CC BY
39
ISSN 0202 -5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (157-158), 2014
Защита и иммунитет
МЕЖПОПУЛЯЦИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ Orobanche cumana Wallr. ИЗ РОССИИ, КАЗАХСТАНА И РУМЫНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ
С.З. Гучетль,
кандидат биологических наук
Т.С. Антонова,
доктор биологических наук
Т.А. Челюстникова,
старший научный сотрудник
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, д. 17 Тел.: (861)275-86-53 E-mail: antonova-ts@mail.ru
Изучено молекулярно-генетическое разнообразие популяций заразихи O. cumana, паразитирующей на подсолнечнике в России, Румынии и Казахстане, с использованием кодоминантных микросателлитных маркеров. При кластерном анализе популяции заразихи разделились на два кластера, независимо от их расового состава. Один группировал 19 образцов из России и Казахстана, представляющих собой один генетический пул, а другой - 5 популяций из Румынии, объединенные во второй пул. Генетическая дистанция между кластерами по Неи составила 0,137. Анализ молекулярной вариансы AMOVA выявил, что 22 % от общей дисперсии обусловлено различиями между генетическими пулами, а большая часть дисперсии - 78 % - различиями между индивидами внутри каждого пула. Попарные сравнения, выполненные при помощи F статистики Райта показали, что различия между этими двумя генетическими пулами достаточны (Fst =21,9 %), чтобы говорить о существовании небольшой генетической дифференцированности между ними. Основные показатели генетической изменчивости для каждого из двух пулов выявили, что популяции заразихи из стран бывшего СССР характеризуются более высоким уровнем внутрипопу-ляционного разнообразия, нежели популяции из Румынии. Молекулярно-генетические различия между популяциями заразихи, паразитирующей на подсолнечнике на постсоветском пространстве и в Румынии, были незначительны. Обсуждаются возможные причины полученных результатов.
The interpopulation genetic differentiation of Orobanche cumana Wallr. from Russia, Kazakhstan and Romania by using molecular genetic markers. Guchetl S.Z., Antonova T.S., Chelyustnikova T.A.
The molecular genetic diversity of broomrape populations of O.cumana, parasitizing on sunflower in Russia, Romania, and Kazakhstan, by using co-dominant microsatellite markers was studied. During cluster analysis the broomrape populations were divided into two clusters, regardless of their racial composition. One cluster grouped 19 samples from Russia and Kazakhstan, representing one gene pool, and the other - 5 populations from Romania, combined into second gene pool. The genetic distance between clusters according to Nei was 0.137. The analysis of molecular variance AMOVA revealed that 22 % of the overall dispersion was due to the differences among the genetic pools and the most part of dispersion - 78 % - was due to the differences between individuals within each genetic pool. The pairwise comparisons made using Wright's F statistics showed that the differences between these two genetic pools are sufficient (Fst = 21.9 %) to state the existence of a small genetic differentiation between them. Descriptive population genetic statistics for each of the two pools showed that the broomrape populations from the former Soviet Union countries are characterized by a higher level of intrapopulation diversity than the populations from Romania. Mo-
lecular genetic differences between broomrape populations parasitizing on sunflower on the post-Soviet territory and in Romania were insignificant. Possible reasons for these results are being discussed.
Ключевые слова: заразиха, подсолнечник, SSR-локусы, генетическое сходство
УДК 582.952.6:633.854.78
Заразиха подсолнечная (Orobanche cumana Wallr.) - облигатный паразит из высших растений, паразитирующий на корнях подсолнечника. При сильном поражении заразихой потери урожая подсолнечника могут достигать 100 %. Так же, как и в других странах, в России повсеместная интенсификация возделывания подсолнечника как высокодоходной культуры в последнее десятилетие привела к формированию высоковирулентных биотипов заразихи, преодолевших устойчивость возделываемого сортимента [1].
Актуальны исследования эволюции паразита и генетической структуры популяций для понимания закономерностей его развития в разных странах и выработки долгосрочной стратегии контроля над ним [2; 3].
