CC BY
46
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ БЕЛКА УЕ-1... 77
УДК 618.19-006.6-033.2-085.28:577.112
1 2 2 2 2 Г.П. Генс , Н.И. Моисеева , Т.П. Стромская , ЕЮ. Рыбалкина , А.В. Вайман ,
Л.П. Овчинников3, А А. Ставровская2
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ БЕЛКА YB-1
И ХИМИОТЕРАПИЯ ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1 Центральная клиническая больница им. НА.Семашко № 2 ОАО «РЖД», Москва 2Р0НЦ им. Н.Н. Блохина РАМН
3Институт белка РАН, Пущино, Московская область Контактная информация:
Моисеева Наталья Ивановна, аспирантка лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-17-69; e-mail: [email protected]
Статья поступила: 26.04.2010, принята к печати 16.09.2010.
Резюме
Многофункциональный белок YB-1 обнаруживается как в ядрах опухолевых клеток, так и в цитоплазме. YB-1 принимает участие во многих ДНК- и мРНК-зависимых процессах. Данная работа направлена на выяснение связи между локализацией белка YB-1 в ядрах клеток опухолей молочной железы и химиотерапией РМЖ. Исследованы срезы 78 опухолей. Окраска срезов антителами к YB-1 показала, что использованные в работе антитела достаточно часто, почти в трети случаев, выявляют ядерную локализацию YB-1 (пороговое значение
- не менее 10 % клеток с ядерной локализацией YB-1). Число случаев с локализацией YB-1 в ядрах опухолевых клеток не зависит от подтипа РМЖ (подтипы - люминальный А, люминальный Б, базальный и HER2/neo+). При ядерной локализации YB-1 наблюдается тенденция к более раннему возникновению метастазов РМЖ. Обнаружено, что неоадъювантная терапия РМЖ может приводить к накоплению клеток с ядерной локализацией YB-1. Число случаев с метастазами, возникающими после адъювантной терапии, не зависит от ядерной локализации YB-1. Полученные данные позволяют предполагать, что резистентность больных РМЖ к химиотерапии может быть связана с экспрессией YB-1 в цитоплазме опухолевых клеток: экспрессия YB-1 в цитоплазме опухолевых клеток коррелирует с повышенным количеством мРНК нескольких генов, определяющих множественную лекарственную устойчивость.
Ключевые слова: рак молочной железы, белок YB-1, метастазирование, множественная лекарственная устойчивость, адъювантная и неоадъювантная химиотерапия.
G.P. Gens1, N.I. Moiseeva2, T.P. Stromskaya2,2E.Yu. Rybalkina2,2A.V. Vaiman2, L.P. Ovchinnikov2, A.A. Stavrovskaya2 INTRACELLULAR LOCALIZATION OF YB-1 AND CHEMOTHERAPY OF BREAST CANCER
JN.A. Semashko Cenrtal Clinical Hospital№2, Moscow
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
3Institute of protein research of RAS, Puschino, Moscow Region
Abstract
Multifunctional protein YB-1 is found both in nuclei of tumor cells and in cytoplasm. It participates in various DNA- and RNA-dependent processes. The aim of this study is to reveal the connections between YB-1 nuclear localization and chemotherapy of breast cancer. There were 78 patients with BC studied. Staining of the BC tumor tissues slides with YB-1 antibodies showed that YB-1 is localized in cell nuclei in one third of the tumors (threshold - more than 10 % of the cells with YB-1 in the nuclei). The number of cases with YB-1 nuclear localization did not depend on BC type (luminal A, luminal B, basal and HER2/neo+). The trend to earlier occurrence of metastasis was revealed in the cases with YB-1 nuclear localization. The neo-adjuvant therapy of BC resulted in the increase of the number of cases with YB-1 nuclear localization. The number of BC cases with metastasis arising after adjuvant chemotherapy did not depend on the YB-1 nuclear localization in the dissected tumor. Our data suggest that resistance of BC to chemotherapy could be linked with YB-1 cytoplasmic localization. We have also observed that the expression of YB-1 in the cytoplasm of tumor cells correlated with increased level of several multidrug resistance mRNA.
Key words: breast cancer, protein YB-1, metastasis, multidrug resistance, neoadjuvant and adjuvant chemotherapy.
Введение
Цель данной работы - выяснить, связан ли характер внутриклеточной локализации белка YB-1 в опухолях молочной железы с неоадъювантной химиотерапией, и насколько связаны локализация YB-1 в ядрах опухолевых клеток и результативность адъювантной химиотерапии.
