CC BY
80
105-122 34 -
Апрель 2012 г.
0-10 2.4 19.3
10-25 3.2 22.38
25-40 3.8 20.45
40-55 3.7 23.06
55-77 3.29 10.51
77-100 4.1 20.65
100-115 3.75 13.89
115-125 4.2 28.97
«-» - не определяли.
Литература
1. Кузнецов С.И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность. - М.: АН СССР, 1970. - 440 с.
2. Солоноватые и соленые озера Забайкалья: гидрохимия, биология / В.В. Хахинов и др. - Улан-Удэ: Изд-во Бурят. гос. ун-та. - 2009. - 340 с.
3. Замана Л.В., Борзенко С.В. Сероводород и другие восстановленные формы серы в кислородной воде озера Доронинское (Забайкалье) // Докл. РАН. - 2007. - Т. 417. - №2. - С. 232-235.
4. Замана Л.В., Борзенко С.В. Гидрогеохимия и термодинамическая оценка минеральных равновесий водной толщи содового озера Доронинское // Геохимия и рудообразование радиоактивных, благородных и редких металлов в эндогенных и экзогенных процессах: материалы всерос. конф. с межд. уч-ем, 16-18 апреля 2007. -Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, - 2007. - C. 151-153.
5. Микробные сообщества стратифицированного озера Доронинское (Забайкалье) / В.М. Горленко и др. // Микробиология. - 2010. - Т.79. - №3. - С. 410-421.
6. Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод. - М.: Недра. - 1970. - 121 с.
7. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемов. Бактериопланктон и его продукция / под ред. Г.Г. Винберга. - Л.: Наука, 1984. -С. 22.
8. Сорокин Ю.И. Применение изотопного метода в водной микробиологии // Успехи микробиологии. -1975. - №10. - С. 214-228.
9. Савельев Б.А. Гляциология. - М.: Наука, 1991. - 288 с.
Колосов Руслан Вячеславович, аспирант, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, e-mail:ruslankolosov@mail.ru
Бурюхаев Савелий Петрович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой,
6, e-mail:bursav@mail.ru
Kolosov Ruslan Vyacheslavovich, postgraduate student, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6, ruslankolosov@mail.ru
Buryukhaev Savely Petrovich, candidate of biological sciences, senior researcher, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6, bursav@mail.ru
УДК 577.151.01 © Е.В. Лаврентьева, А.А. Раднагуруева, Я.Е. Дунаевский, Б.Б. Намсараев
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПЕПТИДАЗЫ АЛКАЛИТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГОРЯЧИХ ИСТОЧНИКОВ БУРЯТИИ
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России по госконтракту №8116 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Изучена внеклеточная протеолитическая активность пяти штаммов алкало-, термофильных бактерий, выделенных из горячих источников Бурятии. Установлено, что субтилизиноподобный фермент наиболее активен в щелочном диапазоне рН, термостабилен и характеризуется широким температурным оптимумом действия. По характеру гидролиза специфических синтетических субстратов и типу ингибирования ферменты классифицированы как сериновые пептидазы субтилизиноподобного типа.
Ключевые слова: протеолитическая активность, термофильные бактерии, сериновые пептидазы.
E.V. Lavrentieva, A.A. Radnagurueva, Ya.E. Dunaevsky, B.B. Namsaraev EXTRACELLULAR PEPTIDASES OF ALKALITHERMOPHILIC BACTERIA ISOLATED FROM HOT SPRINGS IN BURYATIA
Extracellular proteolytic activity of five strains alkali- and thermophilic bacteria taken from hot springs in Buryatia was studied.A subtilisin-like enzyme is the most active in the alkaline pH range, thermally stable and characterized by a wide temperature optimum of action. According to hydrolysis character of specific synthetic substrates and the type of inhibition these enzymes are classified as serine peptidases of subtilisin-like type.
Keywords: proteolytic activity, thermophilic bacteria, serine peptidases.
