CC BY
9Вестник фармации №3 (49) 2010 А.А. Погоцкая, Г.Н. Бузук
ИЗМЕНЧИВОСТЬ АЛКАЛОИДНОГО СОСТАВА ЛИСТЬЕВ МАКЛЕЙИ СЕРДЦЕВИДНОЙ (МЛСЬЕЛУЛ СОЯПЛТЛ) В ПРОЦЕССЕ УСКОРЕННОГО СТАРЕНИЯ
Витебский государственный медицинский университет
Использован метод «ускоренного старения» применительно к растительному сырью с различной первоначальной влажностью для оценки стабильности лекарственного сырья при его хранении. Установлено, что на качественный состав сырья маклейи в процессе ускоренных испытаний влияют содержание влаги в сырье и способ укупорки образцов. С помощью хроматографического метода обнаружен не-идентифицированный алкалоид, установлена зависимость его содержания от вышеуказанных факторов. Вместе с тем, содержание основных алкалоидов мак-лейи сердцевидной - сангвинарина и хе-леритрина - существенным образом не изменяется.
Выявлено, что в герметично укупоренных образцах происходит изменение цвета, причем с повышением содержания влаги в исходном сырье явления изменения окраски носят более выраженный характер.
Ключевые слова: маклейя, алкалоиды, метод ускоренного старения.
ВВЕДЕНИЕ
Лекарственное растительное сырье должно соответствовать всем показателям, предусмотренным в фармакопейной статье в течение определенного для каждого вида сырья срока годности. Между тем, с временем в сырье может происходить ряд изменений, влияющих на его внешний вид и содержание биологически активных веществ. При хранении на лекарственное растительное сырье влияют различные факторы: внешние - гигиенические (влажность, температура, свет) и природноклиматические (время года, зональность);
внутренние - физико-химические и биологические процессы, протекающие в лекарственном растительном сырье.
В настоящее время вопросам изучения устойчивости и повышения стабильности лекарственного растительного сырья (ЛРС) уделяется большое внимание. Как правило, для установления срока годности, условий возможного хранения и применения ЛРС требуется его изучение по всем показателям в течение длительного промежутка времени (как правило, срок годности ЛРС - 2-5 лет). Метод «ускоренного старения» заключается в выдерживании испытуемых образцов при температуре, превышающей его температуру хранения. При этом, подвергая исследуемые объекты воздействию высоких температур в течение некоторого промежутка времени, можно получить достоверную информацию об естественных изменениях, которые могут происходить в них на протяжении нескольких лет хранения в стандартных условиях, так как температурный фактор, являющийся активатором процесса старения, наиболее полно освещается в литературе. Однако имеющиеся данные посвящены в основном изучению стабильности лекарственных средств и продуктов питания [1-5] и практически не освещают данную проблему относительно растительного сырья.
Целью настоящей работы является исследование изменчивости алкалоидного состава и цветовых характеристик сырья маклейи сердцевидной при ускоренном старении.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучение изменений алкалоидного состава было проведено при хранении измельченного (500) лекарственного сырья маклейи сердцевидной при повышенной температуре (60°С) в сравнении с исходным растительным материалом, хранившимся при комнатной температуре. Известно, что показатели стабильности лекарственных средств определяются их составом, технологией изготовления, а также спецификой упаковочно-укупорочного материала [6].
В термостат (температура 60°C) помещали серии порошка листьев маклейи, отличающиеся содержанием влаги (6%, 12%, 20%), которую задавали, прибавляя рассчитанное количество воды к исходному сырью, высушенному до влажности 4-5%. Первую серию образцов выдерживали в термостате в открытых пенициллиновых флаконах, вторая серия была укупорена герметично (резиновые пробки под обкатку алюминиевыми колпачками). Отобранные пробы после тер-мостатирования исследовали по разработанной ранее методике [7].
Качественный состав и количественное содержание алкалоидов устанавливали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя внешний стандарт -раствор сангвиритрина известной концентрации [9].
Для определения цветовых характеристик сырья порошок листьев маклейи помещали в пластиковые чашки Петри диаметром 3 см, разравнивали и слегка уплотняли постукиванием по дну чашки, а затем сканировали на планшетном сканере EPSON Perfection 1270 (RGB, 24 bit, 400 dpi) при открытой крышке. Полученные изображения обрабатывали с помощью компьютерной программы Imagej 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij), используя в качестве основной подпрограмму RGB Measure (http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/rgb-measure.html).
