CC BY
9УДК 632.4:632.51
ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТА МИЦЕЛИЯ ФИТОПАТОГЕНОГО ГРИБА STAGONOSPORA CIRSII ^163 НА СОХРАННОСТЬ ЕГО МИКОГЕРБИЦИДНЫХ СВОЙСТВ ПРИ ВЫСУШИВАНИИ
Н.А. Павлова, С.В. Сокорнова, А.О. Берестецкий
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург, Россия
Фрагменты мицелия Stagonospora сши С-163 при невысокой инфекционной нагрузке могут вызывать заболевание пятнистости листьев многолетнего корнеотпрыскового сорного растения бодяк полевой. Раннее было показано, что максимальная агрессивность инфекционного материала достигается в экспоненциальной фазе роста при глубинной ферментации на сахарозо-соевой среде. В то же время жизнеспособность и агрессивность полученного таким образом вегетативного мицелия катастрофически падает при высушивании. Целью работы стала оценка влияния возраста мицелия фитопатогенного гриба X сши С-163 на сохранность его микогербицидных свойств при высушивании. Сравнение жизнеспособности и вирулентности мицелия X. сши С-163, находящегося в различных фазах роста, после высушивания показало, что наименьшее воздействие на микогербицидные свойства отмечается у мицелия в начале стационарной фазы роста. Мы полагаем, что он может быть использован как основа при разработке препаративной формы в виде смачивающегося порошка. Такая форма обычно применяется при разработке биогербицидов, которые могут храниться.
Ключевые слова: Stagonospora сши, бодяк полевой, микогербицидные свойства, инфекционный материал, мицелий, стационарная фаза роста, высушивание, жизнеспособность, агрессивность.
Несмотря на большое количество известных потенциальных микогербицидов, на настоящий момент в мире зарегистрировано не более 20 препаратов, большинство из которых появились на рынке в последние 5 лет [Cordeau et al., 2016; Берестецкий, 2017]. Это связано прежде всего с тем, что эффективность микогербицидов находится в сильной зависимости от климатических условий, в том числе от относительной влажности воздуха и температуры [TeBeest, Templeton, 1985; Greaves et al., 1989; Сокорнова, 2014]. Кроме того, препараты на основе патогенных грибов сложно стабилизировать и зачастую они не подлежат долгому хранению [Берестецкий, Сокорнова, 2009]. Исторически микогербициды выпускаются двух типов: для непосредственного применения, сразу или через короткое время после получения (суспензии, пасты), и предназначенные для применения через какое-то время (смачивающиеся порошки, гранулы). При разработке микогербицидов, подлежащих хранению, в качестве инфекционного начала преимущественно используются конидии, так как они более устойчивы к высушиванию, чем вегетативный мицелий [Гасич, Берестецкий, 2007; Берестецкий, Сокорнова, 2009]. В то же время для фомо-идных микромицетов в ряде случаев заражение мицелием происходит быстрее и менее зависимо от температур-но-влажностных условий в первые часы после заражения [Сокорнова и др., 2011]. Преимущества использования
Материалы
В работе использован штамм S. cirsii С-163 из рабочей коллекции лаборатории фитотоксикологии и биотехнологии ВИЗР. Гриб хранили при 5 °C в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре (КГА). Для получения посевного материала гриб культивировали 2 недели на КГА при 24 °C в темноте. Мицелий выращивали в 250 мл колбах Эрленмейра, содержащих 50 мл сахарозо-соевой питательной среды (СС) следующего состава: сахароза -30 г/л, соевая мука - 14 г/л, KH2PO4 - 1 г/л, MgSO4x7H2O - 0.5 г/л. Посев производили 2-мя блоками двухнедельной посевной культуры диаметром 5 мм. Культивирование
мицелия в качестве инфекционного материала ранее были показаны в таких патосистемах как Alternaria cassiae Jurair & Khan / Cassia obtusifolia L. [Stowell et al., 1989], Alternaria alternata (Fr.) Keissler / Eupatorium adenophorum Spreng. [Qiang et al., 2006], Chondrostereum purpureum (Pers. ex Fr.) Pouzar / Prunus serotina Erhr. [Scheepens & Hoogerbrugge 1989], Phoma herbarum Westend / Taraxacum officinale G.H. Weber ex Wiggers [Steward-Wade, Boland 2000], Sphaceloma poinsettiae Jenkins & Ruehle / Euphobia heterophylla L. [de Lima Nechet et al., 2004]. Более того, фитопатоген Stagonospora cirsii С-163 (потенциальный микогербицид бодяка полевого) способен образовывать конидии только при периодическом освещении в ближнем УФ (350 нм) [Berestetskiy et al., 2005], что усложняет технологию получения инфекционного материала. По этим причинам для разработки препарата против бодяка полевого в качестве инфекционной основы был предложен мицелий гриба S. cirsii С-163 [Берестецкий и др., 2014]. Хорошо известно, что в процессе роста и старения изменяются биохимические характеристики вегетативного мицелия, поэтому мы предположили, что сохранность микогербицидных свойств мицелия при высушивании также будет зависеть от возраста инфекционного материала. Целью работы стала оценка влияния возраста мицелия фитопатогенного гриба S. cirsii С-163 на сохранность его микогербицидных свойств при высушивании. и методы
осуществляли на орбитальной качалке при 180 об/мин и температуре 24±2 °C. Агрессивность определяли на листовых высечках [Berestetskiy et al., 2007], выход биомассы и количество жизнеспособных единиц (КОЕ/г) оценивали общепринятыми микологическими методами [Методы..., 1982]. Высушивание биомассы в тонком слое осуществляли в термостате с циркуляцией воздуха (ТС0-200 СПУ) при температуре 33 °C в течение 5 ч.
