CC BY
315
Бюллетень Брянского отделения РБО, 2013. № 2(2). С. 113-119.
Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2013.
N 2(2). P. 113-119.
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 615.322
НОВЫЙ ЭКСТРАГЕНТ ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ БАРБАРИСА ОБЫКНОВЕННОГО © А.А. Погоцкая, Г.Н. Бузук, О.Р. Диковицкая
A.A. Pogotskaya, G.N. Buzuk, O.P. Dikovitskaya
A new extragent for the extraction of alkaloids from the medicinal vegetative raw materials of Berberis vulgaris
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра фармакогнозии с курсом ФПК и ПК
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27. Тел.: +(37529)715-67-36, e-mail: pogotska@mail.ru
Аннотация. Предложен новый экстрагент - уксусная кислота - для извлечения алкалоидов из лекарственного растительного сырья барбариса обыкновенного. Изучено влияние возрастающих концентраций уксусной кислоты и времени нагревания на извлечение алкалоидов. Для сравнения изучено влияние различных концентраций этанола, а также традиционного экстрагента (хлороформ + аммиак). Установлено, что оптимальным экстрагентом для извлечения алкалоидов из корней барбариса является 80% водный раствор уксусной кислоты с последующим нагреванием в течение 1 часа.
Ключевые слова: барбарис обыкновенный (Berberis vulgaris), берберин, уксусная кислота, этанол, хлороформ.
Abstract. A new extragent - an acetic acid - for the extraction of alkaloids from the medicinal vegetative raw materials of Berberis vulgaris is offered. Influence of the increasing concentration of acetic acid and time of warming on the extraction of alkaloids is studied. Influence of different concentrations of ethanol as well as traditional extragent (chloroform + ammonia) is studied for comparison. It is established that the optimum extragent for the extraction of alkaloids from the medicinal vegetative raw plant materials of Berberis vulgaris is 80% water solution of an acetic acid with the subsequent 1 hour warming.
Keywords: Berberis vulgaris, berberin, acetic acid, ethanol, chloroform.
Введение
Барбарис обыкновенный (Berberis vulgaris), сем. барбарисовые - Berberidaceae - сильно ветвистый кустарник высотой до 3 м, дающий обильную корневую поросль. Ветки с трехраздельными колючками длиной до 2-х см. Кора на молодых ветках желтоватая, со второго года - серая. В пазухах колючек находятся листья на укороченных побегах. Листья обратно-яйцевидные, тонкие, пильчато-зубчатые, суженные в черешок, на вкус кислые. Цветки в поникающих кистях. Чашелистиков, лепестков и тычинок по шесть. Лепестки желтые, продолговатые, цельные или на верхушке немного выемчатые. В продолговатой цилиндрической, кислой на вкус ягоде 2-3 семени. Цветет в мае-июне. Плоды созревают в сентябре-октябре. Корни барбариса заготавливают в весной (апрель) или осенью (октябрь-ноябрь). Сырье сушат на чердаках или под навесом с хорошей вентиляцией, расстилая тонким слоем (5-7 см) на ткани или бумаге, периодически перемешивая (Перевозченко, 1991).
Все органы барбариса обыкновенного содержат алкалоиды, основным из которых является берберин (содержание в корнях до 1,5%), флавоноиды, дубильные вещества, эфирное масло. В плодах - 3,5-6% органических кислот (яблочная, лимонная, винная и др.), сахара (до 7,7%), пектин (0,4-0,6%), аскорбиновая кислота (20-55%), дубильные вещества, крася-
щие вещества, флавоноиды (катехины, лейкоантоцианы, флавонолы), фенолокислоты. Плоды и листья содержат лютеин и витамин К.
При изучении различных органов барбариса обыкновенного в фазу цветения и созревания плодов были выделены такие алкалоиды, как берберин, оксиакантин, бербамин (Генри, 1956).
В различных органах (семенах, корнях и др.) барбариса обыкновенного найдено 10 алкалоидов. В мякоти зрелых плодов содержится очень мало алкалоидов, главным образом они сосредоточены в семенах. При изучении накопления водорастворимых полисахаридов (ВРПС) в соцветиях, плодах и листьях барбариса установлено, что все образцы ВРПС состоят из семи моно-сахаридных компонентов: D-галактуроновой кислоты, D-галактозы, D-глюкозы, L-арабинозы, D-ксилозы, L-рамнозы и одного неидентифицированного, содержащегося в следовых количествах, моносахарида, хроматографически более подвижного, чем L-рамноза (Мартынов, 1984).