Благодаря широкому спектру выполняемых функций, пептидазы играют исключительно важную роль в обмене веществ у всех живых организмов. B течение миллиардов лет физиологическая и молекулярная адаптация прокариотных микроорганизмов обеспечила им возможность выживания в любой экологической нише. Изучение пептидаз бактерий, выделенных из экстремальных мест обитания, предоставляет уникальную возможность исследовать стратегии отдельных регуляторных процессов прокариотной клетки и границы функционирования бактерий, т.к. известно, что усиленный синтез гидролитических ферментов является одним из способов адаптации бактерий к экстремальным условиям окружающей среды [1, 2, 3]. Бурятия, где широко распространены щелочные гидротермы с резко градиентными физико-химическими характеристиками (температура, рН), является уникальным объектом для выделения экстремофильных микроорганизмов. Ферменты экстремофилов проявляют повышенную устойчивость не к одному, а к нескольким факторам среды, что в перспективе делает возможным их широкое использование при разработке промышленных биотехнологий [4].
Целью работы было изучение внеклеточных пептидаз, алкалотермофильных бактерий, выделенных из щелочных гидротерм Бурятии.
Методика
B работе использовали штаммы пяти алкалотермофильных культур Ur-б, Br-2-2, Ga-9-2, Al-9-1 и Se-1, выделенные из микробных матов и донных осадков горячих источников Бурятии (коллекция лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН г. Улан-Удэ). Краткая характеристика выделенных культур представлена в табл.1.
Таблица 1
Характеристика изученных штаммов
Штамм Место выделения/источник выделения Таксономическая принадлежность ИшГСопт lim !рНопт
Ur-б Уро/микробный мат Bacillus hemicellulosolyticum C-11 (99%) 35-70I50 6,5-8,5I8,0
Br-2-2 Большая речка/микробный мат B. licheniformis BBDC6 (97 %) 35-70 I50 6,8-9,0I8,2
Ga-9-2 Гарга/микробный мат Anoxybacillus flavithermus DSM 2641 (Z26932) 95% 37-75I57 6,8-9,0I8,5
Al-9-1 Алла/донные осадки A. pushchinoensis AT-2 (AB234214) (96%) 35-67 I50 6,5-9,0I8,0
Se-1 Сея/донные осадки A. pushchinoensis AT-2 (AB234214) (95%) 35-70 I50 6,5-9,5I8,2
Культуры инкубировались при 50 оС на комплексной среде в течение 12-96 ч. После инкубации клетки осаждали центрифугированием (12000 g, 15 мин), полученный супернатант использовали для определения активности пептидаз. Общую активность измеряли по гидролизу 0,5% раствора азоказеина (рН 8). Специфическую активность секретируемых пептидаз определяли, используя в качестве субстратов 5 мМ п-нитроанилиды: ВАРА, GlpAALpNA, 01рРрКЛ, 01рБЛ^КА иТ^Л, Л^КЛ, Ь^Л.
Определение оптимума pH-активности и pH-стабильности фермента. При определении оптимума pH действия секретируемой пептидазы по отношению к синтетическим субстратам были использованы следующие буферные растворы (0,02 М): цитратно-фосфатный, трис-НС1 и глицин-№ОН, имеющие рН в диапазоне от 2,9 до 11,6.
Определение температурного оптимума и температурной стабильности. Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента при температурах от 30 до 80 оС.
Ингибиторный анализ. Для выяснения природы функциональных групп активного центра использовали ингибиторы сериновых протеиназ - ФМСФ, ТЛХК, ТФХК, ЭДТА и ИАА.
Результаты и их обсуждение
Общая протеолитическая активность, измеренная по азоказеину. Исследовали динамику накопления общей протеолитической активности, измеренной по азоказеину у культур, растущих в течение 48 ч на среде с различными источниками азота (триптон, пептон, казеин). Установлено, что максимальная активность у культуры Ur-б проявляется на среде с триптоном при 12 ч культивирования, тогда как другие культуры достигают максимального значения при 36 ч культивирования.