Обработку данных проводили классическими статистическими методами [Доспехов, 1979].
Результаты и обсуждение
При культивировании S. cirsii С-163 на среде СС в колбах на орбитальной качалке середина экспоненциальной фазы роста мицелия наступает на 3-и сутки, начало стационарной фазы роста приходится на 6-е, а поздняя стационарная фаза на 9-е сутки роста. Выход сырого мицелия в стационарной фазе роста составляет 131 г/л (табл. 1), что сопоставимо с выходом мицелия в условиях жидкофазной глубинной ферментации, используемого в качестве инфекционной основы различных потенциальных микогер-бицидов [Stowell et al. 1989; Qiang et al., 2006; Scheepens, Hoogerbrugge, 1989; Steward-Wade, Boland 2000; de Lima Nechet et al., 2004]. В тоже время сравнение значений КОЕ сырого мицелия показывает, что наиболее жизнеспособным является мицелий в экспоненциальной фазе роста (табл.1). Наиболее агрессивным в отношении бодяка полевого также является сырой мицелий в экспоненцильной фазе роста (табл. 1), что согласуется с раннее полученными данными [Berestetskiy et al., 2005; Сокорнова и др., 2011]. Таким образом, в качестве инфекционной основы для препарата не подлежащего хранению целесообразно использовать молодой мицелий S. cirsii С-163.
Высушивание различным образом влияет на микогер-бицидные свойства мицелия S. cirsii С-163 разного возраста. Сравнение КОЕ и патогенности суспензии на основе сухого мицелия достоверно показывает, что наилучшими микогербициднами свойствами обладает 6-суточный мицелий S. cirsii С-163 (табл.), а не 3-суточный, как в случае с сырым мицелием. Анализ количества жизнеспособных
единиц на грамм материала после сушки показал, что потери жизнеспособности мицелия в целом высоки. В тоже время зрелый мицелий, находящийся в начале стационарной фазы, в 2 раза более устойчив к температурному воздействию, чем молодой. С учетом того, что выход мицелия в начале стационарной фазы роста в 2 раза выше, чем в середине экспоненциальной фазы роста, использование такого мицелия для высушивания представляется технологически обоснованным. К недостаткам можно отнести более длительное время культивирования и более низкую агрессивность инфекционного материала по сравнению с мицелием в фазе активного роста (табл.).
Таким образом, при разработке различных по срокам хранения типов препаратов на основе мицелия X апИ С-163 целесообразно в качестве инфекционной основы использовать мицелий разного возраста. В случае препаратов, непосредственно применяемых после получения, это может быть молодой мицелий, находящийся в экспоненциальной фазе роста. Для препаратов, которые предполагается стабилизировать и хранить, необходимо использовать более зрелый мицелий, находящийся в стационарной фазе роста. В дальнейшем, на наш взгляд, необходимо выявить биохимические показатели (например, концентрация олигосахаров, полиолов, липидов в мицелии), коррелирующие с жизнеспособностью мицелия, что упростит процесс оптимизации условий культивирования и сушки.
