CC BY
56
7. Zemskaya T.I. Geochemical and microbiological characteristics of sediments near the Malenky mud volcano (Lake Baikal, Russia) with evidence of Archaea intermediate between the marine anaerobic methanotrophs ANME-2 and ANME-3 // Geo-Marine Letters. - 2010. - V.30. - Р. 411-425.
8. Сорокин Ю.И. Применение изотопного метода в водной микробиологии // Успехи микробиологии. -1975. - №10. - С. 214-228.
9. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. - М.: ГЕОС, 2001. - 500 с.
Дагурова Ольга Павловна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, e-mail:dagur-ol@mail.ru
Гаранкина Валентина Петровна, кандидат биологических наук, инженер, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.
Дамбаев Вячеслав Борисович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.
Намсараев Баир Бадмабазарович, доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6: зав. кафедрой экспериментальной биологии, Бурятский государственный университет, 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а.
Dagurova Olga Pavlovna, candidate of biological sciences, senior researcher, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova, Str., 6, e-mail:dagur-ol@mail.ru
Garankina Valentina Petrovna, candidate of biological sciences, engineer, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova, Str., 6.
Dambaev Vyacheslav Borisovich, candidate of biological sciences, researcher, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanovoy, Str., 6.
Namsaraev Bair Badmabazarovich, doctor of biological sciences, professor, Head of the Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6; Head of the Department of Experimental Biology, Buryat State University, 670000, Ulan-Ude, Smolin Str., 24a.
УДК 577.151.01 © А.А. Раднагуруева, Е.В. Лаврентьева, Б.Б. Намсараев, Я.Е. Дунаевский
ОЧИСТКА И ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕПТИДАЗЫ ИЗ PAENIBACILLUS
DENDRITIFORMIS ШТАММ Gor-10s
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 10-04-90798_моб_ст, Интеграционные проекты СО РАН №56, 94, 5 и ФЦП Минобрнауки Соглашение 8116
Проведена очистка и изучены биохимические свойства пептидазы из Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s. Показано, что культура обладает высокой субтилизиноподобной активностью. Протеаза стабильна в диапазоне температур от 23 до 60оС и рН от 6,6 до 12.
Ключевые слова: термальный источник, Горячинск, бактерии, пептидазы.
A.A. Radnagurueva, E.V. Lavrentieva, B.B. Namsaraev, Ya.E. Dunaevsky
PURIFICATION AND STUDY OF BIOCHEMICAL PROPERTIES OF PEPTIDASE FROM PAENIBACILLUS DENDRIFORM STRAIN Gor-10s
The biochemical properties of peptidase from Paenibacillus dendritiformis strain Gor-10s have been cleaned and studied. It has been shown that a culture has a high subtilizin-like activity. Proteases are stable in the range of temperature from 23 up to 60 С and рН from 6.6 up to 12.
Keywords: hot spring, Goryachinsk, bacteria, peptidases.
В гидротермах Бурятии широко распространены микроорганизмы - потенциальные продуценты ферментативных систем, устойчивые к высоким значениям температуры и рН, чем обеспечивается большой интерес с точки зрения изучения механизмов биохимической адаптации микроорганизмов к экстремальным условиям окружающей среды.
Целью работы было выделение и изучение биохимических свойств пептидазы алкалотермофиль-ной бактерии Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s, выделенной из горячего источника Горячинск.
Объекты и методы исследования
Культура Gor-10s выделена из донных осадков горячего источника Горячинск, расположенного в Прибайкальском районе Республики Бурятия. Штамм бактерий культивировали на среде состава (г/л): NH4Q - 0,3; KH2PO4 - 0,3; MgCl2 - 0,3; CaCl2 - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,5. В качестве источника азота использовали пептон в конечной концентрации 1,5%. Оптимальные значения рН роста бактерий устанавливали карбонат-бикарбонатным буфером до рН 8,5-9,0. Культура инкубировалась при 50оС на комплексной среде в течение трех суток. После инкубации клетки осаждали центрифугированием (12000 об/мин, 15 мин), полученный супернатант использовали для очистки пептидаз.
Определение внеклеточной пептидазной активности проводили согласно методике [1]. Процедура очистки внеклеточных пептидаз включала две последовательные стадии: диализ культуральной жидкости и ионообменную хроматографию.
Диализ проводили для отделения исследуемого фермента от низкомолекулярных веществ. Для этого 2 мл культуральной жидкости помещали в диализный мешочек, пропускающий молекулы, масса которых в среднем не превышает 10 кДа. Диализовали против 800 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0 при 4 °С на магнитной мешалке в течение суток.