При изучении флавоноидного состава плодов барбариса обыкновенного в качестве основных установлены рутин, изокверцетин, кверцетин, кофейная и хлорогеновая кислоты, а также агликоны - кемпферол, изорамнетин, апигенин, лютеин. При хроматографическом исследовании антоциановых пигментов плодов установлено, что основные из них представлены пятью агликонами: цианидином, пеларгонидином, петуноидином, пеонидином, дель-финидином, связанными с сахарами - глюкозой и рутинозой (цианидин-3-глюкозид, пелар-гонидин-3-глюкозид, петуноидин-3-глюкозид) (Гарбарец, 1982).
Основная фармакологическая активность корней барбариса обусловлена алкалоидами протобербериновой структуры - берберином, берберубином, колумбамином, пальмитином и ятроризином (рис. 1). Имеются данные, что многие эффекты этих алкалоидов связаны с освобождением гистамина. Недавно польские авторы сообщили о том, что магнофлорин вызывает сильное снижение артериального давления (Ivanovska, 2003). Оказывая действие на ЦНС, эти алкалоиды подавляют спонтанную активность, снижают мышечный тонус, продлевают гексобарбиталовый сон (особенно тетрагидроберберин). В то же время некоторые из них ингибируют холинэстеразу, и окислительное декарбоксилирование пирувата и тирозина (Соколов, 1988). В частности, берберин усиливает сокращение скелетной мускулатуры и оказывает антикурарное действие. Алкалоиды барбариса стимулируют выработку билирубина и желчных кислот, повышают секрецию желчи и вызывают сокращения желчного пузыря. Наиболее сильно выраженным действием обладает берберин, затем бербамин, а наиболее продолжительный эффект оказывает оксиакантин. Под влиянием перечисленных алкалоидов повышается тонус и сократительная активность гладкой мускулатуры пищеварительного тракта и матки. На их фоне усиливается влияние ацетилхолина. На давление крови они оказывают слабое и преходящее депрессорное воздействие. В опытах на мышах установлена значительная противоопухолевая и антилейкемическая активность некоторых протобербериновых алкалоидов (берберубин, адилберберубин, талматрубин) (Freile, 2003; Anis, 1999). Описано выраженное антибактериальное действие берберина на Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella, Schigella dysenteriae и др. При этом наблюдается синергизм между берберином, с одной стороны, стрептомицином и суль-фодиазином, с другой (Kupeli, 2002).
он
берберин
пальмитин
Рис. 1. Основные алкалоиды барбариса обыкновенного.
ятроризин
Целью настоящей работы является оптимизация методов оценки качества и стандартизации лекарственного растительного сырья барбариса обыкновенного корней.
Материалы и методы
В качестве материала для исследования использовались корни барбариса обыкновенного, заготовленные от культивируемых растений в сентябре 2012 г. в окрестностях г. Витебск на опытном поле учреждения образования «Витебский государственный медицинский университет». До проведения исследования корни хранились в сухом помещении в плотных бумажных пакетах.
В качестве материала для исследования использовались корни барбариса обыкновенного, заготовленные от культивируемых растений в сентябре 2012 г. в окрестностях г. Витебск на опытном поле учреждения образования «Витебский государственный медицинский университет». До проведения исследования корни хранились в сухом помещении в плотных бумажных пакетах.
В качестве экстрагента использовали 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% разведения уксусной кислоты. Для сравнения параллельно проводилась экстракция растворами спирта этилового различной концентрации - 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96,6%, а также общепринятым способом - экстракцией алкалоидов хлороформом после подщелачивания раствором аммиака.
Получение уксуснокислого экстракта. Навеску 0,5 г (точная навеска) измельченных корней барбариса (0,5 мм) помещали в пенициллиновые флаконы, добавляли по 10 мл водных растворов уксусной кислоты различной концентрации (1-100%), встряхивали, а затем выдерживали на кипящей водяной бане в течение 1 ч. Полученные экстракты охлаждали в течение 10-15 мин.