Таблица. Характеристика вегетативного мицелия S. cirsii С-163
Характеристика сырого мицелия Характеристика сухого мицелия
Сутки Фаза роста мицелия Выход, г/л КОЕ/г, *104 Относительная влажность, % Агрессивность (50 мг/мл), »/о1 КОЕ/г, *103 Агрессивность (7.5 мг/мл2), %2
3 Середина экспоненциальной фазы 70.9 211.0 85.8 100 27.6 18
6 Начало стационарной фазы 130.9 201.9 86.0 82 52.2 26
9 Конец стационарной фазы 114.8 200.0 89.0 68 18.4 12
НСР0.05 15.8 5.9 1.9 12 1.2 12
'Площадь некроза относительно общей площади листового диска
2Инфекционная нагрузка увеличена с учетом потерь жизнеспособности при высушивании
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №16-16-00085 «Разработка технологий получения и применения мико-гербицидов для борьбы с трудноискоренимыми сорными растениями».
Библиографический
Берестецкий А.О., Сокорнова С.В. Получение и хранение биопестицидов на основе микромицетов / А.О. Берестецкий, С.В. Сокорнова // Микология и фитопатология. 2009. Том 43. Вып. 6. С. 473-489.
Берестецкий А.О. Штамм гриба Stagonospora cirsii Davis 1.41, обладающий гербицидной активностью против бодяка полевого / Берестецкий А.О., Кашина С.А., Сокорнова С.В. // 2014. Патент РФ № 2515899.
Берестецкий А.О. Перспективы разработки биологических и биорациональных биогербицидов / А.О. Берестецкий // Вестник защиты растений. 2017, N 1. С. 5-12.
Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. Справочник / В.И. Би-лай // Киев: Наукова Думка, 1982. 550 с.
Гасич, Е.Л., Берестецкий, А.О. Влияние долговременного хранения на стабильность штаммов микромицетов, перспективных для биологической борьбы с Cirsium arvense / Е.Л. Гасич, А.О. Берестецкий // Микология и фитопатология. 2007. Том 41. Вып. 4. С. 342-347.
Доспехов Б.А. Методика полевого опыта с основами статистической обработки результатов исследований [Текст] / Б.А. Доспехов // М.: Колос, 1979. 416 с.
список (References)
Сокорнова С.В. Процесс инфицирования бодяка полевого конидиями и мицелием фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii / С.В. Сокорнова, А.В. Хютти, А.О. Берестецкий // Вестник защиты растений. 2011, N 3. С. 57-60.
Berestetskiy A.O. Can mycelial inoculum be an alternative to conidia in the case of Stagonospora cirsii J.J. Davis, a potential biocontrol agent of Cirsium arvense? / A.O. Berestetskiy, O.V. Kungurtseva, S.V. Sokornova // Current status and future prospects in bioherbicide research and product development: Joint Workshop International Bioherbicide Group and EWRS-Biocontrol Working Group; Bari, Italy, 19 June 2005. URL: http://ibg.ba.cnr.it/Newsletter/VII_ IBG_EWRS_Workshop_Bari2005.pdf. P. 7.
Berestetskiy A.O. A laboratory technique for the evaluation of pathogenicity of Septoria cirsii for Cirsium arvense / A.O. Berestetskiy, A.F. Fyodorova, S. Kustova // XV Congress of European mycologists. SPb, Russia, September 16-21, 2007. Abstracts. - SPb.: TREEART LLC, 2007. P. 242.
Cordeau, S. Bioherbicides: Dead in the water? A review of the existing products for integrated weed management / S. Cordeau, M. Triolet, S. Wayman, C. Steinberg, J.P. Guillemin // Crop protection. 2016. Vol. 87. P. 44-49.
De Lima Nechet K. Sphaceloma poinsettiae as a potential biological control agent for wild poinsettia (Euphobia heterophylla) / K. De Lima Nechet,
R.W. Barreto, E.S.G. Mizubuti // Biological Control. 2004. Vol. 30. P. 556-565.
Greaves M.P. Mycoherbicides: Opportunities for genetic manipulation / M.P. Greaves, J.A. Bailey, J.A. Hargreaves // Pesticide science. 1989. Vol. 26, N1. P. 93-101.
Qiang S. Mycelium of Alternaria alternata as a potential biological control agent for Eupatorium adenophorum / S. Qiang, Y. Zhu, B. A. Summerell, Y. Li // Biocontrol Science and Technology. Vol. 16, N 7. 2006. P. 653-668. Scheepens PC, Hoogerbrugge A. 1989. Control of Prunus serotina in forests with the endemic fungus Chondrostereum purpureum. In: Delfosse ES, editor. Proceedings of VII International Symposium on Biological Control
of Weeds. 1988. Rome, Italy. Istituto Sperimentale la Patologia Vegetale, Ministero dell'Agricoltura e delle Foreste, Rome, pp. 545-551.
Stewart-Wade S.M. Selected cultural and environmental parameters influence disease severity of dandelion caused by the potential bioherbicide fungi, Phoma herbarum and Phoma exigua / S.M. Stewart-Wade, G.J. Boland. Biocontrol Science and Technology 2004. Vol. 14. P. 561-569.