Многофункциональный белок YB-1 является членом семейства ДНК- и РНК-связывающих белков
с эволюционно консервативным доменом холодового шока. YB-1 принимает участие во многих ДНК- и мРНК-зависимых процессах [5; 19; 22]. Этот белок обнаруживается как в ядре, так и в цитоплазме клеток млекопитающих. Функционируя в качестве фактора транскрипции в ядре, YB-1 регулирует в клетке экспрессию генов, содержащих Y-боксы в промоторах, в том числе генов МЛУ МОР^І и ЬЕР и генов циклинов, участвуя, таким образом, в регуляции МЛУ и размножения клеток [5; 19].
В цитоплазме УБ-1 является одним из основных белков, связывающихся с мРНК и формирующих мРНП (рибонуклеопротеиновые частицы) с уникальными физико-химическими характеристиками. От его количества в мРНП зависит скорость синтеза различных белков. Связываясь с актином [23] и тубулином [8; 9], белок УВ-1 может участвовать в локализации мРНП на актиновых микрофиламентах и их транспорте по микротрубочкам.
Таким образом, с локализацией УВ-1 в клетках связаны разные молекулярные механизмы, определяющие его влияние на фенотип опухолевых клеток.
Важная роль УВ-1 в эволюции злокачественных новообразований в настоящее время не подвергается сомнению. УВ-1 участвует в регуляции размножения опухолевых клеток, в их метастазирова-нии и лекарственной устойчивости [5; 11; 12; 18; 19; 22], однако многие вопросы остаются не ясными. В частности, не ясно, с какими активностями этого многофункционального белка связаны его отдельные эффекты.
В различных злокачественных опухолях (молочной железы, легкого, яичников, остеосаркомах и некоторых других) может быть повышено количество клеток, в которых УВ-1 локализован в ядрах (по сравнению с нормальными тканями). Было найдено, что такое повышение коррелирует с резистентностью опухолей к химиотерапии и с неблагоприятным течением заболевания [6; 15; 17; 18; 19; 22]. Локализацию УВ-1 в ядрах малигнизированных клеток было предложено рассматривать в качестве маркера МЛУ злокачественных новообразований [21]. Однако, несмотря на достаточно многочисленные исследования, ядерная локализация УВ-1 пока не стала принятым маркером МЛУ опухолей.
Это можно объяснить следующим:
Во-первых, оказалось, что случаев, в которых УВ-1 обнаруживался в ядрах клеток, в некоторых выборках находили немного, поэтому не всегда можно было достоверно оценить искомые корреляции.
Во-вторых, появились исследования, в которых не подтверждалась прогностическая значимость ядерной локализации УВ-1 при РМЖ [20].
Для исследования роли внутриклеточной локализации УВ-1 в чувствительности больных РМЖ к химиотерапии в данной работе мы использовали антитела к УВ-1, которые достаточно часто выявляют ядерную локализацию этого белка в опухолях молочной железы.
Мы применили ранее отработанный нами метод оценки характера локализации УВ-1 в клетках, показывающий действительно ли УВ-1 локализован в ядрах клеток [1], и оценили количество клеток с локализацией УВ-1 в ядре в срезах опухолей молочной железы. Образцы взяты при операции. Исследовали ткани больных, получавших и не получавших неоадъювантную и/или адъювантную терапию.
Материалы и методы
Больные
В исследование включены 78 больных РМЖ І-ІІІ стадии (табл. 1).
Гистологические варианты опухолей:
- инфильтративный протоковый рак - 71 случай,
- медуллярный рак - 3 случая,
- дольковый рак - 1 случай,
- слизистый рак - 1 случай.
Время наблюдения за пациентками -17^50 мес. (в среднем 34,5 мес.).
Иммуногистохимические исследовании
Определение локализации YB-1 в образцах опухолей проводили по методике, описанной ранее [1; 2]. Гистологические препараты опухолевой ткани, полученные от больных во время операции, готовили по общепринятой методике, затем их депарафинизировали обработкой ксилоловым и этиловым спиртами. Депара-финизированные препараты материала от больных инкубировали с крысиными поликлональными антителами к YB-1 (АТ к YB-1, любезно предоставленные СП. Домо-гатским, были получены путем иммунизации крыс синтетическим пептидом, который соответствовал 15 С-концевым аминокислотным остаткам YB-1 «AENSSAPEAEQGGAE»). Затем клетки инкубировали со вторыми АТ к IgG крысы, меченными TRITC (Rhodamine; Sigma). Подсчет числа клеток с цитоплазматической и ядерной локализацией YB-1 проводили с помощью флуоресцентного микроскопа (Carl Zeiss, Германия). Для уточнения внутриядерной локализации YB-1 те же препараты окрашивали Хехст 33258 (Sigma) сопоставляли окраску клеток АТ к YB-1 и Хехст 33258 [1].