Молекулярно-генетические различия между популяциями O. cumana из разных стран уже изучались [4; 5; 6]. С использованием техники RAPD ПЦР было показано, что популяции O. cumana из Болгарии, Испании, Румынии и Турции обладают малой внутрипопуляционной изменчивостью и между индивидами из различных географических областей происходит очень небольшой генный обмен [7]. Показан слабый полиморфизм популяций O. cumana из Испании, Югославии и Румынии [4]. Выявлено существование двух отдаленных генофондов в двух провинциях Испании: одного в Куэнка и другого - в Долине Гвадалквивира. Внутри каждого генофонда как меж-, так и внутрипопуляционная изменчивости были чрезвычайно низки [8]. Популяции из Центральной Испании, Венгрии, Южной Испании и Турции были сгруппированы согласно районам происхождения в четыре кластера в результате
проведения молекулярного анализа среди высоковирулентных популяций O. cumana. Показана их внутрипопуляционная однородность [9].
Молекулярно-генетические различия популяций O. cumana, поражающей подсолнечник в разных регионах России и Казахстана, ещё не были изучены. Целью нашего исследования является анализ мо-лекулярно-генетического разнообразия между популяциями заразихи, распространенной на территории России, и сравнение их с популяциями из Румынии и Казахстана с применением кодоми-нантных микросателлитных маркеров.
Материал и методы. Семена O. cumana 24 популяций были собраны в 2012 и 2013 гг. на полях подсолнечника Краснодарского, Ставропольского краёв, Ростовской, Волгоградской и Саратовской областей России, а также Румынии и Казахстана и хранились при -18 оС (табл. 1).
Для искусственного заражения заразихой растения подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 выращивали в камере искусственного климата в пластиковых ящиках ёмкостью 10 кг смеси почвы с речным песком в соотношении 3 : 1. Этот сорт никогда не был селектирован на устойчивость к заразихе. Семена заразихи вносили в почвенную смесь из расчёта 100 мг на 1 кг. Семена подсолнечника высевали по 20 шт. в каждый ящик. Полив осуществляли при подсыхании верхнего слоя почвы. Режим работы камеры: 16-часовой фотопериод при температуре 25-27 оС днём и 20 оС ночью. Через 50 дней после появления всходов растения выкапывали из ящиков, отмывали корневую систему водой и отбирали клубеньки, стебли и соцветия заразихи для анализа. Свежесобранная ткань хранилась при -80 °C.
ДНК выделяли из замороженных тканей по методике Doyle [10] с нашими модификациями. Для экстракции ДНК заразихи из каждой популяции была взята смесь из 5-10 индивидуальных растений равной массы.
Таблица 1
Характеристика образцов семян O. cumana, использованньх для анализа
№ Место сбора семян заразихи Страна Год сбора Расы, преобладающие в образце семян
V1 Краснодарский край: Крыловской район Россия 2012 G
V2 Ейский район Россия 2013 F,G
V3 Ставропольский край, Труновский район Россия 2012 F,G
V4 Ростовская область: Азовский р-н, ДОС ВНИИМК Россия 2012 E,F,G
V5 Милютинский район Россия 2012 G
V6 Азовский р-н, с. Круглое Россия 2012 G
V? Боковский район Россия 2012 F,G
V8 Зерноградский район Россия 2012 F,G
V9 Матвеево-Курганский р-н Россия 2012 F,G
V10 Матвеево-Курганский р-н Россия 2012 G
V11 Боковский район Россия 2012 F,G
V12 Боковский район Россия 2012 F,G
V13 Зерноградский район Россия 2012 F
V14 Зерноградский район, конезавод Россия 2012 F,G
V15 Кагальницкий район Россия 2012 G
V16 Саратовская область, Советский район Россия 2013 E,F,G
V1? Волгоградская область: Алексеевский район Россия 2013 F,G
V18 Новоаннинский район Россия 2013 F,G
V19 Шемонаихинский район, Усть-Каменогорск Казахстан 2012 D
V20 Меджидия Румыния 2013 G
V21 Калараси Румыния 2013 G
V22 Тулчеа Румыния 2013 G
V23 Урзицени Румыния 2013 D
V24 Лунка Румыния 2013 G
Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мМ сульфата аммония; 1,5-3 мМ MgCh; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мМ дезоксирибонуклеозидфосфа-тов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Москва, Сибэнзим). Для амплификации применяли термоциклер S1000™ (BioRad, США). Условия амплификации: начальная денатурация при 96 оС в течение 2 мин, затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 60 оС в течение 40 с, элонгация -1 мин при 70 оС, денатурация при 94 оС -30 с, финальная элонгация - 2 мин. Использовали 15 SSR (simple sequence repeat) праймеров, которые ранее были отобраны в работе [8].