Разделение ферментов осуществляли методом ионообменной хроматографии на колонке Mono Q (FPLC), уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,0 при скорости 1 мл/мин. Белок, сорбировавшийся на колонке, элюировали градиентом NaCl. В полученных таким образом образцах измеряли концентрацию белка и активность по выбранным субстратам. Однако в этом случае определяли не единицы активности за 1 ч, а увеличение поглощения при 410 нм (А 410) за 12 ч по причине того, что активность резко падала после разделения смеси ферментов на колонке. Далее образцы, составляющие отдельные пики пептидазной активности, объединяли, обессоливали (0,03 М фосфатным буфером, рН 7,0) и концентрировали на ячейке Amicon с мембраной UM 10 (пропускает белки не более 10 кДа) при 4 °С.
В ходе очистки вычисляли параметры полученных препаратов ферментов.
Общая активность (ед.хмл) - определяли как активность фермента во всем объеме препарата фермента.
Удельная активность (ед./мг белка) - определяли в единицах активности на один миллиграмм белка препарата.
Очистка - определяли как отношение удельной активности на данной стадии очистки к исходной удельной активности в культуральной жидкости.
Выход (%) - определяли как процент ферментативной активности на данной стадии очистки от исходной ферментативной активности в культуральной жидкости.
Определение молекулярных масс изучаемых ферментов бактерий проводили при помощи гель-хроматографии на колонке Superdex 75, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,0, содержащим также 0,5М NaCl (для нейтрализации эффекта неспецифической сорбции пептидаз на колонке). Разделение проводили со скоростью 1 мл/мин. Молекулярную массу фермента определяли с помощью калибровочной кривой.
Результаты исследования
Способность к расщеплению синтетических субстратов известного состава определяется строением субстрат-связывающего участка молекулы фермента, строением каталитического участка и является одним из наиболее важных характеризующих его свойств. Поэтому нами были проведены эксперименты по определению субстратной специфичности исследуемого фермента.
Изучение пептидазной активности на специфичном для субтилизин-подобных пептидаз субстрате - GlpAALpNa - показало наличие у штамма Gor-10s наиболее высокой внеклеточной протеолитиче-ской активности, которая составила 12,6 ед/мг белка. Результаты исследований указывают на то, что существенный вклад в пептидазную активность культуры Gor-10s, по-видимому, вносят пептидазы с субтилизин-подобной специфичностью, гидролизующие субстраты, содержащие в цепи несколько остатков аланина (GlpAALpNa) [2]. Большое количество бактериальных пептидаз, внеклеточная про-теолитическая активность которых представлена в основном субтилизин-подобными пептидазами, согласуется с литературными данными - субтилизины находили в культуральной жидкости многих видов бактерий [3, 4].
Для исследования физико-химических свойств ферментов была проведена очистка фермента, выделенного из культуральной жидкости Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s. С помощью использованных методов удалось очистить фермент 13,8 раза с выходом 46,7%. Количественные характеристики очистки пептидазы из Paenibacillus dendritiformis представлены в табл. 1.
Таблица 1
Стадии очистки пептидазы, выделенной из культуральной жидкости Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s
Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, ед Удельная активность, ед./мг белка Степень очистки Выход, %
Культуральная жидкость 20,56 150,4 7,32 1,0 100
Диализ 9,53 119,8 12,57 1,7 79,7
Ионообменная хроматография 0,402 69,94 173,9 13,8 46,5
С помощью гель-хроматографии была определена молекулярная масса фермента, равная 19-20 кДа.
Активные фракции исследовали с помощью электрофореза. Электрофореграмма фракции, полученной после гель-хроматографии, позволяет считать полученный препарат электрофоретически гомогенным.
Таким образом, выбранный метод очистки позволил получить препарат фермента культуры Gor-10s, который содержал только один фермент с исследуемой активностью. Так как исследуемые культуры бактерий способны расти в экстремальных условиях, было интересно выяснить, насколько адаптированы к экстремальным условиям секретируемые ими ферменты. С этой целью было изучено влияние температуры и рН на активность и стабильность внеклеточной пептидазы штамма Gor-10s, гидролизующей GlpAALpNa.
Определение температурного оптимума и стабильности ферментов осуществлено для диапазона 23-80 оС. Пептидаза культуры Gor-10s стабильна до 60 оС. Оптимум пептидазы Gor-10s составляет 50 оС.