Данная подпрограмма выделяет R, G и B в RGB координатах и рассчитывает средние значения интенсивности пикселов в изображении по каждому каналу. Градации интенсивности при этом варьируют от
1 до 256 по одному каналу (R, G или B).
Далее полученные цифровые данные по средней интенсивности пикселов в изображении раздельно по R, G и B каналам для различных образцов сырья, подвергнутых различным видам воздействия, объединяли в одну общую матрицу. Затем, используя в качестве переменных средние значения для R, G и B каналов в изображении, с одной стороны, и содержание различных алкалоидов в образцах ЛРС, с другой, рассчитывали уравнения регрессии для всех комбинаций значений каналов и содержания алкалоидов, используя для ап-
проксимации зависимостей полином 2-ой степени, позволяющий аппроксимировать как линейные, так и нелинейные зависимости, соответственно. Об адекватности полученных уравнений регрессии судили по величине и достоверности коэффициента детерминации (р < 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Первоначально исследованию подверглись пробы, хранившиеся в течение 14 дней с пошаговым интервалом в 3 дня. Однако исследования показали, что значительные изменения в сырье происходят при выдерживании в термостате в течение первых 6 дней, поэтому дальнейшее исследование было направлено на изучение происходящих явлений в исследуемых образцах в течение одной недели с пошаговым интервалом в 1 день.
Полученные данные представлены в таблицах 1-2 (в виде денситограмм) и в таблицах 3-5. Использование внешнего стандарта сангвиритрина позволяет идентифицировать сангвинарин и хелеритрин, которые являются основными алкалоидами маклейи сердцевидной. Алкалоид 1 обнаруживается на старте во всех пробах. Во всех пробах открытой и закрытой серий также обнаруживается неидентифициро-ванный алкалоид, обозначенный на соответствующих денситограммах как алкалоид 2. Однако в закрытой серии содержание алкалоида 2, оцененное по высоте и площади его пика на денситограммах, почти в
2 раза ниже, чем в контроле, и его содержание остается практически неизменным на протяжении 7 суток. Данное вещество имеет окраску, по которой обнаруживается на хроматограмме в видимом свете, а также характерную флуоресценцию в УФ -свете. При обработке хроматограмм модифицированным реактивом Драгендорфа данные пятна приобретают характерную окраску, что подтверждает алкалоидную природу неидентифицированного вещества. В контрольных образцах, хранившихся при комнатной температуре в течение 7 суток в обеих сериях (открытой и плотно укупоренной), обнаруживаются 4 основных алкалоида - на линии старта (алкалоид 1), неидентифицированный алкалоид 2, хелеритрин и сангвинарин (таблица 1).
Таблица 1 - Денситограммы извлечений листьев маклейи сердцевидной, выдержанных в термостате (открытая и закрытая серии) при исходном содержании влаги в сырье 6 %
УСЛОВИЯ СТАРЕНИЯ
влага 6 %)
Время выдерживания
Открытая серия
Закрытая серия
Контроль
4 суток
5 суток
6 суток
7 суток
Примечание: здесь и далее 1 - неидентифицированный алкалоид на старте; 2 - неидентифициро-ванный алкалоид 2; СЬеі - хелеритрин; Sg - сангвинарин
При содержании влаги 12 % алкалоид 2 практически не обнаруживается в образцах закрытой серии.
При увеличении содержания исходной влаги в листьях маклейи сердцевидной до 20% наблюдается аналогичный результат. На хроматограмме в закрытых пробах практически отсутствует алкалоид 2, в то
время как в открытых пробах данное соединение обнаруживается даже в видимом свете по его окраске. В контрольных образцах, хранившихся при комнатной температуре, как в открытой, так и в закрытой сериях, присутствует данное вещество и обнаруживается соответствующий пик (таблица 2).
Таблица 2 - Денситограммы извлечений листьев маклейи сердцевидной, выдержанных в термостате (открытая и закрытая серии) при исходном содержании влаги в сырье 20 %
УСЛОВИЯ СТАРЕНИЯ
Время выдерживания
Открытая серия
Закрытая серия
Контроль
4 суток
5 суток
6 суток
7 суток
Таким образом, в ходе исследования по ускоренному старению маклейи сердцевидной установлено, что на качественный и количественный состав сырья влияет способ укупорки (герметизация), а также содержание исходной влаги. При этом указанные факторы практически не
оказывают влияния на содержание основных алкалоидов маклейи - сангвинарина и хелеритрина, обусловливающих ее антимикробный эффект [10-12], однако существенным образом изменяют содержание второстепенных (неосновных) алкалоидов (таблицы 3 - 5).