За положительную ядерную локализацию YB-1 принимали те случаи, в которых АТ окрашивали ядра не менее чем в 10 % клеток. Анализировали не менее 200 клеток в каждом препарате. Определение экспрессии рецепторов стероидных гормонов (эстрогенов и прогестерона) проводили общепринятым методом (ИГХ).
Лечение
Неоадъювантная ХТ в большинстве случаев проводилась по схеме FAC (5-ФУ - 500 мг/м2, доксо-рубицин - 50 мг/м2, циклофосфан - 500мг/м2) каждый
21 день. Полный лечебный патоморфоз был достигнут в 12,5 % случаев, что соответствует данным мировой литературы [4; 13]. В случае полного лекарственного патоморфоза адъювантная ХТ проводилась по той же схеме. При неполном лекарственном патоморфозе (I степень) в схему адъювантной ХТ включали таксаны. Адъювантная ХТ в большинстве случаев в нашем исследовании проводилась по схеме FAC/АС (доксору-бицин 60 мг/м , циклофосфан 600мг/м2) каждый 21 день. Об эффективности терапии судили по двум показателям: появлению отдаленных метастазов и кривым БРВ.
Определение количества мРНК генов МЛУ
Проводили с помощью метода полуколиче-ственной ОТ-ПЦР. Детали методики и использованные праймеры описаны ранее [2]. Выделение тотальной РНК осуществляли при помощи TRI Reagent (Sigma, USA) в соответствии с протоколом производителя. Генами «домашнего хозяйства» служили Р-актин и GAPDH. Использовали следующие специфические праймеры:
актин (540 пн)
GTGGGGCGCCCCAGGCACCA (прямой);
CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC (обратный);
GAPDH (513 пн)
CCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTT (прямой);
GGCCATGAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA (обратный);
YB-1 (476 пн)
ACAAGAAGGTCATCGCAACGAAG (прямой);
GGTTGGAATACTGTGGTCGACG (обратный);
MDR1 (167 пн)
CCCATCATTGCAATAGCAGG (прямой);
GTTCAAACTTCTGCTCCTGA (обратный);
MRP1 (180 пн)
ATCAAGACCGCTGTCATTGG (прямой);
GAGCAAGGATGACTTGCAGG (обратный);
LRP (405 пн)
CCCCCATACCACTATATCCATGTG (прямой);
TCGAAAAGCCACTGATCTCCTG (обратный).
Больные, включенные в исследование
Таблица 1
Особенность случая Всего исследовано
Возраст До 50 лет 22
После 50 лет 56
Размер опухоли До 5 см (Т1-Т2) 54
Более 5 см (Т3-Т4) 24
Патологоанатомический диагноз: Инфильтративный протоковый рак 73
Медуллярный рак 3
Дольковый рак 1
Слизистый рак 1
Метастазы в регионарные лимфоузлы N0 36
N1-3 42
Рецепторы эстрогенов (РЭ) РЭ- 20
РЭ+ 45
Рецепторы прогестерона (РП) РП- 36
РП+ 29
ИЕК2/пео НЕЫ2/пео- 31
НЕЫ2/пео+ 17
Химиотерапия Неоадьювантная 17
Адъювантная 36
Степень экспрессии мРНК генов МЛУ в опухолях молочной железы (Т1-Т 2) Таблица 2
Степень экспрессии Содержание мРНК генов МЛУ
MDR1 MRP1 BCRP LRP
- или +/- 1В 1З 11 9
+ 2 2 4 В
++ или +++ 4 5 2 1
Всего исследовано случаев 22 20 17 1В
Всего случаев с повышенным содержанием мРНК генов МЛУ В 7 В 7
Таблица 3
Больные, у которых обнаружена повышенная экспрессия нескольких генов МЛУ_______________________
Случай № Гены МЛУ
MDR1 MRP1 BCRP LRP
1 ++ ++ но +
2 ++ ++ но +
З - + - +
4 - + - +
5 - - + +
В + ++ - но
7 ++ ++ ++ но
Условия амплификации: 30 сек при 94 °С, затем 25-40 циклов: 10 сек при 94 °С, 10 сек при 60 °С, 10 сек при 72 °С, затем 1 мин при 72 °С. Продукты амплификации в объеме 20 мкл реакционной смеси разделяли электрофорезом в 2 %-ном агарозном геле с бромистым этидием. Гель фотографировали при помощи цифровой видеокамеры.
