CC BY
12
УДК 557.152.361
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ КИСЛЫЕ ФОСФАТАЗЫ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae. КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. СЕКРЕЦИЯ
С. Н. Егоров1*, Е. В. Петрова2, А. В. Левашов2
(1биологический и 2химичесшй факультеты Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Воробьевы горы, Москва 119899, Россия; тел./факс (095)939-46-58; e-mail: sne@protein. bio. msu. su)
В работе проведен сравнительный анализ нативных внеклеточных кислых фосфатаз и гомо-мерных форм репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучена их субстратная специфичность, термостабильность, рН-зависимость. Продемонстрировано отсутствие взаимосвязи между секрецией фермента, состоящего только из минорных субъединиц репрессибельной кислой фосфатазы, транспортом белков в почку дрожжей. Высказана гипотеза о роли минорных субъединиц репрессибельной кислой фосфатазы в сортинге фермента.
Два пула кислых фосфатаз определяют в среде культивирования дрожжей. Фермент, синтезируемый при высокой концентрации ортофосфата в среде, называют конститутивным (кКФ), он является гомомером и кодируется геном РНОЗ. При низком содержании ортофосфата в среде происходит синтез репрессибельной кислой фосфатазы (рКФ), которая кодируется тремя структурными генами: РНО5, РНО10 и РНО11. Гетеромерная организация реп-рессибельной кислой фосфатазы не нашла убедительного объяснения в литературе. Высказывались предположения о копировании гена РНО5 вместе с регуляторными областями в других хромосомах дрожжей [1]. В нашей работе высказана гипотеза о функциональном различии субъединиц, входящих в состав рКФ, что подтверждается кинетическими характеристиками гликопротеинов, кодируемых отдельными структурными генами репрессибельной кислой фосфатазы.
Методы исследования
В работе использовали следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae: S 288C(a MAL, GAL2), YMR4 (а his 11, 3-15 leu2-3, 2-112 canR pho5-pho3::ura3A1 ura3A5), YMR44^ his 11, 3-15 leu2-3, 2-112 canR pho5-pho3::ura3A1 ura3A5 pho11::URA3), YMR46(а his11, 3-15 leu2-3, 2-112 canR pho5-pho3::ura3A1 ura3A5 pho10::URA3). Они были любезно предоставлены профессором Хинненом (Prof. A. Hinnen. Hans-Knoll-Institut fur Naturstoff-Forschung, Jena, Germany). Культуры дрожжей поддерживали на твердой YPD-среде. Выращивание клеток в жидкой среде проводили по приведенной ранее методике [2]. Трансформацию клеток дрожжей плазмидами pDP34-gapfl-PHO5, pDP34-gapfl-PH010 и pDP34-gapfl-PHO11 проводили по методу [3]. Выделение кислых фосфатаз проводили по схеме, предложенной ранее [4]. Кинетические исследования кислых фосфатаз проводили на приборе, регистри-
A/Ao 1,0-
0,6-
0,2"
20 30 40 50 60
Т °с
Термостабильность гомомерных форм внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae: 1 - С-форма репрессибельной кислой фосфатазы; 2 - В-форма репрессибельной кислой фосфатазы; 3 - А-форма репрессибельной кислой фосфатазы. Мерой оценки термостабильности являлось отношение активности ферментного препарата, после 30-минутной инкубации при заданной температуре в 0,1 М Na-цитрат-ном буфере при рН 5,0 (А), к его начальной активности (А0). В качестве субстрата использовали 4-нитрофенилфосфат
рующем изменение концентрации ортофосфата в пробе. За основу была взята работа [5]. Наши модификации метода касались использования микрокамеры для смешивания реагентов Reacti-Vials 0.3ml фирмы (Pierce, США). Непрерывную регистрацию изменения оптической плотности образца проводили на спектрофотометре «Ultrospec 4050» (LKB, Швеция) с выводом результатов на самописец, используя проточную кювету (0,2 мл). Определение активности кислых фосфатаз в отдельной
*Адресат для переписки.
6 ВМУ химия, № б
пробе проводили с использованием в качестве субстрата 4-нитрофенилфосфата, по методу [6].
