CC BY
38
механизмы модификационной изменчивости
УДК 579.258
© в. А. савинов, А. ю. физикова, А. м. румянцев, Е. в. самбук
Санкт-Петербургский государст венный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, лаборатория биохимической генетики
& тонкая регуляция экспрессии генов осуществляется посредством конкуренции транскрипционных факторов за промоторы, что обеспечивает своевременный ответ клетки на изменения условий среды. Ген PHO3 дрожжей S. cerevisiae кодирует конститутивную кислую фосфатазу. в данной работе изучали генетический контроль экспрессии гена PHO3 в зависимости от источника азота. показано, что уровень экспрессии гена снижается на среде с «бедным» источником азота, мочевиной. выявлены возможные механизмы регуляции экспрессии гена PHO3 при участии репрессора генов азотного метаболизма Gzf3p и убиквитин-лигазы Rsp5p.
& ключевые слова: кислые фосфатазы; азотная катаболитная репрессия; GATA-факторы; тиамин; PHO3; Rsp5; Gzf3; Saccharomyces cerevisiae.
изучение механизмов регуляции гена РНО3 в зависимости от источника азота в среде у дрожжей SACCHAROMYCES СЕЯЕУ&1АЕ
Поступила в редакцию 28.09.2011 Принята к публикации 11.11.2011
ВВЕДЕНИЕ
Физиология микроорганизмов, в том числе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, значительно зависит от условий изменчивой окружающей среды. Адаптивный ответ клетки заключается в коррекции метаболических процессов, изменении скорости роста и деления, переходе к споруляции, мицелиаль-ному росту и т. д. Дефицит в среде одного из макроэлементов (углерода, азота или фосфора) в короткий срок приводит к истощению его внутриклеточных резервов и изменяет уровень экспрессии множества генов: некоторые активируются, другие репрессируются.
У дрожжей важную роль в передаче информации об условиях среды играют специфические сигнальные каскады: киназы Torlp и Tor2p передают сигнал о типах источника азота в среде, киназа Snflp — о качестве источников углерода, киназа Pho85p — об уровне неорганического фосфата (Cardenas et al., 1999; Gancedo, 1998; Johnston & Carlson, 1992). Мишенями для сигнальных молекул являются как регуляторные белки, так и гены, кодирующие ключевые ферменты метаболизма. В настоящее время известно, что многие гены ключевых метаболических ферментов могут иметь в промотор-ных областях сайты связывания для активаторов или репрессоров разных метаболических путей и воспринимать сигналы о наличии или отсутствии разных биогенных элементов. Кроме того, одни и те же регуляторы могут быть активаторами одних путей и репрессорами других (Попова и др., 2000; Pina et al., 2003).
У дрожжей изучена экспрессия более 6000 генов в ответ на недостаток в среде отдельных биогенных элементов, таких как азот, углерод или фосфор. Предложены модели интегрального ответа клетки на изменение количества того или иного компонента среды (Самбук, 2005; Bradley et al., 2009; Ogawa et al., 2000; Staschke et al., 2010). Несмотря на широкое применение современных технологий, особенности регуляции отдельных генов в ответ на различные сигналы среды часто изучены недостаточно. Можно предположить, что в дрожжевой клетке существует гораздо более разветвленная сеть регуляторных каскадов, чем известно сейчас. Для поиска новых точек пересечения таких каскадов необходимо использовать удобные генетические модели. В настоящей работе в качестве модели для изучения механизмов координированной регуляции был выбран ген РНО3, кодирующий конститутивную кислую фосфатазу (далее — КФ) дрожжей. У дрожжей-сахаромицетов известны четыре изозима КФ: белки Pho3р, Pho5p, Pho10p и Pho11p (Johnston & Carlson, 1992). Гены PHO10 и РНО11 кодируют минорную фракцию репрессибельных КФ. Ген РНО5 кодирует основную фракцию
Таблица 1
штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе
Штамм Генотип
YM954 МАТа ade2-101 ura3-52 his3-200 leu2-3,112 lys2-801 trp1-901 gal4-542
1,4,5,6-YM954 МАТа ade2-101 ura3-52 his3-200 leu2-3,112 lys2-801 trp1-901 gal4-542 gub1
7-YM954 МАТа ade2-101 ura3-52 his3-200 leu2-3,112 lys2-801 trp1-901 gal4-542 gub7
57-D579 МАТа ade2-101 leu2-3,112 arg6 pho3-1
9r-D580 МАТа ade2-101 ura3-52 his3-200 lys2-801 trp1-901 arg6 gub1
203-D579 МАТа his7-1 arg6 pho3-1
репрессибельных Кф (Bajwa et al., 1984). Гены PHO5 и PHOS произошли в результате дупликации предкового гена. Кодирующие области обоих генов имеют высокий процент идентичности на нуклеотидном (82 %) и аминокислотном (87 %) уровнях. При этом в области промоторов наблюдается низкая степень сходства (Meyhack et al., 1982). Экспрессия гена РНО3 имеет достаточно высокий уровень, но в отличие от гена PHO5 не зависит от изменений концентрации фосфата в среде. Промотор гена РНО3 может быть использован в биотехнологии (Okabayashi et al., 1990), однако в отличие от промотора РНО5 его практически не используют, так как в некоторых случаях конститутивная экспрессия гетероло-гичного гена может быть токсична для клеток дрожжей (Парфенова и др., 2002; Matsuyama et al., 2008). Поиск механизмов регуляции экспрессии гена РНО3 может существенно расширить возможности его применения в биотехнологии.