Электрофорез продуктов амплификации проводили в полиакриламидном геле
(8 %, 1 X ТБЕ) с использованием камеры VE-20 для вертикального электрофореза (Хеликон, РФ) при 230 В. Последующее окрашивание осуществляли бромистым этидием. Визуализация результатов электрофореза в УФ и их документирование обеспечивались при помощи системы цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция). В качестве маркера молекулярного веса использовался 100-bp DNA ladder (Thermo Fisher Sciencific Inc, Lithuania). Подсчет размеров фрагментов после электрофореза был выполнен при помощи программного обеспечения BioCapture (Vilber Lourmat, Франция).
Для определения различий между образцами заразихи данные ПЦР анализа были обработаны методом Варда. Для этого состояния амплифицированных фрагментов ДНК были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в электро-форетических спектрах одинаковых по размеру фрагментов ДНК соответствовало значениям 1 и 0. Кластерный анализ выполнили с помощью пакета программ (Statistica 6.0). Геометрические дистанции вычислены с помощью Евклидова расстояния. Основные показатели генетической изменчивости популяций (число аллелей на локус Na, эффективное число аллелей Ne, полиморфность Р, наблюдаемая Но и ожидаемая Не гетерозиготности, информационный индекс Шеннона I), а также анализ молекулярной вариансы AMOVA (Analysis of Molecular Variance), показатели F статистики Райта, генетические дистанции и генетическое сходство по Нею определяли с помощью программы GenAlEx 6.5 [11].
Результаты и обсуждение. Из 15 микросателлитных праймеров, использованных в работе, были отобраны 9, показавшие полиморфизм амплифицирован-ных фрагментов. В результате амплификации девяти микросателлитных локусов у заразихи из 24 популяций был выявлен 21 аллель, от 2 до 4 аллелей на локус (табл. 2).
Таблица 2
Характеристика микросателлитных локусов, использованных для оценки генетических различий 24 популяций O. cumana
Локус Размер фрагмента ДНК (пн) Количество аллелей
Ocum-52 114, 131 2
Ocum-59 90, 100 2
Ocum-70 127, 120,130 3
Ocum-81 72, 90 2
Ocum-87 132, 136, 134, 138 4
Ocum-108 144, 152 2
Ocum-141 186, 191 2
Ocum-196 192, 197 2
Ocum-197 104, 113 2
По результатам кластерного анализа образцы O. cumana были разделены на две группы (рис. 1). Кластер I объединял 19 образцов, собранных на территории России и Казахстана. Кластер II объединил популяции заразихи, собранные в разных районах Румынии.
Рисунок 1 - Дендрограмма кластерного анализа 24 популяций О. ситапа, собранных в разных районах России, Казахстана и Румынии, проведенного на основании анализа полиморфизма по девяти SSR локусам
Кластер I подразделялся на 2 субкластера, с расстоянием объединения 5 единиц. Cубкластер ^ объединил популяции, происходящие из Краснодарского и Ставропольского краев и Боковского и Зерно-градского районов Ростовской области. В
субкластер Й попали популяции из Казахстана, Саратовской и Волгоградской областей и Матвеево-Курганского, Азовского, Кагальницкого и Милютинского районов Ростовской области. Объединение в субкластеры не зависело ни от уровня вирулентности популяции, так как популяции с различной вирулентностью были сгруппированы вместе, ни от географического происхождения (табл. 1, рис. 1). Так, например, популяции заразихи из Боковского и Зерноградского районов Ростовской области, объединенные в субкластере довольно далеко расположены друг от друга (около 200 км). Заразиха из Казахстана, географически наиболее отдаленная от российской группы популяций (расстояние свыше 2000 км и разные почвенно-климатические условия), находится в одном субкластере с популяциями из Ростовской, Волгоградской и Саратовской областей. Группирование популяций заразихи в кластеры также не зависело от их расового состава. Большая зависимость прослеживалась от происхождения из стран постсоветского пространства и Румынии. Уровень генетической дифференциации между кластерами количественно оценили с помощью вычисления генетических дистанций Неи [12]. Генетическая дистанция и генетическое сходство составили соответственно 0,137 и 0,872.