Статистическая обработка
Использовались статистические методы %2, точный односторонний метод Фишера, критерий Каплан-Майер. Различия в группах считались статистически значимыми при р<0,05. Обработка данных производилась с помощью программы СгарИ-PadPrism 5.1.
Результаты
Типы РМЖ, исследованные в работе
Хорошо известно, что РМЖ - гетерогенное заболевание. Используя общепринятые иммуноги-стохимические маркеры РМЖ (экспрессию рецепторов эстрогенов и прогестеронов), а также экспрессию рецептора НЕЫ2/пеи, мы подразделили
исследованные опухоли молочной железы на следующие подтипы:
1. ЕЫ+ и/или РЫ+, НЕЫ2- (далее - НЕЫ+/ НЕЫ2-)
2. ЕЫ+ и/или РЫ+, НЕЫ2+ (далее - НЫ+/ НЕЫ2+)
3. ЕЫ-, РЫ-, НЕЫ2- (далее - НЫ-/ НЕЫ2-)
4. ЕЫ- и/или РЫ-/НЕЫ2+ (далее - НЫ-/ НЕЫ2+)
Рис. 1 А показывает, что данные подтипы РМЖ встречались среди исследованных нами опухолей с разной частотой.
Эти подтипы отличались друг от друга по доле случаев, с прогрессированием заболевания -по частоте возникновения отдаленных метастазов (в сроки от 4 мес. до 48 мес.; средний срок возникновения метастазов 18 мес.).
Наиболее благоприятное течение заболевания наблюдалось у больных, отнесенных нами к группе ЕЫ+ и/или РЫ+, НЕЫ2- (частота прогрессирования 10,5 %).
Больше отдаленных метастазов и рецидивов возникало у больных, относящихся к другим группам: ЕЫ+ и/или РЫ+, НЕЫ2+ (33 %), ЕЫ-, РЫ-, НЕЫ2- (27 %).
В группе ЕЫ-/ НЕЫ2+ метастазы возникли у 2 из 5 пациенток.
Частота встречаемости клеток с ядерной локализацией УБ-1 Исследование срезов всех 78 опухолей (операционный материал) показало, что антитела к УБ-1 почти в 12 % случаев не окрашивают срезы опухолевой ткани, в большинстве случаев (60 %) антитела к УБ-1 окрашивают только цитоплазму и почти в 30 % случаев окрашивают ядра клеток (рис. 1 Б).
Ясно, что таким образом нам удается выявить достаточно значимое количество случаев с локализацией УБ-1 в ядрах опухолевых клеток. На рис. 2 приведены примеры окрашивания срезов опухолей антителами к УБ-1 (цитоплазматическая и ядерная локализация этого белка).
Сравнение частоты встречаемости клеток с ядерной локализацией УБ-1 в зависимости от подтипов РМЖ показывает, что статистически значимой корреляции частоты обнаружения клеток с ядерной локализацией УБ-1 и подтипа опухоли нет. Доля клеток с ядерной локализацией УБ-1 варьировала в пределах от 21 до 40%.
Связь внутриклеточной локализации УБ-1 и прогрессии РМЖ
За время наблюдения (от 17 до 50 мес.) у 17 больных (21,8 %) было выявлено прогрессирование заболевания (отдаленные метастазы или рецидивы). В группе больных с цитоплазматической локализацией УБ-1 прогрессирование возникло в 24 % случаев, а в группе больных с ядерной локализацией УБ-1 в 30 % (р=0,6). Т.о. статистически значимых различий между двумя сравниваемыми группами по частоте прогрессирования заболевания нет. Стоит отметить, что ни у одной пациентки из десяти, у которых УБ-1 не был детектирован, прогрессирование заболевания не наблюдалось. Сравнение времени появления метастазов у больных в зависимости от характера внутриклеточной локализации УБ-1 показывает, что у пациенток с ядерной локализацией УБ-1 метастазы появляются в более ранние сроки. Поскольку время наблюдения пока невелико, эти различия статистически не значимы (р=0,3), но тенденция просматривается (рис. 3). Таким образом, при ядерной локализации УБ-1 наблюдается тенденция к более раннему прогрессированию РМЖ.
Влияние неоадьювантной терапии на внутриклеточную локализацию УБ-1
Важнейшими параметрами, используемыми для характеристики РМЖ, остаются диаметр опухоли в сантиметрах и наличие поражения метастазами подмышечных лимфоузлов метастазами.