Получение этанольного экстракта. Навеску 0,5 г (точная навеска) измельченных корней барбариса помещали в пенициллиновые флаконы, добавляли по 10 мл спирта этилового различной концентрации (10-96%), встряхивали помещали в специально изготовленное приспособление, которое позволяет избежать потери летучего растворителя при нагревании, а затем выдерживали на кипящей водяной бане в течение 1 ч. Полученные экстракты охлаждали в течение 10-15 мин.
Контроль потери летучего растворителя проводили путем взвешивания исследуемых экстрактов до и после нагревания.
Основным параметром при выявлении оптимальной концентрации экстракционного реагента нами выбрано количественное содержание суммы алкалоидов в пересчете на берберин (мкг), которое оценивали по площади пиков денситометрическим методом, основанном на использовании бумажных матриц, изготовленных из хроматографической бумаги. В качестве аналитического инструмента для измерения цветометрических характеристик окрашенных соединений, сорбированных на хроматографической бумаге, использовали сканер EPSON Perfection 1270 в функциональном режиме: RGB, 24 бит, 300 dpi. Полученное цифровое изображение далее обрабатывали с помощью компьютерной программы Imagej v. 1.41h (http://rsbweb.nih.gov) (Погоцкая, 2009).
Результаты и обсуждение
Нами изучено влияние возрастающих концентраций уксусной кислоты на полноту извлечения алкалоидов из корней барбариса обыкновенного. На рис. 2-3 представлены данные, позволяющие оценить зависимость практического выхода алкалоидов барбариса (мг/г) от природы экстрагента - уксусной кислоты и этанола.
Как можно видеть из представленных данных, содержание суммы алкалоидов, которое извлекается из сырья барбариса обыкновенного, увеличивается при повышении концентрации уксусной кислоты и достигает максимума при концентрации 80%.
АЛ Г/Г у -0,2141х2 < 3,8052х і 8,9909 1
1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %,уксусная кислота
Рис. 2. Влияние различных концентраций уксусной кислоты (% об/об) на извлечение алкалоидов из корней барбариса обыкновенного.
Отмечено, что содержание алкалоидов, которое извлекается из корней барбариса обыкновенного, постепенно увеличивается при повышении концентрации спирта этилового и достигает максимума при 60% (рис. 3), а затем в диапазоне концентраций 70-96% значительно снижается (практически в 2 раза). Что касается сравнительного анализа экстрагирующей способности кислоты уксусной и спирта этилового, то даже в оптимальной концентрации (60%) этанол примерно на 50% менее эффективен, чем 80% уксусная кислота, выступающая в качестве экстрагента.
плг/г
10 20 30 40 50 60 70 80 96 %, спирт этиловый
Рис. 3. Влияние различных концентраций спирта этилового (% об/об) на извлечение алкалоидов из корней барбариса обыкновенного.
Из данных рис. 4 видно, что по экстрагирующей способности уксусная кислота в оптимальной концентрации (80 %) превосходит спирт этиловый в 1,7 раза, и хлороформ после подщела-чивания - в 2 раза. Вместе с тем экстракция алкалоидов барбариса обыкновенного общепринятым способом - хлороформом в щелочной среде является наименее эффективной.
Рис. 4. Сравнительная эффективность уксусной кислоты (80 %), хлороформа и этанола(60 %) при экстракции алкалоидов из корней барбариса.
Нами изучено влияние времени нагревания на практический выход алкалоидов. Для этого были получены экстракты с использованием в качестве экстрагента 80 % уксусной кислоты. Полученные экстракты выдерживали на кипящей водяной бане в течение различного времени (максимально - два часа). Затем экстракты охлаждали в течение 10-15 мин. и наносили по 10 мкл калиброванным капилляром для денситометрического определения. Проявление проводили реактивом Драгендорфа-Мунье (рис. 5), сканировали, полученное изображение обрабатывали с помощью компьютерной программы Imagej V. 1.41Ь и оценивали содержание алкалоидов по площади пиков (пикс) (рис. 6).
А Б
Рис. 5. А - цифровое изображение продуктов взаимодействия алкалоидов корней барбариса с реактивом Драгендорфа-Мунье после нагревания в течение различного времени;
В - изображение А, разделенное на каналы в координатах RGB.
Рис. 6. Денситограмма (после обработки изображения В с помощью компьютерной программы Imagej V. 1.41И).
На рис. 7 представлены данные, позволяющие оценить зависимость практического выхода алкалоидов барбариса от времени нагревания.
