CC BY
18ФАРМАКОГНОЗИЯ И БОТАНИКА
А.А. Погоцкая1, Г.Н. Бузук1, H.A. Алексеев2
ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТАЮЩИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ НА ИЗВЛЕЧЕНИЕ АЛКАЛОИДОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ МАКЛЕЙИ
1Витебский государственный медицинский университет
УП «Минскинтеркапс», г. Минск
Впервые предложен новый универсальный экстрагент — уксусная кислота
- для извлечения алкалоидов из лекарственного растительного сырья. Изучено влияние возрастающих концентраций уксусной кислоты и времени нагревания на извлечение алкалоидов. Для сравнения изучено влияние различных концентраций этанола, а также традиционного экстрагента (хлороформ + аммиак). Установлено, что оптимальным экстрагентом для извлечения алкалоидов из листьев маклейи является 80 — 100 % вод-
ныи раствор уксусной кислоты с последующим нагреванием в течение 1 часа.
ВВЕДЕНИЕ
В медицинской практике с целью профилактики и лечения различных заболеваний широко используются противовоспалительные, антимикробные и регенерирующие лекарственные средства растительного происхождения. К лекарственным растениям, обладающим данным спектром действия, относятся различные виды маклейи - Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde, Macleaya cordata (Willd.) R.Br. (сем. Маковые - Papaveraceae), в траве которой содержатся изохинолиновые алкалоиды (около 1,2%), причем среди них основными являются сангвинарин и хелеритрин (на их долю приходится до 80-90% от суммы алкалоидов). В очень небольших количествах содержатся протопин, аллокриптопин, берберин, коптизин, дигидро-сангвинарин, дигидрохелеритрин, криптопин, коризамин, хелирубин, хелилутин, макарпин, дегидрохейлантифолин. Обнаружены также флавоноиды и органические кислоты [1-4].
Берберин
Коптизин
Протопин
Аллокрипгопин
OCH,
Хелеритрин
Рис. 1. Строение основных алкалоидов маклейи
Основная фармакологическая активность сырья маклейи обусловлена главными алкалоидами растения - сангвинарином и хелеритрином, которые являются главными действующими веществами выпускаемого в России препарата сангвиритрина
[5, 6].
Сангвиритрин представляет собой смесь бисульфатов двух близких по структуре и свойствам четвертичных бен-зо[с]фенантридиновых алкалоидов сангви-нарина и хелеритрина. Сангвиритрин обладает широким спектром антимикробной активности, ингибируя развитие грампо-ложительных и грамотрицательных бактерий, дрожжеподобных и мицелиальных грибов, патогенных простейших. Препарат активен в отношении антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов. В терапевтических дозах сангвиритрин действует бактериостатически [7-10]. В основе механизма антимикробного действия сангвиритрина лежит подавление бактериальной нуклеазы, нарушение процессов проницаемости клеточных стенок, перегородок деления [11].
В настоящее время официнальными лекарственными формами сангвиритрина являются 0,2% водно-спиртовой раствор, 1% линимент и таблетки по 0,005 г для получения 0,1-0,001% водных растворов, губка коллагеновая с сангвиритрином сан-гвикол, применяемая в качестве раневого покрытия для лечения инфицированных и ожоговых ран, язв различной этиологии [6].
В Республике Беларусь препарат сангвиритрин и лекарственные средства, его содержащие, не зарегистрированы и не производятся.
В качестве нового лекарственного сырья с высоким антимикробным действием, которое может производиться в Республике Беларусь, нами предложены листья маклейи (ГФ РБ, 2008, т. 2. - Маклейи листья. - С.373-374.). Это связано с более высоким содержанием в них сангвиритрина (суммы сангвинарина и хелеритрина) по сравнению с травой маклейи, поскольку климатические условия Беларуси менее благоприятны для синтеза и накопления действующих веществ в этом расте-
нии по сравнению с условиями юга России.
За основу количественного определения суммы сангвинарина и хелеритрина был взят традиционный способ выделения алкалоидов из растительного сырья, основанный на их экстракции хлороформом при щелочном значении pH [ФС-42-2666-89] с последующей очисткой полученного извлечения от сопутствующих и балластных веществ путем перевода алкалоидов в водный раствор уксусной кислоты. Количественное определение - измеряли оптическую плотность в видимой части спектра в изобестической точке при X = 452 пт [13-15].