Все пять образцов заразихи из Румынии были практически идентичны. Процент полиморфных локусов Р составил 11,11. Популяции, происходящие из России и Казахстана, были более полиморфны, с процентом полиморфных локусов 100,00. Например, на рисунке 2 представлены аллельные варианты по SSR локусу Ocum-87 пяти популяций заразихи из Румынии в сравнении с пятью популяциями из России.
ISSN 0202 -5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (157-158), 2014
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 1819 М
Рисунок 2 - Аллельные варианты по SSR локусу Ocum-87 десяти популяций O. cu-mana. Румыния: 1, 2 - Меджидия; 3, 4 - Калара-си; 5, 6 - Тулчеа; 7, 8 -Урзицени; 9, 10 - Лунка; Россия: 11, 12 - Саратовская область Советский район; 13, 14 - Краснодарский край Ейский район; 15, 16 - Волгоградская область Алексеевский район; 17, 18 - Волгоградская область Новоанинский район; 19 - Ростовская область Азовский район, с. Круглое; М - фракция, длиной 100 bp.
Для определения основных показателей генетического разнообразия, анализа молекулярной вариансы AMOVA и показателей F статистики Райта, популяции O. cumana были объединены в генетические пулы по географическому происхождению. Далее, генетические пулы паразита, происходящие из России и Казахстана, обозначены как Pop1, а из Румынии -Pop2. Основные показатели генетической изменчивости двух пулов показали, что среднее число аллелей на локус колебалось от 1,11 у Pop2 до 2,33 у Pop1. Эффективное число аллелей составило от 1,05 у Pop2 и до 1,77 у Pop1. Pop1 показала самое высокое значение наблюдаемой гетерозиготности (0,44), в то время как у Pop2 наблюдаемая гетерозиготность составила 0,05. Значения средней ожидаемой гетерозиготности колебались от 0,03 у Pop2 до 0,41 у Pop1. Анализ генетического разнообразия внутри генетических пулов с использованием информационного индекса Шеннона выявил наибольшую величину разнообразия в Pop1 (0,63) и наименьшую в Рор2 (0,05) (табл. 3).
Таким образом, генетический пул, включающий популяции заразихи, паразитирующей на подсолнечнике в России и Казахстане, показал большее генетическое разнообразие, чем популяции зара-
зихи из Румынии. Это выглядит закономерным, поскольку в России и Казахстане многие популяции находятся на большом расстоянии друг от друга (от 200 до 2000 км), тогда как в Румынии они географически мало отдалены. И ассортимент выращиваемого подсолнечника, на котором паразитирует заразиха в России и Казахстане, генетически более разнородный.
Таблица 3
Основные показатели генетического разнообразия двух генетических пулов, выявленные с помощью девяти микросателлитных локусов
Генетические пулы Na Na (Freq > 5 %) Ne I Ho He
Popí 2,33± 0,23 2,11±0,26 1,77± 0,11 0,63± 0,07 0,44± 0,06 0,41± 0,04
Pop2 1,11± 0,11 1,11±0,11 1,05± 0,05 0,05± 0,05 0,04± 0,04 0,03± 0,03
Примечание: № - число аллелей на локус; № (Freq >=5 %) - число аллелей на локус с частотой > 5 %; № - эффективное число аллелей; I -информационный индекс Шеннона; Но - наблюдаемая гетерозиготность; Не - ожидаемая гетеро-зиготность
Анализ молекулярной вариансы АМОУА (характеризующий генетическую дифференциацию изучаемых популяций) выявил, что 22 % от общей дисперсии обусловлено различиями между генетическими пулами, а большая часть дисперсии - 78 % - различиями между индивидами внутри каждого пула (табл. 4).
