CC BY
43
А. Ю. Физикова, М. В. Падкина, Е. В. Самбук
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ рНо85 У ДРОЖЖЕЙ Р1СН1А РЛБТОШБ
Введение
Эволюционно-консервативные белки класса циклин-зависимых протеинкиназ (ЦЗП) играют важную роль в регуляции клеточного цикла, метаболизма и организации цитоскелета эукариотической клетки. Особое внимание исследователей в последнее время привлекает протеинкиназа РЬо85р Saccharomyces сегетзгае, которая является гомологом основной ЦЗП нервной системы человека Cdk5 [14].
Мутации в гене РН085 дрожжей S. сегетз1ае приводят к ряду фенотипических проявлений, таких как конститутивный синтез репрессибельной кислой фосфатазы РЬо5 (рКФ), медленный рост клеток с задержкой в фазе Gl [28], накопление гликогена [13], дефекты споруляции, морфологии и полярности клеток [17], отсутствие роста на пролине [3], быстрая потеря митохондриальной ДНК (мтДНК) [8], накопление температурочувствительных мутаций [20].
Метилотрофные дрожжи РгсЫа разЬотз являются широко используемыми продуцентами рекомбинантных белков, но недостаточно изучены с генетической точки зрения. Получение мутаций в гене-гомологе РН085 у Р.разЬотз и изучение их фенотипических проявлений позволит расширить представления о механизмах регуляции клеточного цикла и различных метаболических процессов у этого вида дрожжей. Принадлежность Р. разЬоггз и S. сегетз1ае к порядку 8ассЬаготусе1а1ез позволяет проецировать известные закономерности регуляции генов дрожжей-сахаромицетов на систему экспрессии генов метилотрофных дрожжей.
Субстратную специфичность многофункциональной киназы РЬо85р определяют циклины [22]. В данное время известно 10 циклинов и 19 субстратов, связывающихся с РЬо85р [15, 20]. Первым обнаруженным субстратом циклин-киназного комплекса РЬо85р-РЬо80р был транскрипционный фактор РЬо4р, активирующий экспрессию генов регулона РН0. Гипофосфорилированный РЬо4р преимущественно локализован в ядре [16, 27], где вместе с коактиватором РЬо2р, активирует транскрипцию 22 генов, среди которых ген рКФ РН05 [18, 24].
Среди наиболее важных субстратов РЬо85р можно отметить и белки Sic1, Gcn4, Swi5, АвЬ1. Sic1p — ингибитор ЦЗП Cdc28, удерживающий клетку на стадии S клеточного цикла [16, 23]. Транскрипционный фактор Gcn4p необходим для повышения уровня экспрессии генов синтеза аминокислот в условиях аминокислотного голодания [11, 16, 21]. Транскрипционный фактор Swi5р входит в состав SWI/SNF комплекса перестройки хроматина, и необходим для экспрессии генов в зависимости от стадии клеточного цикла [16, 19]. АвЬ1р — специфический репрессор транскрипции гена НО в дочерних клетках [28].
Вовлеченность киназы РЬо85р в регуляцию клеточного цикла и метаболических процессов делает актуальным изучение функций этого белка у дрожжей Р. разЬоггз. У этого вида дрожжей обнаружена только одна рКФ, кодируемая геном РН01 [25].
© А.Ю.Физикова, М.В.Падкина, Е.В.Самбук, 2009
Генетический контроль экспрессии гена РН01 не изучен. Хотя гомоталличность вида Р. разЬотгз осложняет генетический анализ мутантов, стабильность вегетативного гаплоидного состояния клеток Р. разЬотгз упрощает процесс отбора мутантов и позволяет изучать их фенотипические проявления.
Цель настоящей работы — изучение фенотипического проявления мутаций в гене РНО85 Р. разЬотз, гомологичного РН085 S. сететз1ае.
Материалы и методы исследования
Штаммы. В работе использованы штаммы дрожжей Р. разЬотз GS115 («1пуйго-gen», США; Ы.з4) и S. сетеугзгае S288C (МАТа SUC2 да12 та1 те1 Ао1 ,р,о8-1 hap1 Но Ыо1 Ыоб) [22].
Для амплификации плазмидной ДНК был использован штамм Е. соИ DH5а (Г-еиё,А1 НзйКИ (тк-, тк +) зирЕ44 ЬЫ-1 гесА1 дугА (Ыа1г) ге1А1 A(lacZYA-argF)и1б9 (1еоЕ (ф80dlacA(lacZ)М 15)).