Ранее было показано, что экспрессия гена РНО3 подавляется при добавлении в среду тиамина (Nosaka et al., 1993). Тиамин (витамин В;) необходим для синтеза тиаминпирофосфата, который является кофактором ферментов цикла трикарбоновых кислот и пентозофос-фатного пути окисления углеводов. Дрожжи способны поглощать тиамин из среды с помощью специфического мембранного белка-транспортера, а также синтезировать его непосредственно в клетках (Singleton, 1997). КФ Pho3p имеет тиамин-связывающую активность при рН 5,0 и является растворимым ферментом периплазмы клеток S. cerevisiae. КФ гидролизует тиаминфосфаты в среде, что позволяет клетке усваивать данный класс фосфорорганических соединений (Nosaka, 1990). В репрессии генов «тиаминового» регулона при повышении концентрации тиамина в среде участвуют NAD + ^ави-симые деацетилазы гистонов (Li et al., 2010).
Данная работа посвящена изучению регуляции экспрессии гена PHOS в ответ на изменения источника азота в среде. В ходе работы показано, что экспрессия гена РНО3 зависит от качества источника азота и снижается на среде с «бедным» источником, мочевиной. Были выявлены возможные механизмы регуляции экспрессии гена PHOS при участии репрессора генов азотного метаболизма Gzf3p и убиквитин-лигазы Rsp5p.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
штаммы дрожжей и бактерий. Генотипы штаммов дрожжей S. cerevisiae, используемых в данной работе, приведены в таблице 1. Штамм YM954 (Vignols et al., 2005) был использован в качестве исходного для трансформации плазмидами, содержащими ген ADE2 под контролем промотора гена PHOS, а также для получения мутантов. Штамм 57-D579, любезно предоставленный научным сотрудником лаборатории биохимической генетики СПбГУ к. б. н. Физиковой А. Ю., был использован для анализа доминантности или рецессивности и выяснения моногенности полученных мутаций. Штамм 9Г-D580, полученный в споровом потомстве диплоида D580 от скрещивания 5-YM954 и 57-D579, использовали в тесте на аллелизм. Штамм 203-D579 был использован для картирования мутаций с помощью гаплоидизации. Для определения типа спаривания использовали штаммы-тестеры МАТа his5 и МАТа his5, любезно предоставленные лабораторией физиологической генетики кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета СПбГУ. Для амплификации плазмид использовали бактериальный штамм Escherichia coli DH-5a (Meselson & Yuan, 1968).
плазмиды. Для изучения влияния источников азота на экспрессию гена PHOS использовали мультикопий-ную плазмиду pTL1 [PHOSp-ADE2 LEU2], содержащую промоторную область гена PHOS от — 17 до —370 н., считая от кодона ATG (Останин и др., 1988). Плазмида pFL36 [CEA LEU2] (Vector NTI, Invitrogen Corporation) была использована для конструирования центромерной плазмиды, несущей ген ADE2 под контролем промотора РНОS. Для клонирования использовали библиотеку генов YSC4613 дрожжей S. cerevisiae, созданную на основе вектора pGP564 \2ц LEU2] (Yeast Genomic Tiling Collection, Open biosystems), предоставленную лабораторией физиологической генетики кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета СПбГУ.
среды и условия культивирования. Среды MD, YPD, LB, ПЕП имеют стандартные составы (Захаров и др., 1984; Guthrie & Fink, 1991). В отличие от среды ПЕП ПЕПФО содержит 1 г KH2PO4 на литр среды. Минимальная среда без азота (MD—N) содержит в 1 л
те же компоненты, что и MD, за исключением сульфата аммония. В качестве источника азота использовали сульфат аммония, мочевину и аминокислоты: пролин, глута-мин и глутамат, которые добавляли в среду в конечной концентрации 0,46 % (Magasanik & Kaiser, 2002). Среда MD стандартного состава содержит 0,2 мкг/мл тиамина. Для отбора бактериальных трансформантов по признаку устойчивости к антибиотику в среду LB добавляли ампициллин или канамицин в концентрации 50 мкг/мл.
В работе были использованы стандартные методы работы с ДНК и штаммами бактерий (Маниатис и др., 1984).
Мутагенез. Для получения мутантов S. cerevisiae с восстановлением роста на среде с мочевиной колонии клеток трансформантов YM954 [pTL1] и YM954 [pSF28] облучали УФ (70 мВт/м2) в течение 1 минуты и инкубировали в течение недели в темноте при +30 °С.
Индукция гаплоидизации и отбор клеток Ura-. Для индукции гаплоидизации диплоидные клетки дрожжей, гетерозиготные по маркерным мутациям, высевали на среду с беномилом (30 мкл/мл среды), затем переносили на селективные среды, в том числе на среду с фтороро-товой кислотой (1 г 5-FOA на 1 л среды) для отбора клонов с фенотипом Ura-. Выросшие анеуплоидные ауксо-трофные колонии переносили методом реплик на чашки со средой, содержащей глутамат в качестве источника азота, и анализировали рост колоний (Guthrie & Fink, 1991).