Вместе с тем, нерешенной до конца проблемой при определении алкалоидов маклейи является вопрос выбора оптимального экстрагента. Проведенные в этом направлении исследования [16] показали, что оптимальным экстрагентом является щелочная смесь этанола с хлороформом, предложенная нами ранее в качестве универсального экстрагента для алкалоидов различного строения [17]. Однако попытка нагревания для повышения извлечения алкалоидов из растительного сырья, вместо ожидаемого увеличения, привела к снижению их выхода. Последнее объяснимо высокой реакционной способностью четвертичных бензофенатридиновых алкалоидов, которые при щелочных значениях pH подвергаются диспропорцианированию с образованием соответствующих дигидро- и оксо-производных, димеризации, взаимодействию со спиртами с образованием ал-коксипроизводных [18, 19], особенно на развитой поверхности, каковыми является тонкий слой сорбента или измельченное растительное сырье. Все эти соединения имеют отличные от исходных алкалоидов хроматографические и спектральные характеристики, их образование никоим образом не контролируется, что, в конечном итоге, может искажать и занижать истинное содержание алкалоидов в сырье.
В связи с этим актуальной является разработка более совершенного способа извлечения алкалоидов из растительного сырья, лишенного указанных выше недостатков.
В качестве нового универсального экстрагента для извлечения алкалоидов из растительного сырья нами предложены водные растворы уксусной кислоты в высоких концентрациях, которая известна как хороший растворитель алкалоидов при неводном титровании.
Целью настоящей работы является подбор оптимальных условий извлечения и количественного определения основных алкалоидов травы и листьев маклейи с помощью водных растворов уксусной кислоты в высоких концентрациях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получениеуксуснокислого экстракта
Навеску 0,25 г (точная навеска) измельченного и просеянного сквозь сито (500) листа маклейи помещали в пенициллиновые флаконы, добавляли по 5 мл водных растворов уксусной кислоты различной концентрации, встряхивали и оставляли при комнатной температуре на 15 ч, а затем выдерживали в термостатируемой водяной бане при температуре 95 °С в течение 1 ч. Полученные экстракты охлаждали в течение 10-15 мин и центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин.
Получение этанольного экстракта
Навеску 0,25 г (точная навеска) измельченного и просеянного сквозь сито (500) листа маклейи помещали в пеницил-
линовые флаконы, добавляли по 5 мл спирта этилового различной концентрации, встряхивали и оставляли при комнатной температуре на 15 ч, а затем выдерживали в термостатируемой водяной бане при температуре 70°С в течение 1 ч. Полученные экстракты охлаждали в течение 10-
15 мин и центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин.
Количественное определение алкалоидов
По 0,005 мл полученных экстрактов использовали для ВЭЖХ. Разделение выполняли на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-4», использовали колонку Диасорб-110-С16-Т («БиоХим-Мак», Россия).
В качестве подвижной фазы использовали 0,02 М водный раствор КН2Р04 -ацетонитрил в соотношении (65-60): (3540) по объему с добавлением 10"3 моль/л додецилсульфата натрия (pH 3,0-3,5). Детектирование осуществляли при X = 288 пт [20].
РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ
Первоначально нами было изучено влияние возрастающих концентраций уксусной кислоты, вплоть до ледяной, на извлечение алкалоидов из листьев маклейи. Полученные данные представлены графически на рисунке 2.
Алкалоиды,
мг/г.
%, концентрация уксусной кислоты Сангвинарин—■— Хелеритрин—А— Сумма
Рис. 2. Влияние концентрации уксусной кислоты на извлечение алкалоидов
из листьев маклейи
Как можно видеть из представленных данных, количество сангвинарина и хеле-ририна, которое извлекается из сырья маклейи сердцевидной, увеличивается при повышении концентрации уксусной кислоты и достигает максимума при концентрации 90-100%.
Как можно видеть из данных, представленных на рис. 3, нагревание в течение 1 часа повышает извлечение алкалоидов из листьев маклейи на 50-60%.
Таким образом, оптимальным экстрагентом для экстракции алкалоидов из листьев маклейи является 80-100% водный
раствор уксусной кислоты с последующим нагреванием в течение 1 часа.
Дальнейшее увеличение продолжительности нагревания на извлечении алкалоидов не сказывается, что свидетельствует о достаточной стабильности алкалоидов маклейи в этих условиях экстракции.