Таблица 3 - Содержание алкалоидов (мг/г) в листьях маклейи сердцевидной, выдержанных в
Время, сутки Открытая серия Закрытая серия
Алк 1 Алк 2 СИеі Sg Алк 1 Алк 2 СИеі Sg
0 2,94±0,02 1,15±0,04 5,74±0,02 6,32±0,03 3,04±0,13 1,40±0,04 5,97±0,03 6,40±0,02
4 3,07±0,08 1,32±0,01 5,77±0,01 6,48±0,02 3,18±0,09 0,34±0,02 5,98±0,10 6,52±0,05
5 3,09±0,05 1,09±0,06 5,53±0,02 6,16±0,02 2,98±0,15 0,56±0,02 5,53±0,02 6,32±0,06
6 2,57±0,11 1,16±0,02 5,46±0,02 6,15±0,17 2,96±0,07 0,29±0,03 5,21±0,05 6,29±0,05
7 3,75±0,32 0,98±0,06 5,27±0,28 5,96±0,03 2,57±0,04 0,23±0,02 4,79±0,04 6,01±0,01
Таблица 4 - Содержание алкалоидов (мг/г) в листьях маклейи сердцевидной, выдержанных в термостате (открытая и закрытая серии) при исходном содержании влаги в сырье 12 %
Время, сутки Открытая серия Закрытая серия
Алк 1 Алк 2 СЬеі Sg Алк 1 Алк 2 СЬеі Sg
0 4,26±0,02 0,94±0,02 5,99±0,02 6,11±0,03 3,64±0,02 - 5,88±0,01 5,94±0,003
4 3,83±0,04 0,96±0,02 5,97±0,01 5,76±0,01 4,54±0,03 - 5,54±0,01 5,76±0,002
5 4,71±0,02 0,98±0,03 6,19±0,02 5,83±0,004 5,29±0,03 - 5,83±0,02 5,60±0,01
6 4,63±0,04 1,19±0,04 6,04±0,02 5,71±0,03 6,09±0,03 - 5,83±0,02 5,51±0,001
7 5,99±0,07 0,70±0,03 5,42±0,05 5,25±0,02 6,37±0,03 - 5,40±0,02 5,34±0,01
Таблица 5 - Содержание алкалоидов (мг/г) в листьях маклейи сердцевидной, выдержанных в термостате (открытая и закрытая серии) при исходном содержании влаги в сырье 20%
Время, сутки Открытая серия Закрытая серия
Алк 1 Алк 2 СЬеі Sg Алк 1 Алк 2 СЬеі Sg
0 3,22±0,04 1,14±0,02 6,20±0,04 6,29±0,02 3,36±0,05 0,88±0,01 5,90±0,01 6,25±0,02
4 2,68±0,06 1,12±0,04 6,21±0,04 6,35±0,05 3,40±0,03 0,46±0,06 5,91±0,03 5,96±0,05
5 3,02±0,03 1,30±0,01 6,36±0,02 6,41±0,02 3,67±0,01 0,13±0,06 5,75±0,03 6,12±0,05
6 3,00±0,002 1,34±0,08 6,22±0,01 6,40±0,01 4,04±0,07 0,26±0,02 5,76±0,03 5,99±0,01
7 3,66±0,2 1,19±0,03 6,03±0,02 5,95±0,01 5,02±0,2 0,53±0,04 5,99±0,004 5,79±0,03
При ускоренном старении наблюдаются изменения в цвете сырья. При этом с увеличением содержания изначальной влаги в сырье с 6 % до 20 % наблюдаются значительные изменения в цвете сырья закрытой и открытой серии проб, которые можно обнаружить визуально. Так, в закрытых образцах происходит изменение окраски с первоначальной естественной зеленой на коричневую, причем при 6 % влаги эти изменения незначительны, а при
повышении содержания влаги до 20 % изменения цвета носят выраженный характер и сырье приобретает контрастную коричневую окраску. Более точно определить изменения в цвете сырья позволяет проведение цветометрического исследования [14]. Полученные значения интенсивности по каждому каналу для закрытой и открытой серии листьев маклейи с различным содержанием влаги представлены на рисунках 1-6.