Сравнение частоты встречаемости клеток с ядерной локализацией УБ-1 в зависимости от размеров опухолей у пациенток, которые не получали неоадьювантную терапию, показало, что нелеченые опухоли малых (Т1-Т2 - до 5 см) и больших размеров (Т3-Т4 - более 5 см) не различаются по частоте встречаемости клеток с ядерной локализацией УБ-
1. Если среди малых опухолей около 20 % характеризовалось ядерной локализацией УБ-1, то среди больших опухолей около 18 % имели клетки с УБ-1 в ядре (рис. 4).
Анализ показывает, что с влиянием неоадь-ювантной терапии может быть связана транслокация УБ-1 из цитоплазмы в ядро как в малых, так и в больших опухолях. Среди больных, получавших неоадьювантную терапию, доля случаев с ядерной локализацией УБ-1 была выше. В группе пациенток с размерами опухолей Т1-Т2 доля случаев с
ядерной локализацией УБ-1 увеличена. В группе пациенток, получавших неоадъювантную терапию, и с размерами опухолей Т3-Т4 доля случаев с ядерной локализацией составила 63 %, без терапии эта доля была 18 % (см. рис. 4).
Постоперационная терапия и внутриклеточная локализация УБ-1 Целью данной части работы было получить ответ на вопрос, связана ли чувствительность больных к адъювантной (постоперационной) терапии с характером локализации УБ-1 в клетках ранее удаленной опухоли. В данную группу больных включены и пациентки, получавшие неоадъювантную терапию. Из данных, приведенных на рис. 5, видно, что доля случаев с прогрессированием практически одинакова в группах опухолей с цитоплазматической (38,9 %) и с ядерной локализацией (41,7 %).
Важно заметить, что в группе «УБ-1 не детектируется» не было ни одного случая с прогрессированием заболевания. Нужно заметить также, что доля случаев с рецидивами и метастазами среди пациенток, получавших адъювантную терапию, велика - около 40 % (при сроках наблюдения от 17 до 50 мес.). Это свидетельствует в пользу того, что применявшаяся терапия недостаточно эффективна, и часть опухолей могла быть резистентной к химиотерапии. По-видимому, одной из причин этого может быть размножение опухолевых клеток, которые устойчивы к лечению.
Количество мРНК генов МЛУ в опухолях малых размеров С целью проверки этого предположения мы исследовали опухоли малых размеров с помощью полуколичественного метода ОТ-ПЦР (табл. 2). Все эти больные не получали неоадъювантную терапию, т.е. влияние неоадъювантной терапии на внутриклеточную локализацию УБ-1 исключается. Мы нашли, что в некоторых малых опухолях (Т1-Т2), не подвергавшихся терапии, наблюдается повышенная экспрессия мРНК генов МЛУ. Исследован материал от
22 больных (см. табл. 2). Существенно, что почти все эти опухоли характеризуются цитоплазматической локализацией УБ-1. Между тем, в этих случаях достаточно часто (примерно в 30 %) наблюдалось повышенное количество мРНК нескольких разных генов МЛУ. В разных опухолях (у разных больных) обнаружено повышение количества мРНК разных генов МЛУ, в нескольких случаях наблюдалось повышенное содержание мРНК одновременно 2-3 генов МЛУ (7 случаев, все с цитоплазматической локализацией УБ-1; табл. 3, рис. 6).
Таким образом, опухоли малых размеров, у больных, не подвергавшихся химиотерапии, нередко характеризуются повышенным количеством мРНК сразу нескольких генов МЛУ. При этом белок УБ-1 в этих опухолях чаще всего имеет цитоплазматическую локализацию.
Обсуждение
В данной работе мы исследовали связь проведенной химиотерапии больных РМЖ и характера внутриклеточной локализации многофункционального белка УБ-1. Прежде всего, мы разделили исследуемые опухоли на биологические подтипы, используя классические маркеры (рецепторы половых гормонов и белок НЕЙ2, определяемые имму-ногистохимическим методом - 1) ЕЫ+ и/или РЫ+, НЕЫ2-; 2) ЕЫ+ и/или РЫ+, НЕЫ2+; 3) ЕЫ-, РЫ-, НЕЫ2-; 4) НЕЫ2+/ЕЫ- РЫ-.