Для сравнения нами было изучено влияние других экстрагентов на практический выход алкалоидов - этанола различных концентраций, а также традиционного экстрагента (хлороформ + аммиак).
Полученные данные представлены на рисунках 4 и 5.
Алкалоиды, 30
0 0,5 1 1,5 2
Время нагревания, час
Сангвинарин ■ Хелеритрин—±— Сумма
Рис. 3. Влияние нагревания на извлечение алкалоидов из листьев маклейи
ледяной уксусной кислотой
концентрация этанола, %
'- Сангвинарин—■—Хелеритрин —А— Сумма
Рис. 4. Влияние различных концентраций этанола на извлечение алкалоидов
из листьев маклейи
Как видно из данных, представленных на рисунке 4, извлечение алкалоидов из листьев маклейи возрастает с увеличением концентрации этанола и достигает максимума при наибольшей из исследованных концентраций (96%). Однако по экстрагирующей способности этанол значительно (почти в 1,8 раза) уступает уксусной кислоте. Хлороформ, как это можно видеть на рис. 5, занимает промежуточное положение, но, как и в случае с этанолом, значительно уступает по экстрагирующей способности уксусной кислоте.
Что касается причины высокой эффективности 80-100% растворов уксусной кислоты в качестве экстрагента алкалоидов по сравнению с традиционным хлороформом, то она может быть следствием двух явлений. С одной стороны, более высокой стабильностью алкалоидов сангвинарина и хелеритрина в среде уксусной кислоты. Об этом, в частности, свидетельствует неизменность извлечения алкалоидов при продолжении нагревания (рис. 4).
25
Уксусная кислота (95% ) Этанол (96% ) Хлороформ + Аммиак
Рис. 5. Сравнительная эффективность уксусной кислоты, хлороформа и этанола
Увеличение выхода алкалоидов при нагревании может быть связано с высвобождением названных алкалоидов из связанных форм. Об этом, в частности, свидетельствуют результаты работы [21], в которой изучалась структура глубоко окрашенных пигментов из маклейи мелкоплодной. Эти вещества были нерастворимы в воде, хлороформе, этилацетате, растворимы в диметилсульфоксиде, фторуксусной и уксусной кислотах, при обработке 5-10% раствором серной кислоты давали смесь бисульфатов сангвиритрина и хелеритрина и пигмента, предположительно фенольной природы.
Применительно к нашему случаю, увеличение экстракции этих алкалоидов при нагревании, вероятнее всего, является следствием высвобождения сангвиритрина и хелеритрина из связанных форм при действии уксусной кислоты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Установлена высокая эффективность 80 - 100 % растворов уксусной кислоты по сравнению с традиционным экстрагентом -хлороформом при щелочном значении pH и спиртом этиловым различной концентрации, в связи с чем предложен новый экстрагент для извлечения алкалоидов - уксусная кислота.
SUMMARY A.A. Pohotskaya, G.N. Buzuk, N.A. Alekseev THE INFLUENCE OF THE INCREASING CONCENTRATION OF THE ACETIC ACID ON EXTRACTION OF ALKALOIDS FROM LEAVES OF MACLEAYA For the first time new universal extragent - an acetic acid - for extraction of alkaloids from medicinal vegetative raw materials is offered. Influence of increasing concentration of an acetic acid and time of warming for extraction of alkaloids are studied. For comparison influence of various concentration of ethanol, and also traditional extragent (Chlorofor-mium + ammonia) is studied. It is positioned, that optimum extragent for extraction of alkaloids from leaves ofMacleaya is 80 - 100 % an aqueous solution of an acetic acid with the subsequent warming within 1 hour.
ЛИТЕРАТУРА
1. Grabarczyk, H. Chromatografia alkaloidow trzecio i czwartorzedowych wystepujacych w czesciach nadziemnych Bocconia microcarpa Maxim / H. Grabarczyk, H. Gertig // Ann. pharm. - 1970. - Vol. 8. - P. 75 - 81.
2. Kirjakov, H.G. Isolation and characterization of three minor alkaloids of Bocconia (Mac-leya) cordata Willd / H.G. Kirjakov // Folia med. - 1972. - N 2, Vol. 14. - P. 75 - 78.
3. Kiryakov, N.G. On alkaloids of Bocconia cordata Will / N.G. Kirjakov, M.S. Kitova.,
A.V. Georgieva // Докл. Болг. АН. - 1967. -N 2, Т. 20. - С. 189 - 192.