т
и
I
ш
I-
I
5
160
140
120
100
80
60
40
20
0
в
6
— А- - В
сутки
Рисунок 1 - Зависимости изменения интенсивности цвета в порошке листьев маклейи открытой серии (исходное содержание влаги 6 %)
4
8
160
0 Н--------------1------------1------------1-------------1
0 2 4 6 8
♦ * -и--С -А--В сУтки
Рисунок 2 - Зависимости изменения интенсивности цвета в порошке листьев маклейи закрытой серии (исходное содержание влаги 6 %)
♦ ^ —А--В сутки
Рисунок 3 - Зависимости изменения интенсивности цвета в порошке листьев маклейи открытой серии (исходное содержание влаги 12 %)
* —
-в — А- - В
сутки
Рисунок 4 - Зависимости изменения интенсивности цвета в порошке листьев маклейи закрытой серии (исходное содержание влаги 12 %)
сутки
^ -в — А-
Рисунок 5 - Зависимости изменения интенсивности цвета в порошке листьев маклейи открытой серии (исходное содержание влаги 20 %)
К —
в — А- - В
сутки
Рисунок 6 - Зависимости изменения интенсивности цвета в порошке листьев маклейи закрытой серии (исходное содержание влаги 20 %)
В
Как видно из представленных на рисунках 1-6 данных, в ходе ускоренного старения листьев маклейи на фоне различных уровней исходной влажности, а также условий (открытая и закрытая серии) наблюдаются определенные изменения в средних значениях ЯОБ - каналов. В наибольшей степени эти изменения характерны для Я и О каналов и менее значительные - для Б-канала. Какой либо закономерности в характере изменений интен-
сивности ЯОБ - каналов от исходной влажности сырья не прослеживается. Для количественной оценки возможных связей изменения цветовых параметров ЛРС и содержанием в них алкалоидов был проведен регрессионный анализ. При этом в качестве независимых переменных использовались средние значения интенсивности каналов. Полученные данные представлены в таблице 6 раздельно по вариантам исходного содержания влаги в сырье.
Таблица 6 - Параметры уравнений регрессии зависимостей содержания алкалоидов и цветовых параметров листьев маклейи в ходе ускоренного старения (открытый и закрытый
Влажность,% Алкалоид Канал a2 a1 3c D pval
Открытая серия
6 Chel R -G,GG616 1,68717 -1G9,832 G,95 G,G5
2G Алк 2 G G,GG2787 -G,61722 34,92414 G,95 G,G5
2G Sg R -G,GGG86 G,2G7275 -6,G2289 G,99 G,G1
2G Sg B -G,12163 3,675G38 -21,3735 G,99 G,G1
Закрытая серия
6 Алк 1 R -G,G178 4,815645 -322,6G7 G,99 G,G1
6 Алк 2 B G,GG4G12 G,G36411 -G,86342 G,96 G,G4
6 Sg R -G,G1277 3,464254 -228,444 G,97 G,G3
12 Алк 2 R G,GGG297 -G,G6593 3,5G9G66 G,99 G,G1
12 Алк 2 G G,GGG141 -G,G2474 1,G25969 1,GG G,GG
12 Алк 2 B G,GGG222 -G,GG879 G,G75588 1,GG G,GG
Примечание: коэффициенты детерминации (Б) и их значимость (руа1), коэффициенты уравнений регрессии (ао, а1, а2) при аппроксимации зависимостей полиномом 2-ой степени (У = а2Х2 + а^ + ао).
Достоверная связь цветовых характеристик сырья и содержания алкалоидов имеет место в ограниченном числе случаев (представлены в таблице 6) и в большей степени характерна для неосновных алкалоидов растения.
Таким образом, в процессе ускоренного старения сырья с разным содержанием влаги наблюдаются различия в скорости и характере протекания процессов, приводящих к изменению его свойств. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе исследования по ускоренному старению маклейи сердцевидной установлено, что на качественный и количественный состав сырья влияет способ укупорки (герметизация), а также содержание исходной влаги, причем указанные факторы практически не оказывают влияния на содержание основных алкалоидов маклейи
- сангвинарина и хелеритрина, обусловливающих ее антимикробный эффект. Необходимо также отметить, что при ускоренном старении наблюдаются визуальные изменения в цвете сырья, что также подтверждается цветометрическими исследованиями. Данные явления необходимо учитывать при хранении сырья маклейи.