Таблица 4
Результаты AMOVA анализа общего генетического разнообразия в двух генетических пулах О. ситапа
Число степеней свободы, df Доля в общей Доля в об-
Источник разнообразия Сумма квадратов дисперсии, абс. щей дис-пер- P
значения сии, в %
Между пулами 1 8,552 0,443 22 % <0,001
Внутри пулов 24 38,500 1,604 78 %
Всего 25 47,042 2,047 100 %
При расчете значений показателей структуры подразделенной популяции (F
статистика Райта) также было показано, что различия между Popí и Pop2 достаточны (Fst = 21,9 %; табл. 5), чтобы говорить о существовании небольшой генетической дифференцированности этих двух пулов. Этот показатель хорошо согласуется с данными анализа молекулярной вариансы. Малое значение Fis (-0,019) указывает на дефицит средних гетерози-гот в каждой популяции, а Fit, характеризующее дефицит или избыток средних гетерозигот в группе популяций, имеет среднее значение (0,205). В нашем случае популяции из Румынии практически не имеют гетерозигот, снижая этим показатель Fis.
Таблица 5
Значения показателей F статистики Райта: Fis, Fit, Fst
F-статистика Значение Вероятность (P)
Fst 0,219 0,001
Fis -0,019 0,577
Fit 0,205 0,012
Генетические пулы заразихи, паразитирующей на подсолнечнике, в странах бывшего СССР и Румынии обладают большим сходством. Наблюдается практически полное отсутствие уникальных аллелей у исследованных популяций (за исключением аллелей длиной 120 и 130 пн в локусе 0сит-70 у образцов заразихи из Труновского района Ставропольского края, Россия), большое генетическое сходство (0,872) пулов и небольшая степень дифференциации генов между популяциями в отношении частот аллелей = 21,9 %).
Наши результаты показали, что популяции заразихи из указанных трех стран группируются в кластеры согласно странам происхождения независимо от их расового состава. При этом один из кластеров объединяет популяции паразита из стран бывшего советского пространства. Объяснение этому факту может быть следующее. По нашим данным, заразиха из Казахстана отличается слабой вирулентностью и не преодолевает действие гена устойчивости Ог4 у подсолнечника. Это свидетельствует о том,
что данная популяция заразихи представлена семенами, сохранившимися в почве ещё со времён СССР. Мы полагаем, что сходство Казахской и Российских популяций заразихи и их внутрипопуляцион-ный полиморфизм базируются на генетическом разнообразии и сходстве сортов подсолнечника, которые возделы-вались в республиках бывшего СССР. Закрытость территорий СССР от сортимента иностранных государств на протяжении многих лет сформировала здесь своеобразие генофонда как подсолнечника, так и его паразита. И это некоторое своеобразие ещё не успело нивелироваться современным свободным обменом семенным материалом между странами. Многолетним паразитировани-ем на сортах, более полиморфных, нежели гибриды подсолнечника, можно объяснить то, что генетический пул заразихи стран бывшего советского пространства характеризуется более высоким уровнем внутрипопуляционного разнообразия, нежели популяции из Румынии.
Несмотря на это, генетические пулы заразихи, паразитирующей на подсолнечнике, в странах бывшего СССР и Румынии обладают большим сходством. Большое генетическое сходство между популяциями заразихи из стран постсоветского пространства и Румынии свидетельствует о малой вариабельности генома заразихи. Мы полагаем, что малая вариабельность генома O. cumana, описанная также рядом авторов (Ciuca et al., 2004; Gagne et al., 1998), может быть следствием того, что средой обитания этого растения-паразита являются метаболиты растения подсолнечника. Тогда как наружные факторы (климатические, почвенные и др.) могут воздействовать на паразита лишь опосредованно - через его хозяина. Специализация генотипа паразита, зависящая от хозяина, была показана и для популяций O. foetida, инфицирующих дикорастущие и культивируемые виды вики в Морокко [13] и в Тунисе [14]. Кроме того, учитывая, что на подсолнечнике заразиха паразитирует немногим более 100 лет, ещё рано ожидать от неё сильной изменчивости.