25
мг/г
10
5
0
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
время нагревания, мин
Рис. 7. Влияние продолжительности нагревания на полноту извлечения алкалоидов корней барбариса 80% уксусной кислотой.
Полученные результаты показали, что при увеличении продолжительности времени нагревания с 15 мин до 60 мин происходит увеличение содержания алкалоидов в конечном экстракте (в 1,3-1,5 раза), которое достигает своего максимального значения. Последующее нагревание практически не влияет на извлечение алкалоидов из корней барбариса. Таким образом, для получения экстрактов с максимальным содержанием алкалоидов рекомендовано нагревание в течение 1 ч.
Заключение
Установлена высокая эффективность 80% растворов уксусной кислоты для извлечения алкалоидов из лекарственного растительного сырья по сравнению с традиционным экстрагентом - хлороформом при щелочном рН, а также спиртом этиловым.
При получении уксуснокислых экстрактов из корней Berberis vulgaris для повышения выхода алкалоидов рекомендовано нагревание на кипящей водяной бане в течение 1 часа. 118
Литература
ГарбарецМ.А., ЗападнюкИ.И. Справочник по фитотерапии. К.: Высшая школа, 1982. С. 200.
Генри Т.А. Химия растительных алкалоидов / Пер. с англ. М.: Государственное научное техническое издательство химической литературы, 1956. 904 с.
Мартынов Е. Г., Строев Е. А., Песков Д. Д. Полисахариды Berberis vulgaris // Химия природн. соедин. 1984. № 1.С. 103.
Перевозченко И.И., ЗаверухаБ.А., Андриенко Т.Л. Лекарственные растения. К.: Урожай, 1991. С. 16-17.
Погоцкая А. А., Бузук Г.Н. Применение сканера и компьютерных программ цифровой обработки изображений для количественного определения алкалоидов в листьях маклейи сердцевидной // Вестник фармации. 2009. N° 4. С. 32-38.
Соколов С.Л., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям. М.: Медицина, 1988. С. 264.
УспенскийА.О. О гомеопатии и аллопатии // Наука и жизнь. 1990. № 1. С. 80-83.
Anis K.V., Kuttan G, Kuttan R. Role of berberine as an adjuvant response modifer during tumour therapy in mice // Pharm. Pharmacol. Commun. 1999. № 5. P. 697-700.
Freile M.L. Antimicrobial activity of aqueous extracts and of berberine isolated from Berberis heterophylla // Fitot-erapia. 2003. № 74. P. 702-705.
Ivanovska N., Philipov S. Study on the anti-inflammatory action of Berberis vulgaris root extract, alkaloid fractions and pure alkaloids // International Journ. of Immunopharmacology. 1996. V. 18. № 10. P. 553-561.
Kupeli E, Ko§ar M, Yeplada E, Husnu K, Ba§er C. A comparative study on the anti-inflammatory, antinociceptive and antipyretic effects of isoquinoline alkaloids from the roots of Turkish Berberis species // Life Sciences. 2002. № 72. P. 645-657.
Musumeci R. Berberis aetnensis C. Presl. extracts: antimicrobial properties and interaction with ciprofloxacin // International Journ. of Antimicrobial Agents. 2003. № 22. P. 48-53.
Сведения об авторах
Погоцкая Алла Алексеевна
к. фарм. н., доцент кафедры фармакогнозии с курсом ФПК и ПК УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Витебск E-mail: pogotska@mail.ru
Бузук Георгий Николаевич
д. фарм. н., доцент кафедры фармакогнозии с курсом ФПК и ПК УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Витебск E-mail: buzuk@tut.by
Диковицкая Ольга Руслановна
студентка фармацевтического факультета УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Витебск E-mail: doloretc@gmail.com
Pogotskaya Alla Alexeevna
Ph.D. in Pharmaceutical science,
Ass. Professor of the Department of Pharmacognosy
Vitebsk State Order of Peoples ’ Friendship Medical University, Vitebsk
E-mail: pogotska@mail.ru
Buwk Georgy Nicolaevich
Sc.D. in Pharmaceutical science,
Ass. Professor of the Department of Pharmacognosy
Vitebsk State Order of Peoples’ Friendship Medical University, Vitebsk
E-mail: buzuk@tut.by
Dikovitskaya Оlga Ruslanovna
Student of the Pharmaceutical Faculty
Vitebsk State Order of Peoples ’ Friendship Medical University, Vitebsk E-mail: doloretc@gmail.com