График полученной в эксперименте зависимости активности сериновой пептидазы Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s от температуры представлен на рис. 1.
Рис. 1. Температурный оптимум и стабильность субтилизинподобной пептидазы
Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s
В литературе показано, что субтилизинподобные пептидазы характеризуются широким интервалом температурного оптимума и стабильности. По мнению ряда авторов, высокая стабильность пептидаз бацилл обеспечивается гидрофобными и ионными взаимодействиями, а также водородными связями и дисульфидными мостиками в белковой глобуле субтилаз [3, 5].
Исследование рН оптимума и стабильности проведено в диапазоне рН от 3,24 до 12. Фермент штамма 0ог-108 активен в относительно узком щелочном диапазоне рН: активность, превышающая 50%, была выявлена на участке рН от 10,3 до 12 с максимумом при рН 11,4. Исследуемый фермент был стабилен при рН 6,6-12.
Известно, что многие бактериальные субтилизин-подобные пептидазы сохраняют активность при высоких значениях рН [5]. Можно предположить, что высокая щелочеустойчивость изученных белков служит адаптационным механизмом бактерий, которая позволяет им функционировать в экстремальных условиях.
Определение природы функциональных групп активного центра показало, что активность внеклеточных пептидаз по субстрату GlpAALpNA у изученного штамма Gor-10s подавляется специфическим ингибитором сериновых пептидаз - фенилметилсульфонилфторидом. Ингибиторы цистеиновых пептидаз - йодацетамид и металлопептидаз - этилендиаминтетраацетат либо совсем не оказывали влияния на активность, либо подавляли активность в незначительной степени.
Согласно полученным результатам, изученная культура активно секретировала сериновые пептидазы, в частности субтилизин-подобные. Внеклеточные пептидазы вынуждены работать в более жестких условиях внешней среды, следовательно, должны иметь более высокую стабильность. Показана широкая вариабельность температурного оптимума и стабильности. Обнаружен широкий рН интервал с высоким значением оптимума. Полученные результаты показали границы приспособляемости и функционирования выделенной пептидазы в экстремальных условиях гидротерм Бурятии.
Литература
1. Внеклеточная протеолитическая активность бактерий, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья / Е.В. Лаврентьева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 46. - №6. - С. 630-636.
2. Ballinger M.D. Subtilisin. In: Handbook of proteolytic enzymes. - London: Academic Press, 1998. - Electronic version on PC CD-ROM.
3. Получение и характеристика субтилизинподобных протеиназ, секретируемых в стационарную фазу роста Bacillus amyloliquefaciens H2 / Н.П. Балабан и др. // Биохимия. - 2007. - Т.72, вып. 4. - С. 568-575.
4. Условия биосинтеза внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus KMM62 / Л.А. Маликова и др. // Микробиология. - 2007. - Т.76, вып. 3. - С. 1-8.
5. Выделение и характеристика субтилизинподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ 73 на разных фазах роста бацилл / Е.О. Михайлова и др. // Биохимия. - 2007. - Т. 72, вып. 2. - С. 228-235.
Раднагуруева Арюна Арсалановна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, e-mail:aryuna_rg@mail.ru
Лаврентьева Елена Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, e-mail: lena_l@mail.ru
Намсараев Баир Бадмабазарович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, заведующий кафедрой экспериментальной биологии, Бурятский государственный университет, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а.
Дунаевский Яков Ефимович, доктор биологических наук, профессор, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, стр. А 40, e-mail:dun@belozersky.msu.ru
Radnagurueva Aruna Arsalanovna, candidate of biological sciences, junior researcher, Institute of General and Experimental Biology SB RAS 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6.
Lavrentieva Elena Vladimirovna, candidate of biological sciences, researcher, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6.
Namsaraev Bair Badmabazarovich, doctor of biological sciences, professor, Head of the Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova Str., 6; Head of the Department of Experimental Biology, Buryat State University, 670000, Ulan-Ude, Smolin, Str., 24a.
Dunaevsky Yakov Efimovich, doctor of biological sciences, professor, A.N. Belozersky Physical-Chemical Biology Instutite, M.V. Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Leninskiye gory, Bdg, A 40.