Плазмиды. В работе при конструировании были использованы плазмиды риС19 («ОоП^Ь», США) и pFL36 («LGC/ATCC», Великобритания).
Последовательность гена РН085 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Tаq-полимеразы призводства <^егтеП;а8» (Латвия) и следующих праймеров: б'-ССССТАССАССТАСАСТССТААСССССТАССТТ-З' - прямой, б'-АТСАААТСА-САСТАСААТССТСТСССАСАТСТСС-З'—обратный. Условия реакции: 20 циклов в «МшЮус1ег» (МШевеагсЬ, США) при: 92°С-40 с; 56°С-60 с; 72°С-60 с; 72°С-5 мин.
Методы. УФ-мутагенез проводили по стандартной методике [1]. Для облучения использовали лампу ДБ 30W (0,28 Дж/м2 • с). Клетки, высеянные на среду с агаром, облучали и инкубировали в темноте (для избежания фотореактивации) при 30°С.
Выделение ДНК из клеток, генетическую трансформацию, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей, лигирование, электрофорез ДНК в агарозном геле и белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях проводили по стандартным методам [2, 26]. Выделение фракции термостабильных белков проводили в соответствии с методикой, опубликованной ранее [12]. Определение активности рКФ на поверхности колоний дрожжей проводили по стандартной методике [6]. Определение содержания гликогена в клетках дрожжей проводили обработкой колоний парами йода [10].
В работе использованы стандартные среды и условия культивирования дрожжевых и бактериальных культур [1, 26]. Для определения активности КФ использовали среду ПЕП с КН2РО4 в концентрации 500 мг/л. Для проверки жизнеспособности клеток Р. разЬотз без мтДНК штаммы высевали на полные среды YEPD с бромистым этидием (ВгЕШ) в концентрации 10 мг/л среды.
Статистическую обработку результатов проводили при помощи стандартных методов [7].
Результаты исследования и их обсуждение
Получение делеции гена РНО85 P. pastoris. Для получения делеции в гене РНО85 Р. разЬотз конструировали вектор pFA3 (рис. 1). Использование этого вектора позволило получать штаммы с делецией РН085, возникшие за счет гомологичной рекомбинации с хромосомной копией гена РрРН085. Последовательность, кодирующая
MATa//MATa adelA/ZADEl his4A//his4A lys2A// lys2A ura3A//ura3A leu2A//leu2A
thr4A// thr4A
Рис. 1. Схема конструирования вектора pFA3.
РНО85 S. cerevisiae, была получена при помощи ПЦР с хромосомной ДНК штамма S288C в качестве матрицы. Олигонуклеотиды были подобраны таким образом, чтобы амплифицированная последовательность гена PHO85 содержала на 5'- и 3'- концах сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции BamHI (C'CTAGG) и XbaI (T'CTAGA) соответственно. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HpaII (CCGG). Образовавшиеся фрагменты размером 718 п.о. (BamHI-HpaII) и 175 п.о. (HpaII-XbaI) переклонировали в бактериальный вектор pUC19 по сайтам BamHI, XbaI (pUC19-Apho85). Фрагмент ДНК с геном LEU2 был получен гидролизом плазмиды pFL36 и переклонирован в плазмиду pUC19-Apho85 по сайту BglII (A'GATCT) гена PHO85.
Для доказательства, что в составе вектора pFA3 присутствует конструкция Apho85::LEU2, проводили ПЦР с использованием праймеров к PHO85, а также гидролиз эндонуклеазой рестрикции BglII (рис. 2). Присутствие на электрофореграмме ПЦР-продукта размером 3748 п.о. подтверждает наличие конструкция Apho85::LEU2 в полученной плазмиде pFA3.
Так как штамм GS115 несет мутацию только в гене HIS4, был необходим этап получения мутаций в гене — гомологе LEU2. При помощи УФ-мутагенеза штамма GS115 были отобраны стабильные мутанты Leu-. Эти штаммы трансформировали фрагментом ДНК, содержащим LEU2 S^erevisiae (pFL36/BglII). В результате был иденти-
п. о.
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2500
2000
1500
Рис. 2. Электрофореграмма разделения продуктов гидролиза плазмидной ДНК pFA3 и продуктов ПЦР с использованием в качестве матрицы pFA3.