Результаты и их обсуждение
Ранее нами было показано, что при трансформации клеток дрожжей отдельными структурными генами реп-рессибельной кислой фосфатазы в среде культивирования накапливались гомомерные формы фермента [7]. Фермент, кодируемый генами РНО5, РН010 и РНО11 мы назвали А-, В- и С-формой внеклеточной кислой фосфатазы соответственно.
Молекулярная масса гомомерных ферментов была определена с помощью прибора «HPLC» на колонке «SUPEROSE 6» (Pharmacia, Швеция) и составляла для А-формы 470 kDa, для В- и С-форм - 370 kDa [7]. Зависимости скорости гидролиза 4-нитрофенилфосфата от рН свидетельствуют, что отдельные субъединицы реп-рессибельной кислой фосфатазы обладают несколько отличающимися рН-оптимумами (табл. 1). Так, если для А-формы он составляет 5,0, то для В- и С-форм - 5,35,5 единиц рН. Сравнительная термостабильность гомо-мерных форм представлена на рисунке. Видно, что А-форма является более стабильным ферментом, чем В- и С-формы. 50%-я активность А-, В- и С-форм сохранялась при 54, 39, и 36° соответственно. Для определения субстратной специфичности внеклеточных кислых фосфатаз было использовано 10 субстратов (табл. 2). Были применены широко используемые при исследованиях кислых фосфатаз такие субстраты, как 4-нитрофе-нилфосфат, Р-глицерофосфат, глюкозо-6-фосфат, АМФ, ЦМФ. Кроме того, мы использовали пирофосфат, АТФ, ГТФ. Для репрессибельной кислой фосфатазы ранее было показано, что высокоочищенный фермент способен дефосфорилировать не только свободные фосфаты аминокислот, но также фосфорилированные полипептиды и некоторые клеточные белки [8]. Для сравнительного опре-
Т а б л и ц а 1
Константы ионизации, контролирующие каталитическую активность гомомерных форм внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces еегеж1ае
Кислые фосфатазы (формы) pKa pKb
A 4,4 5,8
B 5,2 5,8
C 4,8 6,1
Примечание. При определении влияния рН на активность гомомерных форм кислой фосфатазы использовали 4-нитрофенилфосфат в качестве субстрата в 0,1М Na-цитратном буфере со значениями рН в диапазоне от 3,5 до 6,5.
деления протеиндефосфорилирующей активности различных внеклеточных кислых фосфатаз мы использовали О-фосфо-БЬ-тирозин и О-фосфо-БЬ-серин (Sigma, США). Из полученных результатов следует, что в целом, как и принято считать, обе нативные формы ферментов имеют широкую субстратную специфичность, хотя для всех изученных субстратов значения Vm для репрессибельной кислой фосфатазы были практически на порядок выше, чем для конститутивного фермента. Отличия в субстратной специфичности показаны для отдельных субъединиц репрессибельной кислой фосфатазы. Так, для тирозин-фосфата фосфатазная активность нативной репрессибель-ной кислой фосфатазы определяется активностью субъединиц, кодируемых генами PH010 и РНО11, причем в на-тивном ферменте усиление данной ферментативной активности обусловлено, по-видимому, межсубъединич-ным взаимодействием. Таким образом, различия в субстратной специфичности гомомерных форм репресси-бельной кислой фосфатазы в сочетании с выявленными
Km (мМ) Vm (мМ/мин- мг)
Субстраты экспрессируемые гены экспрессируемые гены
PHO5 PHO10 PHO11 PHO3 PHO5 PHO10 PHO11 PHO5 PHO10 PHO11 PHO3 PHO5 PHO10 PHO11
4-НФФ 0,20 0,89 0,35 0,47 0,18 5,12 0,64 1,13 0,86 1,30
Пиро-Ф 0,24 1,89 0,19 0,10 0,09 3,50 0,29 1,25 1,03 1,57
Р-Глицеро-Ф 0,36 1,85 0,60 0,76 0/85 7,88 1,92 1,65 1,41 3,14
Глюкозо-6-Ф 0,32 2,20 0,29 0,49 0,97 7,88 1,35 1,61 1,18 4,55
АМФ 0,20 2,08 0,29 3,06 1,51 8,60 0,91 0,96 0,63 0,89
ЦМФ 0,77 1,94 0,91 6,58 4,32 7,67 1,82 3,02 0,86 1,62
АТФ 0,29 0,19 1,29 0,12 0,21 3,18 0,08 0,19 1,25 2,50
ГТФ 0,04 0,03 0,05 1,30 0,01 2,06 0,10 2,71 74,94 0,24
Тирозин-Ф 0,11 0,45 0,18 0,05 0,04 12,46 1,74 0,75 3,82 2,14
Серин-Ф 0,53 4,42 5,10 0,42 0,21 0,58 0,13 0,58 0,12 0,17
Т а б л и ц а 2
Субстратная специфичность внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Т а б л и ц а 3
Корреляционная зависимость секреции внеклеточных кислых фосфатаз с процессом почкования клеток дрожжей 8аескаготуса сегеш1ае
Штаммы Фосфат в Кислые Коэффициент
дрожжей среде фосфатазы корреляции
S288C + кКФ 0,72
S288C - рКФ 0,21
YMR4 + A-форма 0,90
(pDP34-PHO5)
YMR44 - B-форма 0,08
YMR46 - C-форма 0,16
Примечание. «+» - Среда выращивания, содержащая 10 мМ К2НР04. «—» - Среда выращиваня, лишенная ортофосфата. Коэффициент корреляции рассчитывали с помощью компьютерной программы Зга^гка V 4.0.