ISSN 0202 -5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (157-158), 2014
Данное исследование выявило существование двух слабо дифференцированных генетических пулов О. cumana: российско-казахского и румынского. Популяции заразихи постсоветского пространства более полиморфны и обладают большим внутрипопуляционным генетическим разнообразием, чем популяции заразихи из Румынии.
Авторы благодарны испанским коллегам в лице Leonardo Velasco за любезно предоставленную нуклеотидную последовательность SSR-праймеров, фирме «Syngenta» за предоставленные семена заразихи из Казахстана, а также компании «Limagrain» в лице Laszlo Hargitay и Mariana Gheorghe, предоставившим нам возможность собрать семена заразихи из пяти популяций в Румынии.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Краснодарского края, грант № 13-04-96521.
Список литературы
1. Антонова Т.С., Стрельников E.A., Араслано-ва H.M., Рамазанова C.A. Адаптивные особенности в онтогенезе заразихи Orobanche cumana Wallr. на подсолнечнике // Масличные культуры: Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2012. - Вып. 1 (150). - С. 110-116.
2. Fernandez-Martinez J.M., Martinez L. Velasco and B. Perez-Vich. Progress in research on breeding for resistance to broomrape // In: Proc. 18th Int. Sunfl. Conf., Mar Del Plata & Balcarce, Argentina Int. Sunfl. Assoc., Paris, France. - 2012. - P. 57-62.
3. Skoric, D., Pacureanu-Joita M. and Sava E. Sunflower breeding for resistance to broomrape (Orobanche cumana Wallr.) // Genetica §i ameliorarea plantelor an. I.N.C.D.A. Fundulea LXXVIII (1). -2010. - P. 63-79.
4. Ciuca M., Pacureanu M. and Iuora M. RAPD markers for polymorphism identification in parasitic weed Orobanche cumana Wallr. // Romanian Agriculture research. - 2004. - V. 21. - P. 29-32.
5. Atanasova R., Batcharova R., Todorovska E. andAtanassov A. Molecular study of broomrape (Orobanche Spp.) by RAPD analyses // Biotechol. and Bionechnol. Eq. - 2005. - V. 19 (3). - P. 51-60.
6. Benharrat H., Veronesi C., Theodet C. and Thalouarn P. Orobanche species and population discrimination using intersimple sequence repeat (ISSR) // WEED Research. - 2002. - V. 42 (I. 6). - P. 470-475.
7. Gagne G., Roeckel-DrevetP., Grezes-Besset B., Shindrova P., Ivanov P., Grand-Ravel C., Vear F., Tourvieille de Labrouhe D., Charmet G. and Nicolas P. Study of the variability and evolution of Orobanche cumana populations infesting sunflower in different European countries // Theor. and Appl. Genet. -1998. - V. 96. - P. 1216-1222.
8. Pineda-Martos R., Velasco L., Fernandez-Escobar J., Fernandez-Martinez J.M., and Perez-Vich B. Genetic diversity of Orobanche cumana populations from Spain assessed using SSR markers // Weed Research. - 2013. - V. 53. - P. 279-289.
9. Molinero-Ruiz L., García-Carneros A. B., Collado-Romero M., Raranciuc S., Domínguez J. and Melero-Vara J.M. Pathogenic and molecular diversity in highly virulent populations of the parasitic weed Orobanche cumana (sunflower broomrape) from Europe // Weed Research. - 2013. - DOI: 10.1111.
10. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. - 1987. - V. 19. - P. 11-15.
11. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update // Bioinformatics. -2012. - P. 1-3.
12. Nei M. Genetic distance between populations // Amer. Natur. - 1972. - V. 106. - P. 283-392.
13. Vaz Patto M.C., Diaz-Ruiz R., Satovic Z., Roman B., Pujadas-Salva A.J., Rubiales D. Genetic diversity of Moroccan populations of Orobanche foetida: evolving from parasitizing wild hosts to crop plants // Weed Research. - 2008. - V. 48. - P. 179-186.
14. Roman B., Perez-de-Luque A., Alfaro C. [et al.]. Host differentiation in Orobanche foetida Poir // FLORA: Morphology, Distribution and Functional Ecology of Plants. - 2007. - V. 202. - P. 201-208.