SUMMARY A.A. Pohotskaya, G.N. Buzuk THE VARIABILITY OF ALKALOIDS STRUCTURE OF LEAVES MACLEAYA CORDATA IN THE COURSE OF THE ACCELERATED AGEING Attempt to use a method of the accelerated ageing with reference to vegetative raw materials with various initial moisture for an estimation of stability of medicinal raw materials is undertaken at its storage. It is established, that qualitative structure of raw mate-
rials of Macleayae cordata in the course of the accelerated tests is depended from the moisture content in raw materials and from a way of closing of samples. With the help of cromatografic method it is found nonidentified alkaloid and it is established that its maintenance depends on the above-stated factors. At the same time, the maintenance of the main alkaloids of Macleayae cordata sangvi-narin and cheleritrin essentially does not change.
It is revealed, that in tightly corked samples there is a colour change, and with moisture content increase in initial raw materials the phenomea of change of colouring have more expressed character.
Key words: Macleaya cordata, alkaloids, method of the accelerated ageing.
ЛИТЕРАТУРА
1. Выбор условий «ускоренного старения» и методов оценки стабильности инсулина / П. А. Бабич [и др.] // Хим. - фарм. журнал. - 1976. - № 7. - С. 127 - 130.
2. Губайдуллина, А.А. Метод «ускоренного старения» для прогнозирования срока годности стабилизированной формы альфа-интерферона / А. А. Губайдуллина, Е.В. Бобкова, А.И. Мелентьев // Труды БГУ. -2010. - Т.4,вып.2. - С. 1-6.
3. Исследование изменений качества галет методом «ускоренного старения» / Л.М.Аксенова [и др.] // Хранение и переработка с/х сырья. - 2002. - №4. -С.6-8.
4. Шарафеддинова, А.А Окислительные и гидролитические процессы, протекающие в пралиновых конфетах с заменителями какао- продуктов / А.А. Шарафеддинова // Хранение и переработка с/х сырья. - 2000.
- №12. -С.25-28.
5. Школьникова, М.Н. Товароведная характеристика безалкогольных бальзамов, производимых на основе природного сырья Алтая: автореф. дис. ...канд. технических наук: 05.18.15 / М.Н. Школьникова; -Новосибирск, 2006. - 16 с.
6. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре. - МЗ СССР. И-42-2-82. — М.: 1983. - 13 с.
7. Погоцкая, А.А. Влияние возрастающих концентраций уксусной кислоты на извлечение алкалоидов из листьев маклейи / А.А. Погоцкая, Г.Н. Бузук , Н.А. Алексеев // Вестник фармации. - 2009. - Т.44, № 2. -С. 16-22.
8. Маклейи листья / Государственная фармакопея Республики Беларусь. Т. 2: Контроль качества вспомогательных веществ и лекарственного растительного сырья / Центр экспертиз и испытаний в здра-воохр.; под общ. ред. А.А. Шерякова. -Молодечно: Типография «Победа», 2008. -С. 373-374.
9. Применение сканера и компьютерных программ цифровой обработки изображений для количественного определения сорбированных веществ / Ю.Л. Шишкин [и др.] // Журнал аналитической химии. -2004. - Т.59, № 2. - С.119 - 124.
10. Сангвиритрин - новый лекарственный растительный препарат антимикробного действия. / С.А. Вичканова [и др.] // Хим. -фарм. журнал. - 1982. - Т.16, № 12. - С. 1515 - 1520.
11. Вичканова, С.А. Клиническое исследование антимикробного растительного препарата сангвиритрин / С.А. Вичканова // Фармация. - 2003. - № 2. - С.31 - 34.
12. Вичканова, С.А. Изыскание новых химиотерапевтических средств из высших растений / С.А. Вичканова // ИегЬа ро1. -1970. - Т. 16, № 3. - С. 301 - 308.
13. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Т. 1: Общие методы контроля качества лекарственных средств / Центр экспертиз и испытаний в здраво-охр.; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. -Минск: Минск. гос. ПТК полиграфии, 2006. - 1345 с.
14. Джадд, Д. Цвет в науке и технике / Д. Джадд, Г. Вышецки. - М.: Эком., 1997. -339 с.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе,27,
Витебский государственный медицинский университет, кафедра фармакогнозии и ботаники с курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8(0212) 37-09-29.
Погоцкая А.А.
Поступила 06.09.2010 г.