Методы статистической обработки результатов.
Для подсчета количества анеуплоидных клонов в опыте по гаплоидизации использовали стандартные методы вычисления доверительных интервалов. Расчет ошибки и доверительного интервала проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента при вероятности p = 0,95 и числе степеней свободы f = 3 (Гланц, 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение экспрессии гена РНО3 в зависимости от источника азота
Анализ экспрессии генов дрожжей с помощью метода биочипов показал, что уровень экспрессии гена PHO3 зависит от доступности азота в среде (Bradley et al., 2009; Staschke et al., 2010). Для изучения механизмов регуляции гена PHO3 нами был предложен следующий подход. Была использована созданная ранее мультикопийная плазмида pTL1, содержащая репортерный ген ADE2 под контролем промотора гена PHO3 (Останин и др., 1988). Однако ее использование для наших целей может затруднять интерпретацию результатов, так как известно, что количество белков-регуляторов, как правило, невелико в дрожжевых клетках. Поэтому для работы была сконструирована центромерная плазмида pSF28 (рис. 1). Уровень экспрессии репортерного гена ADE2 оценивали по росту трансформантов на среде без аденина.
Штамм YM954 (фенотип Leu-Ade-) (табл. 1) трансформировали плазмидами pTL1 и pSF28 и отбирали трансформанты на среде без лейцина. Суспензии трансформантов в исходной концентрации примерно 1х104 клеток/мл и в 10-кратном разведении (1 х 103 клеток/мл) высевали на твердые минеральные среды без аденина и лейцина и с разными источниками азота: глутамином, сульфатом аммония, глутаматом, пролином и мочевиной. В качестве контроля использовали исходный штамм YM954. Оказалось (рис. 2), что рост всех типов трансформантов замедляется на среде с бедным источником азота, мочевиной, а также с глутаматом, в то время как рост дрожжей на хороших источниках азота (глутамин, аммоний) не отличался от роста штамма YM954.
При росте на среде с пролином (рис. 2), плохим источником азота, трансформанты, содержащие муль-тикопийную плазмиду, и трансформанты, содержащие центромерную плазмиду, демонстрировали нормальный рост, сравнимый с исходным штаммом YM954. Однако колонии трансформантов с центромерной плазмидой pSF28 были окрашены в красный цвет. Это объясняется накоплением в клетках дрожжей красного пигмента, аминоимидазолрибозида, вследствие отсутствия активности АИР-карбоксилазы, продукта гена ADE2, что в случае трансформантов с плазмидой pSF28 обусловлено подавлением экспрессии гена ADE2 с промотора гена PHO3 (Останин и др., 1988). Трансформанты с плазмидой pTL1 не окрашены вследствие большого числа копий гена ADE2 в клетке.
Таким образом, видно, что экспрессия гена PHO3 зависит от типа источника азота. При этом она максимальна на средах с глутамином и сульфатом аммония и минимальна при росте на мочевине (Ure-). Такой ответ гена PHO3 на изменение источника азота кардинально отличается от реакции генов, подверженных азотной катаболитной репрессии. В последнем случае на бедных источниках азота происходит активация соответствующих генов (Magasanik & Kaiser, 2002). Отсутствие роста трансформантов на среде с мочевиной позволило использовать эту среду для селекции мутантов по генам, продукты которых участвуют в регуляции гена PHO3 в зависимости от источника азота.
Получение и анализ мутантов Ure+ у трансформантов YM954[pTL1] и [pSF28]
Мутантов, растущих на среде с мочевиной (фенотип Ure + ), индуцировали при помощи УФ. Отбор мутантов проводили на среде без аденина и лейцина с мочевиной в качестве источника азота. В результате были отобраны пять мутантов Ure + : четыре (1-, 4-, 5-, 6-YM954) — у трансформанта YM954[pTL1] и один (7-YM954) — у YM954[pSF28].