а: 1 —плазмида pFA3, обработанная эндонуклеазой рестрикции BglII; 2 — маркер «Ladder High Range» (Fermentas); б: 1 —маркер «Ladder High Range» (Fermentas); 2 — продукты ПЦР плазмиды pFA3
Рис. З. Активность кислой фосфатазы у трансформантов pFA3.
а — 85-3-GS15; б — 3-GS115.
фицирован штамм P. pastoris 3-GS115 (his4 leu2). Полученный штамм 3-GS115 трансформировали линеаризованной по сайту PvuII плазмидой pFA3 и отбирали трансформанты His-Leu+. У трансформантов определяли активность рКФ (рис. 3). Как видно из рисунка, все трансформанты характеризуются конститутивным синтезом рКФ, что соответствует фенотипическому проявлению мутации гена pho85 S. cerevisiae и позволяет предположить, что трансформанты возникли за счет интеграции конструкции Apho85::LEU2 в ген P. pastoris, гомологичный гену PHG85.
Фенотипическая характеристика штаммов Apho85. Стабильность мтДНК. Известно, что на фоне мутации pho85 у дрожжей S. cerevisiae наблюдается накопление дыхательно-некомпетентных клеток, обусловленное дестабилизацией и потерей мтДНК [8].
На первом этапе определяли влияние потери мтДНК на жизнеспособность дрожжей P. pastoris. Для этого штамм 3-GS115 высевали на полные среды с BrEth и без него в качестве контроля. Окрашивание метиленовым синим показало нежизнеспособность большинства клеток после инкубации на среде с BrEth. В эксперименте вырастал только ~1% клонов, которые при этом оставались Gly+ (рис. 4). Таким образом, несмотря на принадлежность дрожжей вида Pichia к группе слабых «бродильщиков», способных существовать за счет брожения в анаэробных условиях, клетки P. pastoris без мтДНК нежизнеспособны. Таким образом, P. pastoris может быть отнесена к petite-негативным видам.
Для определения частоты возникновения дыхательно-некомпетентных клонов на фоне A pho85 штамм 3-GS115 трансформировали pFA3/ PvuII и отбирали трансформанты His-Leu+ PhoC, возникающие за счет интеграции в локус PpPHG85. Три независимых трансформанта His-Leu+ PhoC (his4 leu2 Apho85::LEU2) и 3 клона исходного
Рис. 4- Оценка жизнеспособности штаммов Р. равЬвтгв без мтДНК.
а —3-08115, УЕРО; б — 3-08115, УЕРО с БгЕ^; в —окраска мертвых клеток после среды с бромистым этидием метиленовым синим (световая микроскопия, масштабный отрезок—5 мкм).
штамма 3-GS115 (his4 leu2 PHO85) в качестве контроля культивировали в селективной среде до стационарной стадии роста и высевали на полные среды как с глюкозой, так и с глицерином в качестве источника углерода в концентрации 100 клеток на чашку, после чего инкубировали в течение четырех дней и сравнивали количество выросших клонов на средах с разными источниками углерода. Сравнение количества выросших на глицерине клонов у штаммов Apho85 (88,1±18,7%) и исходного штамма 3-GS115 (83,5±21,4%) не выявило достоверных отличий.
Накопление ядерных мутаций Ts. Ранее нами было показано, что на фоне pho85 у штаммов S. cerevisiae происходит накопление ядерных мутаций Ts [5].
Для анализа частот возникновения Ts-клонов на фоне Apho85 штамм 3-GS115 трансформировали pFA3/PvuII и отбирали трансформанты His~Leu+ PhoC (конститутивный синтез рКФ), возникшие за счет интеграции в локус PpРНО85 (P.pastoris PHO85). Три независимых трансформанта His-Leu+PhoC и клоны исходного штамма 3'-GS115 (his4 leu2 PHO85) культивировали в селективной среде до стационарной стадии роста и высевали на полные среды с глюкозой в концентрации 100 клеток на чашку. Чашки инкубировали при 30 и 37° С в течение трех дней, подсчитывали и сравнивали количество выросших клонов на фоне Apho85 по сравнению с исходным штаммом PHO85.
Анализ частот возникновения термочувствительных клонов на фоне Apho85 штаммов P.pastoris (85-3-GS115), проведенный в данной работе, не выявил достоверных отличий в накоплении Ts-мутантов у штаммов 85-3-GS115 (82,0±22,2% Tr-клонов по сравнению с 93,4±14,3% Tr-исходного штамма 3-GS115).