Отмечено, что при добавлении в среду казеина в качестве источника азота активность была минимальной (до 0,04 ед/мг). В отличие от других культур Se-1 показала более высокую активность на среде с казеином, которая доходила до 0,3 ед/мг при 36 ч культивирования. Активность культур Br-2-2 и Ga-9-2 была низкой вне зависимости от источника азота и времени культивирования.
Субстратная специфичность. Результаты исследования зависимости активности пептидаз от температуры культивирования показали, что наиболее высокая активность на субстрате для субтили-зиноподобных ферментов обнаружена при 50 °С. При этой температуре максимальная удельная активность у культуры Ur-6 обнаружена при 12 ч культивирования и составила 3,24 ед/мг. Показано, что температура 60 ^ у данной культуры является наиболее благоприятной для развития аминопеп-тидазной активности (рис. 1).
Интересен факт, что культуры Ur-6, Br-2-2, Ga-9-2, выделенные из микробных матов горячих источников, кроме субтилизиноподобной, обладают также высокой аминопептидазной активностью.
Определение температурной стабильности фермента. Внеклеточная пептидаза штамма Ur-6 имела оптимум активности при 60^ и сохраняла до 31% активности при 70 оС. Температурная стабильность фермента находилась в интервале температур 23-60 оС (рис. 2).
Анализ литературы показывает, что субтилизиноподобные пептидазы характеризуются широким интервалом температурного оптимума и стабильности. Высокая стабильность пептидаз бацилл обеспечивается гидрофобными и ионными взаимодействиями, а также водородными связями и дисуль-фидными мостиками в белковой глобуле субтилаз [1, 7, 9]. Культура Ga-9-2 показала оптимум активности внеклеточной пептидазы при 50 тогда как культура Br-2-2 при 40 ^ (рис. 3).
Стабильность ферментов данных штаммов сохраняется до 60 0С. Данные культуры не отличались высокой активностью, что может быть обусловлено отсутствием дисульфидных связей стабилизирующих структуру белка при высоких температурах [1, 10].
Определение рН-оптимума и стабильности фермента. Изученные ферменты штаммов Ga-9-2 и Br-2-2 активны в относительно узком щелочном диапазоне рН, с максимумом при рН 9,6 и 9,0 соответственно. Исследуемые ферменты были стабильны при рН 7,5-11,8 (рис. 4). Напротив, пептидаза культуры Ur-6 активна в широком интервале рН - значения активности более 50% от максимальной были выявлены на отрезке рН 8,2-12, с максимумом при рН 10. Фермент сохранял стабильность в интервале рН 7,8-12 (рис. 5).
Литературные данные свидетельствуют, что субтилизиноподобные пептидазы являются высокощелочными ферментами с рН оптимумом больше 8, за счет высокого числа гидрофобных и заряженных аминокислот на поверхностной области белковой глобулы субтилизинов [6, 7, 9]. Можно предположить, что высокая щелочеустойчивость изученных белков служит адаптационным, а может и жизненно необходимым свойством бактерий, позволяющим им функционировать в экстремальных условиях щелочных гидротерм.
Анализ природы функциональных групп активного центра
Проведенный нами анализ функциональных групп активного центра показал, что активность внеклеточных пептидаз по субстрату GlpAALpNA у изученных штаммов Ur-6, Ga-9-2 и Br-2-2 подавляется специфическим ингибитором сериновых протеиназ - ФМСФ. Представленные данные вместе с данными о предпочтительном субстрате исследуемых ферментов позволяют отнести их к классу се-риновых протеиназ субтилизиноподобного типа.