Для изучения собственного фенотипического проявления мутаций, восстанавливающих рост трансформантов на мочевине, мутанты культивировали в полной
Рис. 1. Схема конструирования плазмиды pSF28 [PHO3p-ADE2 CENLEU2]. Apr, Tcr — гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину соответственно; ori — область начала репликации; 2р — сайт инициации репликации 2-микронной плазмиды; ADE2, LEU2 — гены дрожжей S. cerevisiae; PHO3p, PHO5t — промотор и терминатор генов Кф дрожжей S. cerevisiae; MCS — полилинкерная область; PMB1 — область начала репликации; CEN6 — центромера. Участок плазмиды pTL1, содержащий промотор гена PHO3, кодирующую область гена ADE2 и терминатор гена PHO5, вырезали по сайту рестрикции PstI и встроили в вектор pFL36 по такому же сайту
Рис. 2. Влияние различных источников азота на рост штамма YM954 5. cerevisiae, трансформированного плазмидами
и pSF28. Суспензии клеток, трансформированных плазмидой \PHO3p-ADE2 2р LEU2] или pSF28 \PHO3p-ADE2 CENLEU2], в концентрации 1 х 104 и 1 х 103 клеток/мл высевали на минеральную среду MD без аденина и лейцина с разными источниками азота (глутамином, сульфатом аммония, глутаматом, пролином, мочевиной) в концентрации 0,46 % и инкубировали при температуре 30 °С в течение 5 дней. В качестве контроля использовали исходный штамм YM954
Рис. 3. Влияние различных источников азота на рост мутантов 1-, 4-, 5-, 7^М954 (А) и трансформантов 5-YM954[GZF3], 7-YM954[GZF3] (Б). А. Суспензии клеток мутантных штаммов 1-, 4-, 5-, 7^М954 в концентрации 1х104 клеток/мл высевали на минеральную среду с разными источниками азота (глутамином, сульфатом аммония, глутаматом, мочевиной) в концентрации 0,46 % и инкубировали при температуре 30 °С в течение 5 дней. В качестве контроля использовали исходный штамм YM954. Б. Суспензии клеток штаммов 5^М954 и 7^М954, трансформированных плазмидой № 783 [GZF3 2р ЬЛШ] из библиотеки генов YSC4613 5. cerevisiae, в концентрации 1х104 клеток/мл высевали на минеральную среду без лейцина с сульфатом аммония и глутаматом в качестве источника азота в концентрации 0,46 % и инкубировали при температуре 30 °С в течение 5 дней
среде, затем рассевали на чашки и отбирали клоны, потерявшие плазмиды (Leu-). Анализ роста таких клонов показал, что все мутанты не растут на средах с глутаматом и мочевиной в качестве источника азота (Glu-). При этом рост мутантов на средах с глутамином и сульфатом аммония не отличается от роста исходного штамма YM954 (рис. 3А). Полученные мутации мы условно обозначили gubl, 4, 5, 6, 7 (glutamate utilization blockage) соответственно отобранным мутантам. Фенотип мутантов свидетельствует о нарушении регуляции генов метаболизма азота.
Для выяснения доминантности или рецессивности мутаций штаммы 1-, 4-, 5-, 6-, 7-YM954 скрестили со штаммом 57-D579 (Glu+) и анализировали рост дипло-идов на среде с глутаматом. Диплоиды росли, что свидетельствует о рецессивности мутаций gubl, 4, 5, 6, 7.
Сегрегант 9r-D580 (Glu-), полученный от скрещивания штаммов 5-YM954 и 57-D579 и несущий мутацию gub5, использовали для проведения теста на аллелизм с
мутациями gubl, 4, 5, 6, 7. В результате мутанты распределились на две группы комплементации. В первую группу, обозначенную gubl, попали мутанты 1, 4, 5, 6-YM954; во вторую группу — только мутант 7-YM954. Эту группу обозначили gub7.
Для выяснения моногенности наследования признака Glu- проводили тетрадный анализ гибрида D580 (5-YM954 x 57-D579). В связи с тем, что гибриды с му-тантными штаммами 1-, 4-, 5-, 6-YM954 демонстрировали низкий уровень споруляции, были проанализированы только 19 тетрад, из которых 10 оказались полными. Было выявлено расщепление в тетрадах по признаку Glu-/Glu+ в соотношении 2 : 2. Следовательно, аллель-ные мутации gubl, 4, 5, 6 наследуются моногенно.
Таким образом, с использованием промотора гена PHO3 в качестве мишени и гена ADE2 в качестве ре-портерного гена нам удалось получить мутации в регуля-торных генах, которые участвуют как в регуляции генов метаболизма азота, так и в регуляции РНО3 на средах с бедными источниками азота.
Анализ последовательности промотора гена PHO3
Регуляция генов метаболизма азота у дрожжей 5. cerevisiae осуществляется в результате совместной работы четырех транскрипционных факторов GATA-се-мейства: активаторов Gln3p и Gat1p (Nil1p), репрессо-ров Dal80p и Gzf3p (Nil2p, Deh1p) (Magasanik & Kaiser, 2002). Эти белки специфически распознают последовательности GATA в промоторах генов-мишеней. Активность регуляторных белков напрямую зависит от типа источника азота в среде и от внутриклеточного количества глутамина, необходимого метаболита для запуска азотной катаболитной репрессии.
Особенности роста трансформантов YM954[pTL1], YM954[pSF28] и мутантов 1-, 4-, 5-, 6-, 7-YM954 на минеральных средах с разными источниками азота позволили предположить, что обнаруженные мутации могли возникнуть в одном или нескольких генах, кодирующих GATA-факторы.
Известно, что активатор Gln3p распознает сайты GAT(A/T)A(G), которые могут располагаться в обеих цепях ДНК и в разной ориентации (Coffman et al., 1995; Cooper et al., 1990; Scherens et al., 2006; Stanbrough et al., 1995), а также сайты GAT(A/T) (G/A). Кроме того, известны вспомогательные сайты активации TTG(G/T)T. Активатор Gat1p связывается с сайтами (A)GATAA(G), CTTATCG. Репрессор Dal80p — с (T/C)GATAA(G). Реп-рессор Gzf3p распознает последовательности C(T/C) GATAAG, GATAAG, (A/T)GATAA(G/C) (Saccharomyces Genome Database, URL: http://www.yeastgenome.org).