Накопление гликогена. Гликоген — основной запасной полисахарид дрожжевой клетки, накопление которого зависит как от стадии роста клетки, так и от состава среды. У дрожжей S. cerevisiae протеинкиназа Pho85 принимает участие в регуляции активности гликогенсинтазы [9].
Оценка содержания гликогена выявила более высокое его содержание у штаммов Apho85 на средах с высоким содержанием фосфата в сравнении с 3-GS115 (таблица), что свидетельствует в пользу сходного с S. сerevisiae механизма регуляции активности гликогенсинтазы у этого вида дрожжей.
Катаболизм пролина. Мутанты pho85 дрожжей S. cerevisiae неспособны расти
на средах с пролином в концентрации 0,005 и 0,46%, что объясняется нарушением функционирования ферментов катаболизма пролина и нарушением функций пермеаз Ри14р и Gap1p, в результате чего происходит накопление токсичного продукта на средах с
0,46%-ным пролином, когда должна действовать общая пермеаза аминокислот Gap1p [3]. Штаммы рко85 Р. разЬотз были охарактеризованы по способности расти на средах с пролином в концентрации 0,005 и 0,46% в качестве источника азота и с глюкозой, метиловым и этиловым спиртами и глицерином в качестве источников углерода (см. таблицу).
Фенотипическая характеристика штаммов Арко85 Р. равіогів
КФ Гликоген Глюкоза Этиловый спирт Метиловый спирт Глицерин
0,005% пролин 0,5% пролин 0,005% пролин 0,5% пролин 0,005% пролин 0,5% пролин 0,005% пролин 0,5% пролин
8.5-3-Й5115 + + + + + + + + — +
+ + + + + + + + — +
+ + + + + + + + — +
З-СЗШ — — + + + + + + + +
— — + + + + + + + +
— — + + + + + + + +
Как видно из таблицы, отсутствие функциональной киназы РНо85 Р. разЬоггз не влияет на катаболизм пролина на средах с глюкозой, этиловым и метиловым спиртами в качестве источника углерода. Если в качестве единственного источника углерода используется глицерин, то при низкой концентрации пролина мутанты рко85 не способны расти, а на средах с 0,46% пролина 85-3-GS115 растут нормально, что можно объяс-
1
2
116 66 45 35 25 18,4 14,4 кДа
Рис. 5. Изменение состава фракции термостабильных белков штаммов Арковб Р. разЬотв.
1 — наложение денситограмм электрофореза в 12%-ном ПААГ с ДСН термостабильных белков штамма АрНовб (черный) и исходного штамма 3-08115 (контур); 2 — маркеры молекулярной массы (кДа): слева направо пики—116; 66,2; 45; 35; 25; 18,4; 14 кДа.
нить спецификой метаболизма пролина P. pastoris. Эти результаты позволяют предположить участие киназы Pho85p P. pastoris в регуляции транспорта пролина гомологом пермеазы Ри14 в зависимости от источника углерода.
Состав фракции термостабильных белков у штаммов Apho85 P. paзtoriз. Проведенные нами ранее исследования выявили, что у штаммов pho85 Б. сerevгsiae наблюдается изменения организации актинового цитоскелета, а именно происходит увеличение числа актиновых бляшек. Выделение фракции термостабильных белков, в том числе и тропомиозина, подтвердило изменения в качественном и количественном составе белков цитоскелета [4].
В данной работе мы выделяли термостабильные белки штаммов Р. pastoris 3-GS115 ^4 1еи2) и 85-3-GS115 (Apho85::LEU2). При анализе денситограмм не было обнаружено существенных изменений в спектре термостабильных белков у штаммов Apho85, как в случае штаммов Б. сеп^ше (рис. 5), однако происходило увеличение содержания белков с молекулярной массой 33, 16,4 и 14 кДа и уменьшение содержания белков с молекулярной массой 91, 65, 45, 33 и 21 кДа по сравнению с исходным 3-GS115. Полученные результаты позволяют предположить, что протеинкиназа РЬъо85 у дрожжей Р. pastoris влияет на состав белков цитоскелета, хотя ее отсутствие и не приводит к столь сильным изменениям в составе термостабильных белков, как у Б. сerevisiae.
Заключение
Основным отличием метилотрофных дрожжей Р. pastoris и Б. cerevisiae является способ утилизации углерода. Б. cerevisiae являются факультативными анаэробами, а P.pastoris принадлежат к облигатно аэробным организмам. Дрожжи Р. pastoris являются признанным объектом биотехнологии, но генетически охарактеризованы значительно хуже, чем сахаромицеты. Близкое родство этих видов дрожжей и возможность использования генов дрожжей-сахаромицетов для введения дизрупций в гомологичные гены Р. pastoris позволяют проводить сравнительное изучение генетического контроля метаболических процессов.