В заключение необходимо отметить, что бактерии, выделенные из щелочных гидротерм Бурятии, характеризуются высокой и активной продукцией внеклеточных пептидаз. Этот факт может свиде-
тельствовать об их участии в гидролизе экзогенных белковых макромолекул и снабжении клеток мономерами, которые впоследствии потребляются клетками и используются для их функционирования в естественных условиях обитания. Внеклеточные пептидазы вынуждены работать в более жестких условиях внешней среды и, следовательно, должны иметь более высокую стабильность. Показана широкая вариабельность температурного
50°С
3.5
В Вр емя ку л ьп іві ір о ваш ія, ч
Рис. 1. Динамика активности субтилизиноподобной пептидазы штамма иг-6 при различных температурах культивирования
Рис. 2. Температурные оптимум (а) и стабильность (б) внеклеточной пептидазы культуры иг-6
Рис. 3. Температурные оптимум и стабильность внеклеточных пептидаз культур Вг-2-2 (I, а) и ва-9-2 (II, б)
Рис. 4. рН-оптимум и стабильность внеклеточных пептидаз культур Вг-2-2 (1, а), ва-9-2(2, б)
Рис. 5. рН - оптимум (а) и стабильность (б) внеклеточной пептидазы Ur-6
оптимума и стабильности. Полученные результаты показали границы приспособляемости и функционирования выделенных бактерий в экстремальных условиях гидротерм Бурятии.
Литература
1. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ 73 на разных фазах роста бацилл / Е.О. Михайлова и др. // Биохимия. - 2007. - Т.72, вып.2. - С. 228-235.
2. Система межклеточной коммуникации энтеробактерии Erwinia carotovora при формировании адаптивного ответа к условиям, неблагоприятным для роста / В.Ю. Горшков и др. // Докл. РАН. - 2010. - Т.430. - №2. -С. 268-272.
3. Optimization of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase production by recombinant strain of Bacillus subtilis and localization of glutamyl endopeptidase in Bacillus subtilis cells / L.A. Gabdrakhmanova and oht. // Enzyme and Microbial Technology. - 2002. - V 31. - P. 256-263.
5. Экстремофильные микроорганизмы: биохимическая адаптация и биотехнологическое применение (обзор) / Е.В. Морозкина и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т.46. - №1. - С. 5-20.
6. Erlanger B., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - V.95. - P. 271-278.
7. Биосинтез субтилизиноподобной протеиназы Bacillus amyloliquefaciens и биологические свойства фермента / Н.П. Балабан и др. // Биохимия. - 2007. - Т.72, Вып.4. - С. 568-575.
8. Vielle C., Zeikus G.J. Hyperthermophilic enzymes: Sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability // Microbiol. Mol. Biol. Rew. - 2001. - V.65, №1. - P. 1-43.
9. Regulation of secretion of extracellular proteases by filamentous fungus Botrytis cinerea Fr / Y.E. Dunaevsky and oth. // J. Russian Phytopathol. Soc. - 2001. - V.2. - P. 39-43.
10. Kumar S., Tsai C.-J., Nussinov R. Factors enhancing protein thermostability // Protein Eng. - 2000. - V.13. -P. 179-191.
11. Определение аминокислотного состава микробных матов водных экосистем Байкальского региона с помощью тонкослойной хроматографии / О.М. Калашникова и др. // Вестник Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. -2004. - Т.45. - №6. - С. 393-398.
Лаврентьева Елена Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, e-mail:lena_l@mail.ru
Раднагуруева Арюна Арсалановна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, e-mail:aryuna_rg@mail.ru
Дунаевский Яков Ефимович, доктор биологических наук, профессор, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, стр. А40, e-mail:dun@belozersky. msu.ru
Намсараев Баир Бадмабазарович, доктор биологических наук, зав. кафедры экспериментальной биологии, Бурятский государственный университет, 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а.
