of the broomrape (Orobanche cumana Wallr.) populations of Turkey // Proc. of 19th Intern.l Sunfl. Conf., Edirne, Turkey. -2016. - P. 702.
6. Гучетль С.З., Антонова Т.С., Челюстникова Т.А. Межпопуляционнная генетическая дифференциация Orobanche cumana Wallr. из России, Казахстана и Румынии, с использованием молекулярно-генетических маркеров // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2014. - Вып. 1 (157158). - С. 108-114.
7. Гучетль С.З., Челюстникова Т.А., Рамазано-ва С.А. Межпопуляционная изменчивость Orobanche cumana Wallr., поражающей подсолнечник в регионах юга России, выявляемая молекулярно-генетическими маркерами // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2011. - № 1 (146147). - С. 119-122.
8. Челюстникова Т.А., Гучетль С.З., Антонова Т.С. Молекулярно-генетическая дифференциация популяций Orobanche cumana Wallr. различного географического происхождения с использованием RAPD локусов ДНК // Наука Кубани. - 2015. -№ 4. - С. 50-55.
9. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. - 1987. - V. 19. - P. 11-15.
10. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях: Научно-методическое руководство / Под ред. Сиволапа Ю.М. -Киев: Аграрна наука, 1998. - 156 с.
11. Айала Ф., Кайгер Д. Современная генетика. -М.: Мир, 1988. - Т. 3. - 332 c.
12. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and researchan update // Bioinformatics. -2012. - P. 1-3.
13. Molinero-Ruiz L., García-Carneros A. B., Collado-Romero M., Raranciuc S., Domínguez J. and
Melero-Vara J.M. Pathogenic and molecular diversity in highly virulent populations of the parasitic weed Orobanche cumana (sunflower broomrape) from Europe // Weed Research. - 2014. - V. 54 (1). - P. 87-96.
14. Hamrick J.L. and Godt M.J. W. Allozyme diversity in plant species // In: Plant Population Genetics, Breeding, and Genetic Resources. - Brown, A.H.D., Clegg, M.T., Kahler, A.L. and Weir, B.S. - Eds.: Sinauer Associates, Sunderland, MA. - 1989. - P. 43-63.
15. Rodrguez-Ojeda M.I., Fernandez-Martinez J.M., Velasco L., Perez-Vich B. Extent of cross-fertilization in Orobanche cumana Wallr. // Biologia Plantarum. - 2013. -Vol. 53. - Is. 3. - P. 559-562.
16. Satovic Z., Joel D.M., Rubiales D., Cubero J.I., Roman B. Population genetics in weedy species of Orobanche // Australian Plant Pathology. - 2009. -V. 38. - P. 228-234.
References
1. Antonova T.S., Araslanova N.M., Strelnikov E.A., Ramazanova S.A., Tchelustnikova S.A., Guchetl S.Z. Distribution of highly virulent races of sunflower broomrape (Orobanche cumana Wallr.) in the southern regions of the Russian Federation // Russian Agricultural Sciences. - 2013. - T. 39. - S. 46.
2. Gagne G., Roeckel-Drevet P., Grezes-Besset B., Shindrova P., Ivanov P., Grand-Ravel S., Vear F., Tour-vieille de Labrouhe D., Charmet G., Nicolas P. Study of the variability and evolution of Orobanche cumana populations infesting sunflower in different European countries // Theor. and Appl. Genet. - 1998. - V. 96. -P. 1216-1222.
3. Pineda-Martos R., Velasco L., Fernandez-Escobar J., Fernandez-Martinez J. M., and Perez-Vich B. Genetic diversity of Orobanche cumana populations from Spain assessed using SSR markers // Weed Research. - 2013. - V. 53. - P. 279-289.
4. Sestacova T., Cucereavîi A., Tabârâ O., Port A., Duca M. Genetic variability of broomrape populations from republic of Moldova // Proc. of 19 th International Sunfl. Conf., Edirne, Turkey, June. - 2016. - P. 608.
5. Ziadi S., Aydin Y., Evci G., Altinkut Uncuoglu A. The molecular genetic diversity of the broomrape (Orobanche cumana Wallr.) populations of Turkey // Proc. of 19th Intern.l Sunfl. Conf., Edirne, Turkey. -2016. - P. 702.
6. Guchetl' S.Z., Antonova T.S., Chelyustnikova T.A. Mezhpopulyatsionnnaya geneticheskaya different-siatsiya Orobanche cumana Wallr. iz Rossii, Kazakh-
stana i Rumynii, s ispol'zovaniem molekulyarno-geneticheskikh markerov // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2014. - Vyp. 1 (157-158). -S. 108-114.
7. Guchetl' S.Z., Chelyustnikova T.A., Ramazanova S.A. Mezhpopulyatsionnaya izmenchivost' Orobanche cumana Wallr., porazhayushchey podsolnechnik v re-gionakh yuga Rossii, vyyavlyaemaya molekulyarno-geneticheskimi markerami // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2011. - № 1 (146-147). - S. 119-122.
8. Chelyustnikova T.A., Guchetl' S.Z., Antonova T.S. Molekulyarno-geneticheskaya differentsiatsiya populyatsiy Orobanche cumana Wallr. razlichnogo geograficheskogo proiskhozhdeniya s ispol'zovaniem RAPD lokusov DNK // Nauka Kubani. - 2015. - № 4. -S. 50-55.
9. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phyto-chem. Bull. - 1987. - V. 19. - P. 11-15.
10. Ispol'zovanie PTsR-analiza v genetiko-selektsionnykh issledovaniyakh: Nauchno-metodicheskoe rukovodstvo / Pod red. Sivolapa Yu.M. -Kiev: Agrarna nauka, 1998. - 156 s.
11. Ayala F., Kayger D. Sovremennaya genetika. -M.: Mir, 1988. - T. 3. - 332 s.
12. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and researchan update // Bioinformatics. - 2012. - P. 1-3.
13. Molinero-Ruiz L., García-Carneros A. B., Collado-Romero M., Raranciuc S., Domínguez J. and Melero-Vara J.M. Pathogenic and molecular diversity in highly virulent populations of the parasitic weed Orobanche cumana (sunflower broomrape) from Europe // Weed Research. - 2014. - V. 54 (1). - P. 87-96.
14. Hamrick J.L. and Godt M.J.W. Allozyme diversity in plant species // In: Plant Population Genetics, Breeding, and Genetic Resources. - Brown, A.H.D., Clegg, M.T., Kahler, A.L. and Weir, B.S. - Eds.: Sinauer Associates, Sunderland, MA. - 1989. - P. 43-63.
15. Rodrguez-Ojeda M.I., Fernandez-Martinez J.M., Velasco L., Perez-Vich B. Extent of cross-fertilization in Orobanche cumana Wallr. // Biologia Plantarum. -2013. -Vol. 53. - Is. 3. - P. 559-562.
16. Satovic Z., Joel D.M., Rubiales D., Cubero J.I., Roman B. Population genetics in weedy species of Orobanche // Australian Plant Pathology. - 2009. - V. 38. -P. 228-234.