Используя базу данных «Saccharomyces Genome Database» (URL: http://www.yeastgenome.org), мы проанализировали последовательность промотора гена PHO3 от —370 до —17 нуклеотида, использованную при конструировании плазмид pTL1 и pSF28. Анализ после-
MEXAHmMbi мoдиФикAЦиoннoй ^MEH4mOcm
75
довательности выявил сайты в обеих цепях ДНК, с которыми, предположительно, могли бы связываться GATA-факторы: по одному сайту GATAA, GATTA, GATTG и по два сайта GATA, GATT. При поиске GATA-сайтов в обратной ориентации в обеих цепях ДНК были обнаружены дополнительные последовательности GATAA (1 сайт), GATTA (2 сайта), GATA (1 сайт) и GATT (2 сайта). Tаким образом, в промоторе гена PHO3 содержатся последовательности, с которыми теоретически возможно связывание GATA-факторов транскрипции дрожжей S. cerevisiae, а сам ген PHOS может быть мишенью для регуляторов азотного метаболизма.
Поиск генов, комплементирующих мутации gub1 и gub7
На первом этапе поиска генов, соответствующих группам комплементации gub1 и gub7, проверили, могли ли мутации затронуть гены GLNS, GAT1, DAL80 или GZFS транскрипционных факторов азотной регуляции. Для этого трансформировали штаммы 5-YM954 и 7-YM954 плазмидами №№ 414, 470, 783, 924 из библиотеки генов «Yeast Genomic Tiling Collection» дрожжей S. cerevisiae, содержащими фрагменты генома с каждым из вышеперечисленных генов. Tрансформанты отбирали на селективных средах и анализировали восстановление фенотипа Glu+ на минеральной среде с глутаматом в качестве единственного источника азота. Было показано, что восстановление роста на глутамате происходит только у трансформанта 7-YM954 с плазмидой № 783 (ген GZFS) (Рис. 3Б). Возможно, это является следствием увеличения количества белка-репрессора из-за мультикопийности вектора pGP564. Известно, что фактор Gzf3p обладает наибольшей активностью при росте дрожжей в среде с глутаматом, когда подавлен главный конкурент, активатор Gat1p (Deed et al., 2011).
Кроме гена GZFS, в плазмиде № 783 расположены гены MDV1 и CCT7. Первый кодирует белок внешней мембраны митохондрий, необходимый для их деления. Второй — субъединицу комплекса шаперонинов, необходимую для сборки актина и тубулина. Эти белки не являются факторами транскрипции и не связаны с регуляцией азотного метаболизма (Saccharomyces Genome Database, URL: http://www.yeastgenome.org).
Tаким образом, мутация gub7, приводящая к дерепрес-сии промотора гена PHOS у трансформантов при росте на среде с мочевиной в качестве единственного источника азота и к отсутствию роста дрожжей на среде с глутаматом, по всей видимости, возникла в гене GZFS, кодирующем белок-репрессор из семейства GATA-факторов.
Поиск гена,
комплементирующего мутацию GuB1
Мутанты из комплементационной группы gub1 не растут на среде с глутаматом, и это нарушение роста не компенсируется введением в клетки дополнительных ко-
пий генов транскрипционных факторов азотного метаболизма. С целью локализации мутации gubl в геноме дрожжей использовали метод гаплоидизации, который позволяет локализовать мутацию в хромосоме.
Штамм YM954 дрожжей S. cerevisiae, как и мутанты 1, 4, 5, 6-YM954, несет ряд мутаций, которые являются удобными селективными маркерами, расположенными в разных хромосомах. Мутации ade2 и his3 расположены в хромосоме XV, ura3 — в хромосоме V, leu2 — в хромосоме III, lys2 — в хромосоме II, trpl — в хромосоме IV. Чтобы проанализировать расположение мутации gubl в хромосомах дрожжей, мы провели скрещивание штаммов 1-, 4-, 5-, 6-YM954 (Glu-) со штаммом 203-D579 (Glu+). У диплоидов, гетерозиготных по мутациям gubl, индуцировали гаплоидизацию с помощью беномила, и высевали их на селективные среды, чтобы отобрать аук-сотрофные клоны, потерявшие какую-либо одну хромосому или весь гаплоидный набор хромосом. Анеупло-идные колонии отпечатывали на среду с глутаматом в качестве источника азота и анализировали частоту появления у анеуплоидов признака Glu- на фоне ауксотроф-ностей. Высокая частота совместного появления клонов Ura-Glu- (0,904±0,067; p = 0,95, f = 3, tSt = 3,182) свидетельствует о том, что мутация gubl локализована в одной хромосоме с мутацией ura3 (в хромосоме V). Напротив, частота появления клонов Ade-Glu- ничтожно мала: из 124 отобранных клонов Ade- ни один не оказался Glu-, что указывает на отсутствие сцепления gub1 и маркера ADE2 (в хромосоме XV).