Согласно сопоставлению результатов иммуно-гистохимических исследований с результатами применения экспрессионных микрочипов, эти 4 подтипа можно условно обозначить как: І) люминальный А; 2) люминальный Б; 3) базальный; 4) HER2-шложитель-ный [7; 1O; 16]. Мы нашли, что данные подтипы РМЖ встречались среди исследованных нами опухолей с разной частотой. Эти подтипы отличались друг от друга по доле случаев с прогрессией - т.е. по частоте возникновения отдаленных метастазов. Наиболее прогностически благоприятным оказался подтип ER+ и/или PR+, HER2- (люминальный А), наименее благоприятным подтип HER2+/ER- PR-, что совпадает с принятыми в настоящее время представлениями и свидетельствует о том, что выделенные нами подтипы РМЖ соответствуют общепринятым. Сравнение частоты встречаемости клеток с локализацией YB-1 в ядрах в зависимости от подтипов РМЖ показало, что статистически значимой корреляции частоты клеток с ядерной локализацией YB-1 и подтипа опухоли нет. Эти данные свидетельствуют о том, что ядерная локализация YB-1 не является характерным признаком какого-то одного подтипа РМЖ. Поскольку нами исследованы опухоли, взятые при операции, мы не можем судить о влиянии ядерной локализации YB-1 на эффективность неоадъювантной терапии. Недавно появилась работа, в которой был исследован материал 116 трепанобиопсий опухолей молочной железы и показано, что классификация РМЖ, основанная на экспрессии рецепторов половых гормонов и НER2 дает возможность предсказать ответ больных РМЖ на неоадьювантную терапию и обладает независимой прогностической ценностью: в опухолях, характеризовавшихся ко-экспрессией рецепторов гормонов и HER2 чаще отмечали полный лекарственный патоморфоз и благоприятный прогноз, в то время как новообразования с фенотипом HR-/HER- and HR-/HER+ имели худший клинический прогноз, особенно в тех случаях, когда полный патоморфологический ответ не был достигнут [1O]. В этом исследовании YB-1 (цитоплазматическая локализация) был обнаружен в 33% опухолей. Экспрессия YB-1 в опухолях неблагоприятных групп не сказывалась на ответе пациенток на неоадьювантную терапию [1O]. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что хотя ответ больных РМЖ на неоадъювантную терапию зависит от принадлежности опухолей к определенным подтипам РМЖ, этот ответ не зависит от экспрессии YB-1 (в данной работе - от экспрессии этого белка в цитоплазме). Однако пока речь идет всего об одной работе.
Если влияние YB-1 на ответ больных РМЖ на неоадьювантную терапию пока недостаточно исследовано, наши данные и результаты предыдущих исследований позволяют утверждать, что неоадъювантная терапия сказывается на числе случаев с ядерной локализацией YB-1 в популяциях опухолевых клеток у больных. В данном исследовании мы показали, что с не-оадъювантной терапией может быть связана транслокацией YB-1 из цитоплазмы в ядро как в малых, так и в больших опухолях. Таким образом, с неоадьювантной терапией может быть связано повышение числа случаев, в которых белок YB-1 может функционировать в качестве фактора транскрипции. Ранее было показано, что лечение 27 больных РМЖ таксолом примерно в одной трети случаев привело к перемещению YB-1 в ядра опухолевых клеток, это сопровождалось повышением экспрессии Р-гликопротеина [14]. Это свидетельствует в пользу того, что неоадъювантная терапия может способствовать повышению активности АВС транспортеров в опухолях, в частности, тех белков, чья экспрессия регулируется YB-1.Часть случаев с рецидивами может быть связана с влиянием неоадъювантной
терапии на внутриклеточную локализацию УБ-1, т.е. с увеличением числа клеток с ядерной локализацией УБ-1. Сравнение времени появления метастазов и рецидивов у больных в зависимости от характера внутриклеточной локализации УБ-1 показывает, что наблюдается тенденция к более раннему появлению метастазов у пациенток с ядерной локализацией УБ-1. Целый ряд экспериментальных и клинических данных позволяет связывать ядерную локализацию УБ-1 и резистентность опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам [3; 6; 17; 21; 22].
Наши данные позволяют полагать, что наряду с активностью УБ-1 в качестве фактора транскрипции (при его ядерной локализации) существенную роль в устойчивости РМЖ к химиотерапевтическим препаратам может играть и активность этого белка в цитоплазме. Во-первых, в группе больных, получавших адъювантную терапию, у значительной части пациенток с малыми опухолями обнаружена цитоплазматическая локализация УБ-1. Это может означать, что в части случаев с прогрессированием эволюция РМЖ может быть связана с активностью УБ-1 в цитоплазме. Во-вторых, исследование количества мРНК генов МЛУ в 22 опухолях малых размеров показало, что примерно в 30 % случаев нелеченных новообразований в них обнаруживается повышенное количество мРНК нескольких разных генов МЛУ. Таким образом, опухоли малых размеров, не подвергавшиеся химиотерапии, нередко характеризуются повышенным количеством мРНК сразу нескольких генов МЛУ. При этом белок УБ-1 в этих опухолях чаще всего локализован в цитоплазме. Таким образом, ядерная локализация УБ-1 не является необходимым условием для возникновения МЛУ, связанной с активностью АВС транспортеров. В процессе активации АВС транспортеров при РМЖ УБ-1 может участвовать и в качестве цитоплазматического фактора.