различиями в рН-оптимумах и термостабильности, позволяют высказать гипотезу о различной функциональной роли отдельных субъединиц в составе репрессибель-ной кислой фосфатазы. Высказанное предположение согласуется с результатами по определению взаимосвязи секреции внеклеточных кислых фосфатаз с процессом почкообразования. Было продемонстрировано, что толь-
ко транспорт внеклеточного конститутивного фермента коррелирует с почкованием клетки, т.е. только конститутивная кислая фосфатаза является участником единого транспортного потока, постулированного ранее для внеклеточных белков дрожжей [9]. Секреция нативной реп-рессибельной кислой фосфатазы никак не могла бы быть связана с почкованием [10]. Этот факт указывает на возможность существования у дрожжей альтернативного транспортного пути для внеклеточных белков. Возможная роль в выборе альтернативного транспортного пути может принадлежать минорным субъединицам репрессибельной кислой фосфатазы, содержание которых во внеклеточном ферменте не превышает 15% [7]. Нами проведено исследование по выяснению зависимости секреции гомомерных форм репрессибельной кислой фосфатазы и процесса почкования клеток [11]. Показано, что А-форма, кодируемая геном РНО5, не имеет сигнала сортинга и так же, как конститутивный фермент, транспортируется в растущую дрожжевую почку в «конститутивном транспортном потоке». В- и С-формы рКФ, кодируемые генами РНО10 и РНО11, экск-ретируются по альтернативному транспортному пути, т.е. они имеют сигналы сортинга и определяют альтернативный транспортный путь внеклеточной кислой фос-фатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae (табл. 3).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Venter U., Horz W. // Nucleic Acids Research. 1989. 17. Р. 1353.
2. Семенова И. Н., Егоров С.Н., Егоров Н.С. // Микробиоло-
гия. 1986. 55. C. 796.
3. Keszenman-Pereyra, D., Heida, K. // Agric. Biol. Chem. 1989. 53.
Р. 2535.
4. Шнырева М.Г., Цупрун В.Л., Стельмашук В.Я., Егоров С.Н. //
Биохимия. 1992. 57. Р. 1100.
5. Baykov A.A., Avaeva S.M. // Anal. Biochem. 1981. 116.
Р. 1.
6. Torriani A. // Biochim. Biophys. Acta. 1960. 38. Р. 460.
7. Shnyreva M.G., Petrova, E.V., Egorov, S. N., Hinnen A. //
Microbiol. Res. 1996. 151. Р. 291.
8. Lopandic K., Deana, A. D., Barbaric S., Pina L. A. // Biochem.
International. 1987. 14. Р. 627.
9. Schekman, R., Novick P. The Molecular Biology of Yeast
Saccharomyces. Cold Spring Harbor Laboratory. 1982. Р. 361. 10 Шнырева М.Г., Егоров С.Н. // Микробиология. 1990. 59. Р. 948.
11. Егоров С.Н., Мирющенко Ф.Л., Максимов В.Н // Микробиология (в печати).
Поступила в редакцию 20.06.2000
7 ВМУ химия, № 6