В дальнейшем мутант 5-YM954 трансформировали плазмидами генной библиотеки «Yeast Genomic Tiling Collection», покрывающими всю последовательность хромосомы V дрожжей S. cerevisiae. Были использованы 59 плазмид библиотеки: №№ 385, 387-391, 393-398, 401-412, 415, 418-420, 422-438, 440-446, 449, 452457. Трансформанты отбирали на селективной среде без лейцина и анализировали восстановление фенотипа Glu+ на минеральной среде с глутаматом в качестве единственного источника азота. Было показано, что восстановление роста на среде с глутаматом у штамма 5-YM954 происходило при трансформации плазмидой № 434. Эта плазмида содержит фрагмент хромосомы V с генами: YCK3, DSE1, RSP5, NSA2, LCP5, YER128W, PAK1.
Ген YCK3 кодирует мембранную киназу, участвующую в регуляции слияния вакуолей. Ген DSE1 кодирует белок, специфичный для дочерних клеток, делеция которого приводит к нарушениям цитокинеза после деления. Ген NSA2 кодирует белок, участвующий в созревании молекул 27S пре-рРНК. Ген LCP5 кодирует белок, необходимый для созревания 18S рРНК. Рамка считывания YER128W кодирует белок неизвестной функции. Ген PAK1, представленный на плазмиде без 3'-области, кодирует серин-треониновую киназу, участвующую в регуляции метаболизма углерода (Saccharomyces Genome Database, URL: http://www.yeastgenome.org).
Ген RSP5 кодирует убиквитин-лигазу Е3, участвующую в большом количестве внутриклеточных процессов: от модификации гистонов до убиквитин-опосредованного эндоцитоза и деградации белков. В этом ряду генов RSP5 представляет для нас особый интерес, поскольку известно, что фактор Rsp5p вовлечен в передачу сигнала о типе источника азота транскрипционному GATA-фактору Gln3p (Tate et al., 2006). Rsp5p регулирует уровень мембранных пермеаз аммония и аминокислот в зависимости от типа источника азота в среде. Лишние белки убикви-тинируются и удаляются из мембраны эндоцитозом. Известно, что убиквитин-лигазный комплекс Rsp5/Bul1/ Bul2 участвует в активации белка Gln3p при его ядерной локализации (Crespo et al.,2004). Поэтому из всех перечисленных генов плазмиды № 434 наиболее вероятным местом локализации мутации gub1 является ген RSP5, кодирующий убиквитин-лигазу дрожжей S. cerevisiae. Окончательным доказательством этого утверждения будут переклонирование гена-кандидата RSP5 в отдельный вектор и трансформация мутантных штаммов, что будет выполнено в ходе дальнейшей работы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование модели, состоящей из репортерного гена ADE2 под контролем промотора гена PHO3, позволило показать, что экспрессия гена конститутивной КФ регулируется в зависимости от типа источника азота в среде. Характер этой регуляции не соответствует регуляции генов азотного метаболизма, подверженных азотной катаболитной репрессии. В отличие от этих генов экспрессия PHO3 усиливается при росте клеток на среде с хорошим источником азота (глутамин, сульфат аммония) и подавляется при росте на среде с мочевиной. Ранее было показано, что наличие в среде антибиотика рапамицина, моделирующего у дрожжей состояние азотного голодания за счет активации главного транскрипционного активатора генов азотного метаболизма Gln3p, приводит к значительному снижению уровня транскрипции гена PHO3. Следовательно, Gln3p может выступать в роли репрессора РНО3. У штаммов с делецией гена GLN3 уровень репрессии снижается более чем втрое (Staschke et al., 2010), но механизм такой репрессии до сих пор не изучен.
В нашей работе показано, что мутации, приводящие к дерепрессии гена РНО3 на среде с мочевиной в качестве источника азота, по всей видимости, затрагивают два гена, GZF3 и RSP5, кодирующие транскрипционный репрессор и убиквитин-лигазу соответственно. На основании наших данных могут быть предложены следующие модели регуляции гена РНО3 азотом. (1) На среде с мочевиной и глюкозой фактор Gzf3p связывается с про-моторной областью гена РНО3 и блокирует его транскрипцию, координируя уровень экспрессии этого гена с потребностями клетки. Таким образом, не только Gln3р
(Staschke et al., 2010), но и Gzf3p участвуют в репрессии гена РНО3. Особенно интересно, что для генов азотного метаболизма фактор Gln3p — это активатор транскрипции, тогда как фактор Gzf3p — репрессор, а для гена РНО3 оба фактора выступают в роли репрессоров. (2) Rsp5р участвует в убиквитинировании РНК-полиме-разы II и, таким образом, может опосредованно влиять на уровень базальной транскрипции РНО3 (Harreman et al., 2009). (3) Мутации rsp5 могут приводить к нарушению транспорта аминокислот в клетку и влиять на активность фактора Gln3p (Tate et al., 2006) и, следовательно, Gzf3p. (4) По всей видимости, убиквитин-лигаза Rsp5р способна напрямую влиять на активность белка Gzf3p, который, в свою очередь, может воздействовать на промотор гена РНО3, поскольку в настоящее время показано, что Gzf3p имеет сайты убиквитинирования (Peng et al., 2003), а между генами GZF3 и RSP5 установлена косвенная регуляторная связь (Costanzo et al., 2010).