Заключение
Работа направлена на выяснение связи локализации белка УБ-1 в ядрах клеток опухолей молочной железы и ответа больных РМЖ на химиотерапию. Окраска срезов опухолей антителами к УБ-1 показала, что использованные в работе антитела достаточно часто выявляют ядерную локализацию УБ-1 - почти в трети случаев (порог - более 10 % клеток с ядерной локализацией УБ-1). Число случаев с локализацией УБ-1 в ядрах опухолевых клеток не зависит от подтипа РМЖ. При ядерной локализации УБ-1 наблюдается тенденция к более раннему возникновению метастазов и рецидивов РМЖ. Обнаружено, что с неоадъ-ювантной терапией РМЖ может быть связано перемещение УБ-1 в ядра опухолевых клеток. Число случаев с метастазами и рецидивами, возникающими после адъювантной (постоперационной) терапии, не зависит от ядерной локализации УБ-1 в тканях удаленных опухолей. Нами найдено, что гиперэкспрессия УБ-1 в цитоплазме опухолевых клеток ассоциирована с повышенным количеством мРНК нескольких генов, определяющих МЛУ, в частности с повышенным количеством мРНК транспортеров семейства АВС и белка ЬЫР/МУР. Полученые данные позволяют полагать, что резистентность больных РМЖ к адъювантной терапии может быть связана с тем, что УБ-1 гиперэкс-прессирован в цитоплазме опухолевых клеток.
Работа выполнена при поддержке фонда «Вольное дело», Грантов Российского фонда фундаментальных исследований 07-04-00720, 08-04-00251-а, Программы президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».
□ НШ2- 0Шч/НШ2+ аШ-/НШ2- ШШ-/НШ2+
Б
12%
Рис. 1. Распределение исследованных опухолей по типам РМЖ и внутриклеточной локализации УВ-1:
А - частота встречаемости разных типов РМЖ среди исследованных опухолей; Б - частота встречаемости РМЖ с разными типами внутриклеточной локализации белка УВ-1.
Т1-Т2
нет леч есть леч ТЗ-Т4
120%
100%
со 80%
О)
го
5. 5 60%
58 40%
20%
0%
Нет леч
Есть леч
□ Нет УВ-1
В В цпл
В В ядре
Рис. 2. Внутриклеточная локализация белка УВ-1. Окраска срезов опухолей антителами к УВ-1. Увеличение х400.
А - Опухоль больной А. Цитоплазматическая локализация УВ-1.
Б - Опухоль больной К. В большинстве клеток УВ-1 локализован в ядре.
месяцы
Рис. 3. Время появления метастазов и рецидивов у больных с цитоплазматической и ядерной локализацией белка УВ-1 в опухолевой ткани.
Т1-Т2
ТЗ-Т4
Рис. 4. Связь неоадъювантной терапии РМЖ и внутриклеточной локализации белка УВ-1 в опухолевой ткани.
% случаев
Шбез прогрессирования Ос прогрессированием
Рис. 5. Внутриклеточная локализация УВ-1 в тканях удаленных опухолей молочной железы и прогрессирование заболевания.
бояычая №
1 -
3
4
асИп
МВЯ1
^Г4М
ршш Л;' *г .: ж 4 (С' гРУ —
МЯР!
Рис. 6. Количество мРНК генов МЛУ в опухолях больных РМЖ. Полуко личественная ОТ-ПЦР.
Литература
1. Вайман А.В., Генс Г .П., Стромская Т.П. и др. Исследование роли белка YB-1 в лекарственной устойчивости опухолей молочной железы // Мол. мед. - 2007. - № 1. - С. 31-7.
2. Вайман А.В., Стромская Т.П., Рыбалкина ЕЮ. и соавт. Содержание и локализация белка YB-1 в опухолевых клетках с множественной лекарственной устойчивостью // Биохимия. - 2006. - Т. 71, №2. - С. 190-200.
3. Вайман А.В., Стромская Т.П., Рыбалкина ЕЮ. и др. Возникновение лекарственной устойчивости в популяции клеток опухоли кишечника под влиянием многофункционального белка YB-1 // БЭБиМ.
- 2007. - Т. 143, № 4. - С. 442-5.