4. Slavik, J., Alkaloide der Mohngewache (Papaveraceae).XXV111. Uber die Alkaloide aus Macleaya cordata (Willd.)R.Br. / J. Slavik, L. Slavikova, J. Appelt // Collect. czech. chem. commun. - 1965. - N 3, Vol. 30. - P. 887 -891.
5. Вичканова, C.A. Экспериментальноклинические данные по препарату сангвиритрин антимикробного действия / С.А. Вичканова, Р.Г. Мартынова, Т.В. Фатеева // Новые лекарственные препараты. - 1984. -N 9. - С. 2 - 7.
6. Вичканова, С.А. Клиническое исследование антимикробного растительного препарата сангвиритрин / С.А. Вичканова // Фармация. - 2003. - № 2. - С. 31 - 34.
7. Эффективность применения и перспектива разработок лекарственных препаратов на основе Сангвиритрина / В.А. Быков [и др.] // III Рос. Нац. Конгр. “Человек и лекарство”: тезисы докладов. - Москва, 1996. - С. 12.
8. Вичканова, С.А. Изыскание новых химиотерапевтических средств из высших растений / С.А. Вичканова // Herba pol. -1970. - T. 16, № 3. - C. 301 - 308.
9. Вичканова, С.А. Перспективы поисков новых химиотерапевтических препаратов из высших растений // Материалы Всесоюз. научн. конф. по фармакол. и клин. изучению лекарственных препаратов из растений.
- Москва, 1972. - С. 194 - 203.
10. Вичканова, С.А. Ингибиторы микроорганизмов среди природных веществ растительного происхождения: автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.07 / С.А. Вичканова. -Мос.гос.ун-т им. Ломоносова. - М., 1981. -48 с.
11. Электронно-микроскопическое изучение действия сангвиритрина на микроорганизмы в опытах in vitro / А.С. Быков [и др.] // Антибиотики. - 1983. - № 6. - С. 421 - 424.
12. Бортникова, В.В. Сравнительная токсикологическая характеристика и новые фармакологические свойства антимикробных и противовирусных препаратов растительного происхождения: автореф. дис. канд. биол. наук / В.В. Бортникова. - Купавна, 1988. -
16 с.
13. Спектрофотометрический метод количественного определения сангвиритрина в готовом продукте и лекарственных формах / И.Е. Копылова [и др.] // Хим. - фарм. журнал. - 1978. - № 9. - С. 131 - 132.
14. Маслова, Г.А. Количественное определение сангвинарина и хелеритрина в Bocconia cordata / Г.А. Маслова // ХПС. -1974. - N 2. - С. 261 - 262.
15. Шемерянкина, В.И. Определение сангвиритрина в линименте / В.И. Шемерянкина, М.И.Шейченко // Хим. - фарм. журнал. -1989. - № 9. - С. 1134 - 1135.
16. Влияние экстрагента на практический выход бензо[с]фенантридиновых алкалоидов из листьев Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde и Bocconia Frutescens L. / E. A. Абизов [и др.] // Хим. - фарм. журнал. - 2003. - Т. 37, № 7. - С. 15 - 17.
17. Метод проявления алкалоидов различных структурных типов в тонком слое сорбента / М.Я. Ловкова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. - 1983. - Т. 19, N 4. - С. 560 - 563.
18. О диспропорционировании алкалоида сангвиритрина на силикагеле / A.A. Савина [и др.] // Хим. - фарм. журнал. - 1999. - №
4. - С. 25 - 28.
19. Толкачев, О.Н. Зависимость антимикробной активности от структуры и реакционной способности некоторых природных четвертичных гетероароматических соединений и их аналогов / О.Н. Толкачев, С.А. Вичканова // Фармация. - 1987. - № 1. - С. 38 - 40.
20. Хроматографическое определение бен-зофенантридиновых алкалоидов в траве Chelidonium majus /Н.А. Алексеев [и др.] // Студенческая медицинская наука XXI века: Тезисы докладов II Международной научно-практической конференции. Витебск, 31 окт. - 1 нояб. 2002 г. / ВГМУ; редкол. А.П. Солодков и др. - Витебск. 2002. - С.279 -281.
21. Толкачев, О.Н. К структуре глубоко окрашенных пигментов из маклейи мелкоплодной / О.Н. Толкачев, А.А. Савина // Труды ВИЛР: Химия, технология, медицина. - М., 2000. - С. 98 - 104.
Поступила 04.04.2009 г.