Lavrentieva Elena Vladimirovna, candidate of biological sciences, researcher, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6, e-mail:lena_l@mail.ru
Radnagurueva Aruna Arsalanovna, candidate of biological sciences, junior researcher, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6, e-mail:aryuna_rg@mail.ru
Ю.Л. Тушинова, Б.Г. Базаров, Ж.Г. Базарова. Фазовые соотношения в системах Cs2MoO4-Ln2(MoO4)3-Zr(MoO4)2 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er)______________________________________________________________________________________________________
Dunaevsky Yakov Efimovich, doctor of biological sciences, professor, A.N. Belozersky Physical-Chemical Biology Institute, M.V. Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Leninskiye gory, Bdg, A 40, e-mail:dun@belozersky.msu. ru
Namsaraev Bair Badmabazarovich, doctor of biological sciences, Head of the Department of Experimental Biology, Buryat State University, 670000, Ulan-Ude, Smolin Str., 24a
УДК 544.015.3+546.776’36’65’83 © Ю.Л. Тушинова, Б.Г. Базаров, Ж.Г. Базарова
ФАЗОВЫЕ СООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМАХ Cs2MoO4-Ln2(MoO4)3-Zr(MoO4)2 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er)
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №11-03-00867а,
№11-08-00681а, Президиума РАН
Системы Cs2MoO4-Ln2(MoO4)3-Zr(MoO4)2 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er) изучены методом рентгенофазового анализа в субсолидусной области. Выявлены квазибинарные разрезы и проведена триангуляция. В системах впервые установлено образование тройных молибдатов Cs2LnZr2(MoO4)6.5 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er) (2:1:4).
Ключевые слова: фазовые соотношения, триангуляция, твердофазные реакции, тройные молибдаты
Yu.L. Tushinova, B.G. Bazarov, Zh.G. Bazarova PHASE RELATIONS IN Cs2MoO4-Ln2(MoO4)3-Zr(MoO4)2 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er) SYSTEMS
Cs2MoO4-Ln2(MoO4)3-Zr(MoO4)2 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er) systems were studied by X-ray phase analysis in the subsolidus area. Quasibinary sections were identified and triangulation was held. In systems the formation of triple molyb-dates Cs2LnZr2(MoO4)65 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er) (2:1:4) was defined for the first time.
Keywords: phase relations, triangulation, solid-phase reactions, triple molybdates
Одной из основных задач неорганической химии является синтез и изучение новых соединений. Получение соединений, способных служить основой создания материалов с функциональными свойствами, в значительной степени определяет прогресс в материаловедении и технике. Исследования многокомпонентных молибдатных и вольфраматных систем позволили значительно расширить круг перспективных соединений.
В частности, ранее нами были изучены фазовые равновесия в субсолидусной области тройных солевых систем Сs2MoO4-R2(MoO4)з-Zr(MoO4)2(R = Al, Ga, Fe, Cr, In, Sc, Bi) и показано образование соединений составов: Cs5RZr(MoO4)6 (5:1:2), Cs(RZr05)(MoO4)3 (1:1:1) и Cs2BiZr2(MoO4)65 (2:1:4) [1-6].
В настоящее время работы продолжаются и направлены на исследование систем с участием мо-либдатов цезия, редкоземельных элементов и циркония. Их изучение позволит выявить влияние трехзарядного катиона на характер фазовых соотношений. В данной работе представлены результаты исследования систем Cs2MoO4-Ln2(MoO4)3-Zr(MoO4)2 (Ln = Nd, Sm, Tb, Er).
Экспериментальная часть
В качестве исходных реактивов для синтеза компонентов систем использованы: Cs2MoO4 (ч.), MoO3 (х.ч.), Zr0(N03)2•2Н20 (ч.д.а.), Ln2O3 - основного вещества не менее 99.9%. Средние молибдаты лантаноидов Ln2(MoO4)3 и молибдат циркония Zr(MoO4)2 получены методом твердофазных реакций ступенчатым отжигом в интервале температур 350-750 °С в течение 80-100 ч.
Рентгенофазовый анализ (РФА) проведен на дифрактометре Advance D8 фирмы Bruker AXS (CuKa-излучение, графитовый монохроматор).
Твердофазное взаимодействие компонентов тройных систем изучено методом «пересекающихся разрезов» [7]. Отжиг образцов производили ступенчато в интервале температур 350-600 °С с многократным промежуточным перетиранием в течение 300-400 ч до достижения равновесия. Равновесие считалось достигнутым в случаях стабильности фазового состава образцов после нескольких последовательных отжигов.