Таким образом, нам удалось показать, что экспрессия гена РНО3 зависит от качества источника азота и выявить участников регуляторного каскада, координирующих метаболизм азота и фосфата у дрожжей-сахаромицетов.
Данная работа поддержана грантом «Молекулярно-генетические механизмы адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям» (Ермилова Е. В., шифр: 1.38.65.2011) на проведение фундаментальных исследований по приоритетным направлениям Программы развития СПбГУ.
литература
1. Гланц С., 1999. Медико-биологическая статистика. М.: Практика. 460 с.
2. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н., Федорова И. В., 1984. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. 144 с.
3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж, 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 480 с.
4. Останин К. В., Смирнова Т. М., Мясников А. Н. и др., 1988. Векторы экспрессии на основе промоторов генов PHO3 и PHO5 дрожжей Saccharomyces cerevisiae: конструирование, сравнительная оценка эффективности, использование для суперпродукции фосфорибозиламиноимидазолкарбоксилазы // Биополимеры и клетка. № 4. С. 259—266.
5. Парфенова Л. В., Смирнов М. Н., Самбук Е. В., Падкина М. В., 2002. Продукция p-интерферона человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae ведет к снижению активности цитохром-С-оксидазы // Биотехнология. № 6. С. 23—30.
6. Попова Ю. Г., Падкина М. В., Самбук Е. В., 2000. Влияние мутаций в генах РНО85 и РНО4 на утилиза-
цию пролина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. Т. 36. № 12. С. 1622-1628.
7. Самбук Е. В., 2005. Генетические механизмы реализации закона лимитирующего фактора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Жур. общ. биол. Т. 66. № 4. С. 310-325.
8. Bajwa W., Meyhack B, Rudolph H. et al., 1984. Structural of two tandemly repeated acid phosphatase genes in yeast // Nucleic Acids Res. Vol. 12. № 20. P 7721-7739.
9. Bradley P. H., Brauer M. J., Rabinowitz J. D., Troyan-skaya O. G, 2009. Coordinated concentration changes of transcripts and metabolites in Saccharomyces cerevisiae // PLoS Comput Biol. Vol. 5. № 1. P 1-15.
10. Cardenas M. E, Cutler N. S, Lorenz M. C. et al., 1999. The TOR signaling cascade regulates gene expression in response to nutrients // Genes Dev. Vol. 13. № 24. P. 3271-3279.
11. Coffman J. A., Rai R, Cooper T. G. et al., 1995. Genetic evidence for Gln3p-independent, nitrogen catabolite repression-sensitive gene expression in Saccharomyces cerevisiae // J. of Bacteriol. Vol. 177. № 23. P. 69106918.
12. Cooper T. G, Ferguson D., Rai R. et al., 1990. The GLN3 gene product is required for transcriptional activation of allantoin system gene expression in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacteriol. Vol. 172, № 2. P. 1014-1018.
13. Costanzo M, Baryshnikova A., Bellay J. et al., 2010. The genetic landscape of a cell // Science. V 327. № 5964. P. 425-431.
14. Crespo J. L., Helliwell S. B., Wiederkehr C. et al., 2004. NPR1 kinase and RSP5-BUL1/2 ubiquitin ligase control GLN3-dependent transcription in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. Vol. 279. № 36. Р. 3751237517.
15.Deed N. K., van Vuuren H. J. J., Gardner R. C., 2011. Effects of nitrogen catabolite repression and di-ammonium phosphate addition during wine fermentation by a commercial strain of S. Cerevisiae // Appl. Microbiol. Biotechnol. № 89. P. 1537-1549.
16. Gancedo J. M., 1998. Yeast carbon catabolite repression // Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol. 62. № 2. P 334-361.
17. Guthrie C., Fink G. R., 1991. Guide to yeast genetics and molecular biology. Academic Press. Vol. 194. 933 p.
18.Harreman M., TaschnerM., Sigurdsson S. et al., 2009. Distinct ubiquitin ligases act sequentially for RNA polymerase II polyubiquitylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 06. № 49. P. 20705-20710.
19. Johnston M., Carlson M., 1992. Regulation of carbon and phosphate utilization // Mol. Cell. Biol. оf the Y. Sacch.: Gene Expression. Vol. 2. P. 193-255.
20.LiM., PetteysB. J., McClure J. M. et al., 2010. Thiamine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae is regulated by the NAD+-dependent histone deacetylase Hst1 // Mol. and Cell. Biol. Vol. 30. № 13. P. 3329-3341.
21.Magasanik B., Kaiser C. A., 2002. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae // Gene. № 290. P 1-18.
22. Matsuyama A., Shirai A., Yoshida M., 2008. A series of promoters for constitutive expression of heterologous genes in fission yeast // Yeast. Vol. 25. № 5. P 371-376.
23. Meselson M, Yuan Y, 1968. DNA restriction enzyme from E. coli // Nature. Vol. 217. P. 1110-1114.
24.Meyhack B, Bajwa W., Rudolph H. et al., 1982. Two yeast acid phosphatase structural genes are the result of a tandem duplication and show different degrees of homology in their promoter and coding sequences // EMBO J. Vol. 1, № 6. P. 675-680.