Д.Д. Цыренова, Д.Д. Бархутова, Е.В. Лазарева и др. Минералообразование в цианобактериальном мате источника Горячинск
УДК 549+576.809.51(571.54) © Д.Д. Цыренова, Д.Д. Бархутова, Е.В. Лазарева, А.В. Брянская
МИНЕРАЛООБРАЗОВАНИЕ В ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНОМ МАТЕ ИСТОЧНИКА ГОРЯЧИНСК
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №11-05-90717-моб_ст, №12-04-31187-мол_а, №12-04-98079-р_Сибирь_а, интеграционных проектов президиума СО РАН №5 и 94
Было изучено минералообразование в природном и лабораторном мате источника Горячинск. В природном мате обнаружены пирит кубической формы, кремнезем, сульфат бария с примесями стронция. В лабораторном - отложения фосфата кальция, кварца, кристаллов оксида железа и карбоната кальция. В лабораторном цианобактериальном сообществе минералообразование происходило интенсивнее, чему способствовали подобранный состав среды, содержание основных элементов и температура культивирования.
Ключевые слова: минералообразование, цианобактериальное сообщество.
D.D. Tsyrenova, D.D. Barkhutova, E.V. Lazareva, A.V. Bryanskaya MINERALIZATION IN CYANOBACTERIAL MAT OF GORYACHINSK SPRING
Mineralization was studied in natural and laboratory mat of Goryachinsk spring. Cubic pyrite, silica, barium sulfate doped with strontium were found in the natural microbial mat. Sediments of calcium phosphate, quartz, crystals of iron oxide and calcium carbonate were found in the laboratory mat. Mineralization in laboratory cyanobacterial community was more intensive, it was promoted by the selected composition of medium, the content of basic elements and the temperature of cultivation.
Keywords: mineralization, cyanobacterial communities.
Целью данного эксперимента явилось выявление отложения минералов в природном и лабораторном цианобактериальном сообществе в зависимости от состава растворов и структуры сообщества.
Объект и методы исследования
Источник Горячинск расположен в Прибайкальском районе Республики Бурятия (Россия) [1]. Термальный источник выходит на поверхность на восточном берегу оз. Байкал в 1,5 км от береговой линии, в широкой долине между Котковским и Туркинским хребтами. Температура сульфатной натриевой воды достигает 42-43 °С, рН - 8.9-9.0, минерализация - 0.50-0.65 г/дм3. Разгрузка терм происходит в верхней части небольшого песчаного оврага, промытого горячей водой. Самоизливающий-ся выход источника находится в закрытом павильоне, из которого вода поступает в бетонный кап-тажный колодец (размер 15х4 м, глубина 1.2 м, выход № 1) и далее самотеком в ванные помещения. Избыток ее стекает в пруд размером 100х80 м, образованный небольшой дамбой, из него часть воды попадает в Байкал. Рядом с каптажным колодцем имеется второй выход, закрытый павильоном, вода из него также сбрасывается в пруд. В овраге вдоль зоны разрывных нарушений на протяжении 180 м имеется ряд мелких источников, часть из которых имеет периодическое функционирование. Пробы микробных матов были отобраны из 3 станций в марте 2011 г.
Для изучения отложения минералов микробные маты упаковывались с сохранением структуры, а в лабораторных условиях разделялись на слои и сушились. Изучение качественного состава минеральных фаз проводилось при помощи сканирующего электронного микроскопа Leo Oxford 1430VP (Германия) и светового Axioskop 2 Plus (Германия). Видовую принадлежность цианобактерий определяли по отечественным определителям [2, 3].
Для проведения лабораторного эксперимента по изучению отложения минералов в цианобактериальных матах использовали модифицированную среду Кастенхольца для термофилов (г/дм3): NaHCO3 - 0.6, NaCl - 0.008, K2HPO4 - 0.1, NNO3 - 0.1, Na2SiO4 - 0.2, FeCb - 0.028, Na2SO4 - 0.05. Содержание в среде MgSO4 и CaCl2 было различным: в эксперименте №1 использовали следующие концентрации MgSO4 - 0,002, CaCl2 - 0,005; №2 - MgSO4 - 0,003, CaCl2 - 0,010; №3 - MgSO4 - 0,004, CaCl2 - 0,020; №4 - MgSO4 - 0,010, CaCl2 - 0,050; №5 - MgSO4 и CaCl2 не добавляли.
В начале эксперимента определяли рН и Еh в каждой из сред на приборе Анион 4100 (Россия). Отбирали по 1 см2 микробного мата (очищенного от песка, отмершей биомассы), переносили в колбу с 20 мл среды с различным содержанием Ca и Mg. Выращивание лабораторного цианобактериального сообщества проводили в течение одной недели в термостате при температуре 40 оС. Для каждого экс-