Анализ фенотипа делеционных мутантов pho85 Р. pastoris, проведенный в данной работе, выявил как сходства, так и отличия в фенотипическом проявлении мутаций в этом гене у разных видов дрожжей. Оказалось, что мутанты р^85 обоих видов дрожжей синтезируют КФ конститутивно, но, в отличие от сахаромицетов, у дрожжей P.pastoris на фоне мутаций в гене РН085 не происходит накопления Ts-мутаций. Характерным плейотропным эффектом мутации р^85 у сахаромицетов является быстрая потеря мтДНК в митотическом потомстве и появление дыхательно-некомпетентных клонов. У Р. pastoris мы этого не наблюдали, т. е. отсутствие РЬо85 не влияет на функцию митохондрий у аэробных дрожжей. Таким образом, по-видимому, несмотря на эволюционное родство дрожжей Б. cerevisiae и Р. pastoris, генетический контроль функционирования митохондрий в зависимости от дефицита фосфата у них различен и определяется особенностями метаболизма.
Гликоген — основной запасной полисахарид дрожжевой клетки, накопление которого зависит как от стадии роста, так и от состава среды. Протеинкиназа РЬо85 принимает участие в регуляции активности гликогенсинтазы, обеспечивая накопление гликогена и у дрожжей Б. сerevгsiae, и у Р. pastoris.
У дрожжей Б. сerevisiae скорость роста клеток определяется источником азота: пролин и мочевина относятся к так называемым «бедным» источникам азота, а аммоний является примером «богатого» источника азота [13]. РЬо85р и белок-активатор РЬо4
участвуют в регуляции генов катаболизма пролина у сахаромицетов [3]. Мутанты pho85 S. cerevisiae не способны расти на средах с пролином. Оказалось, что способность штаммов pho85 P. pastoris расти на среде с пролином зависит от источника углерода в среде.
Полученные результаты указывают на существующие отличия в механизме регуляции катаболизма пролина и метаболизма углерода дрожжей P. pastoris и S. cerevisiae.
Влияние делеции pho85p на состав белков цитоскелета, выявленное у дрожжей S. cerevisiae, значительно менее выражено у дрожжей P. pastoris.
Таким образом, сравнительное изучение фенотипических проявлений мутаций в гене PHO85 у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris показало, что функции консервативных белков клетки в значительной степени могут определяться особенностями метаболизма.
Литература
1. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н., Федорова И. В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л., 1984. 68 с.
2. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., 2002. 248 с.
3. Попова Ю. Г., Падкина М. В., Самбук Е. В. Влияние мутаций в генах PHO85 и PHO4 на утилизацию пролина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 2000. Т. 36, №12. C. 1622-1628.
4. Самбук Е. В., Попова Ю. Г., Физикова А. Ю., Падкина М. В. Генетический анализ плей-отропных эффектов мутаций pho85 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 2003. T. 39, №8. C. 1039-1045.
5. Самбук Е. В., Физикова А. Ю., Захарова К. В., Смирнов А. М., Падкина М. В. Отсутствие циклин-зависимой фосфопротеинкиназы Pho85p приводит к нарушению распределения митохондриальных нуклеоидов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Цитология. 2005. Т. 47, №10. C. 917-924.
6. Самсонова М. Г., Падкина М. В., Краснопевцева Н. Г. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae. V. Генетический контроль регуляции синтеза кислой фосфатазы II // Генетика. 1975. Т. 11, №9. С. 104-115.
7. Урбах В. Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. М., 1963. 324 с.
8. Физикова А. Ю., Падкина М. В., Самбук Е. В. Отсутствие циклин-зависимой протеин-киназы Pho85 влияет на стабильность митохондриальной ДНК у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 2009. Т. 45, №6. C. 745-752.
9. Carroll A. S., O’Shea E. K. Pho85 and signaling environmental conditions // Trends Biochem. Sci. 2002. Vol. 27, N 2. P. 87-93.
10. Chester V. E., Byrne M. J. Selective media for the detection of revertants in cultures of glycogen-deficient mutants // J. Bacteriol. 1969. Vol. 97, N 3. P. 1504.
11. Chi Y., Huddleston M. J., Zhang X., Young R. A., Annan R. S., Carr S. A., Deshaies R. J. Negative regulation of Gcn4 and Msn2 transcription factors by Scb10 cyclin-dependent kinase // Genes Dev. 2001. Vol. 15. P. 1078-1092.