25. Nosaka K., 1990. High affinity of acid phosphatase encoded by PHO3 gene in Saccharomyces cerevisiae for thiamin phosphates // Biochim. Biophys. Acta. № 1037. P. 147-154.
26. Nosaka K., Kaneko Y, Nishimura H. et al., 1993. Isolation and characterization of a thiamin pyrophosphoki-nase gene, THI80, from Saccharomyces cerevisiae // J. of Biol. Chem. Vol. 268. № 23. P. 17440-17447.
27. Ogawa N., DeRisi J., Brown P. O., 2000. New components of system for phosphate accumulation and polyphosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae revealed by genomic expression analysis // Mol. Biol. Cell. Vol. 11. № 12. P. 4309-4321.
28. Okabayashi K., Oi H., Hirabayashi K. et al., 1990. Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin. Green Cross. EP0399455.
29. Peng J., Schwartz D., Elias J.E. et al., 2003. A pro-teomic approach to understanding protein ubiquitina-tion // Nat. Biotechnol. Vol. 21. № 8. P. 921-926.
30. Pina B., Fernandez-Larrea J., Garcia-Reyro N. et al., 2003. The different (sur)faces of Rap1p // Mol. Gen. Genomics. № 268. P. 791-798.
31. Saccharomyces Genome Database, URL: http://www. yeastgenome.org
32. Scherens B., Feller A., Vierendeels F. et al., 2006. Identification of direct and indirect targets of the Gln3 and Gat1 activators by transcriptional profiling in response to nitrogen availability in the short and long term // FEMS Yeast Res. № 6. P. 777-791.
33. Singleton C. K, 1997. Identification and characterization of the thiamine transporter gene of Saccharomyces cerevisiae // Gene. № 199. P. 111-121.
34. Stanbrough M., Rowen D. W., Magasanik B., 1995. Role of the GATA factors Gln3p and Nil1p of Saccharomyces cerevisiae in the expression of nitrogen-regulated genes // Biochem. Vol. 92. P. 9450-9454.
35. Staschke K. A., Dey S., Zaborske J. M. et al., 2010. Integration of general amino acid control and target of ra-pamycin (TOR) regulatory pathways in nitrogen assimilation in yeast // The J. of Biol. Chem. Vol. 285. № 22. P. 16893-16911.
36. Tate J. J., Rai R, Cooper T. G., 2006. Ammonia-specific regulation of Gln3 localization in Saccharomyces cerevisiae by protein kinase Nrp1 // J. Biol. Chem. Vol. 281. № 38. P. 28460-28469.
37. Vignols F., Brehelin C., Surdin-Kerjan Y. et al., 2005. A yeast two-hybrid knockout strain to explore thioredox-in-interacting proteins in vivo // PNAS. Vol. 102. № 46. P. 16729-16734.
RESEARCHING THE MECHANISMS OF GENE РНО3 REGULATION DEPENDING ON NITROGEN SOURCE IN MEDIUM IN YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Savinov V. A., Fizikova A. Y., Rumyantsev A. M., Sambuk E. V.
Ф SUMMARY: Delicate regulation of gene expression is performed through transcriptional factors' competition for promoters that provides punctual cell response to environmental changes. Gene PHO3 of yeast S. cerevisiae encodes the constitutive acid phosphatase. In this work we researched genetic control of the gene PHO3 expression in response to nitrogen source in medium. PHO3 expression level was proved to decrease while yeast using poor nitrogen source like urea. Possible regulatory mechanisms for gene PHO3 were revealed involving repressor of nitrogen regulated genes Gzf3p and ubiquitin ligase Rsp5p
Ф KEY WORDS: acid phosphatases; nitrogen catabolite repression; GATA factors; thiamine; Saccharomyces cerevisiae.
Ф Информация об авторах
Савинов Владимир Александрович — м. н. с. Кафедра генетики и селекции. Биолого-почвенный факультет. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
физикова Анастасия Юрьевна — кандидат биологических наук, младший научный сотрудник. Кафедра генетики и селекции. Биолого-почвенный факультет. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
Румянцев Андрей Михайлович — лаборант. Кафедра генетики и селекции. Биолого-почвенный факультет. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
Savinov Vladimir Alexandrovich — junior research fellow. Department of genetics and breeding. Faculty of biological and soil sciences. St. Petersburg State University. 7-9, Universitetskaya nab., St.Petersburg, 199034, Russia. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
Fizikova Anastasia Iurievna — PhD, junior research fellow. Department of genetics and breeding. Faculty of biological and soil sciences. St. Petersburg State University. 7-9, Universitetskaya nab., St.Petersburg, 199034, Russia. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
Rumyantsev Andrey Mihaylovich — laboratory assistant. Department of genetics and breeding. Faculty of biological and soil sciences. St. Petersburg State University. 7-9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russia. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
Самбук Елена Викторовна — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник. Кафедра генетики и селекции. Биолого-почвенный факультет. Санкт-Петербургский государственный университет. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
Sambuk Elena Viktorovna — ScD, assistant professor , senior research fellow. Department of genetics and breeding. Faculty of biological and soil sciences. St. Petersburg State University. 7-9, Universitetskaya nab., St.Petersburg, 199034, Russia. E-mail: vova.savinoff@gmail.com.