Stowell LJ, Nette K, Heath B, Shutter R. 1989. Fermentation alternatives for commercial production of a mycoherbicide. In: Demain AL, Somkuti GA, Hunter-Cevera JC, Rossmoore HW, editors. Novel microbial products for medicine and agriculture. Society for Industrial Microbiology. pp. 219-227.
TeBeest, D.O. Mycoherbicides: Progress in the biological control of weeds / D.O. TeBeest, G.E. Templeton. Plant disease. 1985. Vol. 69, N 1. P. 6-10.
Translation of Russian References
Berestetskiy A.O., Sokornova S.V. Production and stabilization of mycopesticides. Mikologiya i Fitopatolopgiya. 2009. V. 43. N 6. P. 473-489. (In Russian).
Berestetskiy A.O., Kashina S.A., Sokornova S.V. Strain of fungus Stagonospora cirsii Davis 1.42 having herbicidal activity against Canada thistle. RU Patent N 2515899. (In Russian).
Beresteckiy A.O. Prospects for the development of biological and biorational bioherbicides. Vestnik zashchity rastenii. N 1. 2017. P. 5-12. (In Russian).
Bilay V.I. Methods of experimental mycology. Spravochnik. Kiev. Naukova Dumka. 1982. 550 p. (In Russian).
Dospekhov B.A. Method of field experiment with bases of statistical processing of results of researches. B.A. Dospehov // Moskva.: Kolos, 1979. 416 s. (In Russian).
Gasich, EL, Berestetsky, A.O. The effect of long-term storage on the stability of strains of micromycetes, promising for biological control of Cirsium arvense. Mikologiya i Fitopatolopgiya. 2007. V. 41. N 4. P. 342-347. (In Russian).
Sokornova S.V., Hutty A.V., Berestetskiy A.O. The process of infection of the tubercle field with conidia and mycelium of the phytopathogenic fungus Stagonospora cirsii. Vestnik zashhity rastenij. 2011, N 3. S. 57-60. (In Russian).
Plant Protection News, 2017, 4(94), p. 51-53
THE INFLUENCE OF STAGONOSPORA CIRSII C163 MYCELIUM AGE ON THE FUNGUS MYCOHERBICIDAL PROPERTY AT DRYING N.A. Pavlova, S.V. Sokornova, A.O. Berestetskiy
All-Russian Institute of Plant Protection, St. Petersburg, Russia
The pathogen Stagonospora cirsii C-163 can cause the leaf spot disease of the perennial weed Cirsium arvense. It is shown that the maximum aggressiveness of infectious material is achieved in the exponential phase of cultivation on the cultural medium containing 30 g/l sucrose, 14 g/l soybean meal and mineral salts (1 g/l KH2PO4, 0.5 g/l MgSO4*7H2O). At the same time, the viability of the thus obtained vegetative mycelium catastrophically decreases at drying. The aim of the present study was to evaluate the effects of mycelium physiological age of S. cirsii strain 163 on its resistance to drying. It was shown that the mycelium is more resistant to dehydration in the stationary phase than in the exponential one. Moreover, the maximum yield of the S. cirsii C163 mycelium was produced, when it entered the stationary phase. It is supposed that the early stationary phase of S. cirsii C163 cultures can be used as a basis for a long-life bioherbicide against Cirsium arvense.
Keywords: Stagonospora cirsii C-163, mycelium, dehumidification, physiological state, early stationary phase.
Сведения об авторах
Всероссийский НИИ защиты растений, шоссе Подбельского, 3, 196608 Санкт-Петербург, Пушкин, Российская Федерация Павлова Наталья Александровна. Научный сотрудник, кандидат биологических наук, e-mail: nat5356@yandex.ru *Сокорнова Софья Валерьевна. Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, e-mail: svsokomova@vizr.spb.ru *Берестецкий Александр Олегович.Заведующий лабораторей, кандидат биологических наук, e-mail: aberestetskiy@vizr.spb.ru
Information about the authors
All-Russian Institute of Plant Protection, Podbelskogo shosse, 3, 196608, St. Petersburg, Pushkin, Russian Federation Pavlova NatalyaAleksandrovna. Researcher, PhD in Biology,
e-mail: nat5356@yandex.ru *Sokornova Sonie V. Senior researcher, PhD in Biology, e-mail: svsokornova@vizr.spb.ru Berestetskiy Alexandr Olegovich. Head of Laboratory, PhD in Biology,
e-mail: aberestetskiy@vizr.spb.ru
* Ответственный за переписку
* Responsible for correspondence