12. Drees B., Brown С., Barrel B. G., Bretscher A. Tropomyosin Is Essential in Yeast, Yet the TPM1 and TPM2 Products Perform Distinct functions // J. Cell Biol. 1995. Vol. 128, N 3. P. 383-392.
13. Hofman-Bang J. Nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae // Mol Biotech-nol. 1999. Vol. 12, N1. P. 35-73.
14. Huang D., Farkas I., Roach P. J. Pho85p, a cyclin-dependent protein kinase, and Snf1p protein kinase act antagonistically to control glycogen accumulation in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell Biol. 1996. Vol. 16. P. 4357-4365.
15. Huang D., Friesen H., Andrews B. Pho85, a multifunctional cyclin-dependent protein kinase in budding yeast // Molecular Microbiology. 2007. Vol. 66, N 2. P. 303-314.
16. Huang D., Moffat J., Andrews B. Dissection of a complex phenotype by functional genomics reveals roles for the yeast cyclin-dependent protein kinase Pho85 in stress adaptation and cell integrity ll Mol. Cell Biol. 2002. Vol. 22, N14. P. 5076-5088.
17. Lee J., Colwill K., Aneliunas V., Tennyson C., Moore L., Ho Y., Andrews B. Interaction of yeast Rvs167p and Pho85 cyclin-dependent kinase complexes may link the cell-cycle to the actin cytoskeleton ll Curr. Biol. 1998. Vol. 8, N24. P. 1310-1321.
18. Magbanua J. P. V., Ogawa N., Harashima S., Oshima Y. The Transcriptional Activators of the PHO Regulon,Pho4p and Pho2p, Interact Directly with Each Other and with Components of the Basal Transcription Machinery in Saccharomyces cerevisiae ll J. Biochem. 1997. Vol. 121. P. 1182-1189.
19. Measday V., McBride H., Moffat J., Stillman D., Andrews B. Interactions between Pho85 cyclin-dependent kinase complexes and the Swe5 transcription factor in budding yeast ll Mol. Microbiol. 2000. Vol. 35, N4. P. 825-834.
20. Measday V., Moore L., Retnakaran R., Lee J., Donoviel M., Neiman A. M., Andrews B. A Family of Cyclin-Like Proteins That Interact with the Pho85 Cyclin-Depedent Kinase ll Mol. Cel. Biol. 1997. P. 1212-1223.
21. Meimoun A., Holtzman T., Weissman Z., McBride H. J., Stillman D. J., Fink G. R., Kornitzer D. Degradation of the transcription factor Gcn4 requires the kinase Pho85 and the SCF (CDC4) ubiquitin-ligase complex ll Mol. Biol. Cell. 2000. Vol. 11, N3. P. 915-927.
22. Morgan D. O. The dynamycs of cyclin-dependent kinase structure ll Curr. Opin. Cell Biol. 1996. Vol. 8. P. 767-772.
23. Nishizawa M., Kawasumi M., Fujino M., Toh-e A. Phosphorylation of Sic1, a cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor, by Cdk including Pho85 kinase is required for its prompt degradation ll Mol Biol Cell. 1998. Vol. 9. P. 2393-2405.
24. Ogawa N., DeRisi J., Brown P. O. New components of a system for phosphate accumulation and polyphosphate metabolism in revealed by genomic expression analysis ll Mol. Biol. Cell 2000. Vol. 11, N12. P. 4309-4321.
25. Payne W. E., Gannon P. M., Kaiser C. A. An inducible acid phosphatase from the yeast Pichia pastoris: characterization of the gene and its product Ц Gene. 1995. Vol. 22, N 163. P. 19-26.
26. Sambrook J. A. Russel D. W. Molecular cloning: A laboratory manual, 3d ed. New York, 2001. 2222 p.
27. Schneider K. R., Smith R. L., O’Shea E. K. Phosphate-regulated inactivation of the kinase PHO8O-PHO85 by the CDK inhibitor PHO81 ll Science. 1994. Vol. 266. P. 122-126.
28. Tennyson C. J., Lee J., Andrews B. A role for the Pcl9-Pho85 cyclin-Cdk complex at the M/Gi boundary in Saccharomyces cerevisiae ll Mol. Microbiol. 1998. Vol. 28. P. 69-79.
Статья поступила в редакцию 31 июля 2009 г.