4. Семиглазов В.Ф., Арзуманов А.С., Божок А А. и др. Новый взгляд на неоадъювантную химиотерапию рака молочной железы (роль навельбина) // Современная онкология. - 2003. - Том 5, №3.
5. Скабкин МА, Скабкина О.В., Овчинников Л.П. Мулитифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов // Успехи биол. химии. - 2004. - 44. - С. 3-52.
6. Bargou R.C., Jurchott K, Wagener C. et al. Nuclear localization and increased levels of transcription factor YB-1 in primary human breast cancers are associated with intrinsic MDR1 gene expression // Nat. Med.
- 1997. - 3. - P. 447-50.
7. Carey L.A., Perou C.M., Livasy C.A. et al. Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study // JAMA. - 2006. - 295(21). - Р. 2492-502.
8. Chernov K.G., Curmi P.A., Hamon L. et al. Atomic force microscopy reveals binding of mRNA to microtubules mediated by two major mRNP proteins YB-1 and PABP // FeBs Letters. - 2008. - 582. - P. 2875-81.
9. Chernov K.G., Mechula A., Popova N.V. et al. YB-1 promotes microtubule assembly in vitro through interaction with tubulin and microtubules // BMC Biochem. - 2008. - 9(23). - P. 1-16.
10. Darb-Esfahani S., Loibl S., Muller B.M. et al. Identification of biology-based breast cancer types with distinct predictive and prognostic features: role of steroid hormone and HER2 receptor expression in patients treated with neoadjuvant anthracycline/taxane-based chemotherapy//Breast Cancer Res. - 2009. - 11(5). - R69.
11. Evdokimova V., Tognon C, Ng T. et al. Translational activation of snail1 and other developmentally regulated transcription factors by YB-1 promotes an epithelial-mesenchymal transition // Cancer Cell. - 2009 -15(5). - Р. 402-15.
12. Evdokimova V., Tognon C, Ng T, Sorensen PH. Reduced proliferation and enhanced migration: two sides of the same coin? Molecular mechanisms of metastatic progression by YB-1 // Cell Cycle. - 2009. - 8(18).
- Р. 2901-6.
13. Fisher B, Bryant J, Wolmark N. et al. Effect of preoperative chemotherapy on the outcome of women with operable breast cancer // J Clin Oncol. - 1998. - 16. - P. 2672-85.
14. Fujita T, Ito K, Izumi H. et al. Increased nuclear localization of transcription factor Y-box binding protein 1 accompanied by up-regulation of P-glycoprotein in breast cancer pretreated with paclitaxel // Clin. Cancer Res. - 2005. - 11(24 Pt 1). - Р. 8837-44.
15. Gessner C, Woischwill C, Schumacher А. et al. Nuclear YB-1 expression as a negative prognostic marker in nonsmall cell lung cancer // Eur. Respir. J. - 2004. - 23. - P. 14-9.
16. Habibi G, Leung S., Law J.H. et al/. Redefining prognostic factors for breast cancer: YB-1 is a stronger predictor of relapse and disease-specific survival than estrogen receptor or HER-2 across all tumor subtypes // Breast Cancer Res. - 2008. - 10(5). - R86.
17. Huang J, Tan P.H., Li K.B. et al. Y-box binding protein, YB-1, as a marker of tumor aggressiveness and response to adjuvant chemotherapy in breast cancer // Int. J. Oncol. - 2005. - 26. - P. 607-13.
18. Janz M., Harbeck N., Dettmar P. et al. Y-box factor YB-1 predicts drug resistance and patient outcome in breast cancer independent of clinically relevant tumor biologic factors HER2, uPA and PAI-1 // Int. J. Cancer. - 2002. - 97(3). - P. 278-82.
19. Kohno K., Izumi H., Uchiumi T. et al. The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-1 // Bioessays. - 2003. - 25. - P. 691-8.
20. Ku.ru.cz R., Belian E., Treue D, Lage H. Regulation of mRNA expression in drug-sensitive and drug-resistant gastric carcinoma cells is independent of YB-1 expression // Anticancer Res. - 2010. - 30(2). - P. 693-8.
21. Kuwano M., Oda Y, Izumi H. et al. The role of nuclear Y-box binding protein 1 as a global marker in drug resistance // Mol. Cancer Ther. - 2004. - 3. - P. 1485-92.
22. Matsumoto K., Bay B. Significance of the Y-box proteins in human cancers // J. Molec. Genetic Medicine.
- 2005. - 1. - P. 11-7.
23. Ruzanov P.V., Evdokimova V.M., Korneeva N.L. et al. Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments // J. Cell Sci. - 1999. - 112, №20. - P. 3487-96.
