CC BY
8УДК 632.4:632.51
DOI: 10.31993/2308-6459-2018-4(98)-67-69
УСТОЙЧИВОСТЬ К ВЫСУШИВАНИЮ РАЗНОВОЗРАСТНОГО МИЦЕЛИЯ
ШТАММОВ STAGONOSPORA СШН
Н.А. Павлова, С.В. Сокорнова
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург Выбор штамма-продуцента - важный этап разработки технологии получения микогербицидов. Для разработки препаратов долгосрочного хранения оценивали микогербицидные свойства различных штаммов Stagonospora сши, а именно влияние высушивания на жизнеспособность и патогенность мицелия. В работе использовали штаммы Stagonospora сши С-163 и С-252, выделенные из некротических пятен на листьях бодяка полевого, и штаммы & сши О-15.35 и S-47, обнаруженные на осоте розовом. Штаммы при глубинном культивировании на оптимизированной по выходу глубинного вирулентного мицелия сахарозо-соевой питательной среде обладали различной скоростью роста, 10 г/сутки и 9 г/сутки для & сши С-163 и 0-15.35, а также 5 г/сутки и 3 г/сутки для & сши С-252 и S-47, соответственно. Наименьшие потери жизнеспособности пропагул при высушивании наблюдались в начале стационарной стадии роста. Как в случае сырого, так и в случае высушенного мицелия наиболее патогенный инфекционный материал образовывался в середине экспоненциальной фазы роста штаммом & сши С-163 в отношении бодяка полевого и штаммом & сши С-0-15.35 в отношении осота розового. Данные штаммы могут служить основой для дальнейшей работы по разработке препаратов длительного хранения.
Ключевые слова: Stagonospora сши штаммы С-163, С-252, О-15.35, S-47, микогербициды, бодяк полевой, осот розовый, жизнеспособность, патогенность, высушивание.
Поступила в редакцию: 30.10.2018
Более 50 лет ведутся научные исследования, направленные на разработку способов биологической борьбы с сорными растениями на основе фитопатогенных грибов [Cordeau, 2016]. При оценке свойств потенциальных микогербицидов большое внимание уделяется повышению стабильности препаратов в полевых условиях и при хранении. Поэтому оценка устойчивости инфекционных единиц штаммов-продуцентов к различным стресс-факторам проводится уже на ранних стадиях разработки препарата [Bailey, 2014].
Показано, что мицелий S. cirsii С-163 может служить основой микогербицида для борьбы с бодяком полевым
Материалы
В работе использованы штаммы С-163, С-252, О-15.35 и S-47 S. cirsii из рабочей коллекции лаборатории фитотоксикологии и биотехнологии ВИЗР. Штаммы С-163 и С-252 были выделены в чистую культуру из некротических пятен на листьях бодяка полевого, штаммы О-15.35 и S-47 получены из некротических пятен на листьях осота розового. Штаммы хранили при 5 °C в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре (КГА). Для получения посевного материала штаммы культивировали 2 недели на КГА при 24 °C в темноте. Мицелий выращивали в 250 мл колбах Эрленмейра, содержащих 50 мл сахарозо-соевой питательной среды (СС) следующего состава: сахароза - 30 г/л, соевая мука - 14.0 г/л, KH2PO4 -1.0 г/л, MgSO4x7H2O - 0.5 г/л. Посев производили 2-мя блоками посевной культуры диаметром 5 мм. Культивирование осуществляли в термостатируемой орбитальной качалке Innova 42 (Edison, NJ, USA) при 180 об/мин и температуре 24 °C. Высушивание биомассы в тонком слое осуществляли в термостате с циркуляцией воздуха (ТС0-200 СПУ, Россия) при температуре 33 °C в течение 5 ч.
Перед оценкой патогенности 200 мг высушенного мицелия помещали в 50 мл стерильной воды и ставили на 1 час на орби-
Принята к печати: 20.11.2018
(Cirsium arvense) [Берестецкий и др., 2014]. Однако, как и в случае других микогербицидов, инфекционным началом которых служит мицелий, потери жизнеспособности мицелия S. cirsii С-163 при высушивании велики [Павлова и др., 2018; Qiang et al., 2006]. Целью данной работы была оценка микогербицидных свойств, а именно выживаемости и патогенности мицелия разновозрастных штаммов С-163, С-252, О-15.35 и S-47 S. cirsii при высушивании. Выбор штаммов обуславливался приуроченностью к различным растениям-хозяевам. Штамм S. cirsii С-163 был выбран, как модельный, так как его микогербицидные свойства были изучены раннее (Берестецкий и др., 2014).
и методы
тальную качалку ELMI Shaker S.3.01 (Latvia) при 180 об/мин и температуре 24±2 °C, далее измельчали на бытовом блендере в течение 40 с (размер фрагментов мицелия около 180 мкм). Затем методом последовательных разведений получали суспензию в концентрациях 12.5, 25 и 50 мг/мл. Листовые высечки бодяка и осота размером 0.8 см в диаметре инокулировали водной суспензией (1 капля объемом 5 мкл) мицелия в различных концентрациях. Инкубировали во влажной камере (герметичном прозрачном пластиковом контейнере с увлажненной фильтровальной бумагой) при температуре 24 °C и периодическом 12-ч освещении. Через 48 ч после заражения проводили учет площади некрозов, образующихся на высечках из листовых дисков по отношению к общей площади [Сокорнова, Берестецкий 2018]. Выход биомассы и количество жизнеспособных единиц (КОЕ/г) оценивали общепринятыми микологическими методами [Методы..., 1982]. Опыты проводили дважды не менее чем в 4-х повторностях.
Для оценки полученных результатов использовали метод множественного сравнения при уровне значимости 5 % [Доспехов, 1985]. Статистические расчеты выполняли с помощью программного обеспечения MS Excel 2007.
Результаты и обсуждение
Анализ динамики роста штаммов при глубинном культивировании на оптимизированной по выходу глубинного вирулентного мицелия сахарозо-соевой питательной среде, выявил два быстрорастущих С-163 и 0-15.35 и два
медленнорастущих штамма S-47 и С-252. Скорость роста в экспоненциальной фазе составляла для С-163 и 0-15.35 10 г/сутки и 9 г/сутки, а для S-47 и С-252 - 5 г/сутки и 3 г/сутки, соответственно. Для всех рассматриваемых
штаммов начало стационарной фазы наступало на 6 сутки (рис. 1). Максимальный выход сухого мицелия составлял у штамма X апИ С-163 - 20 г/л, а у штамма О-15.35 -18 г/л. Таким образом, выход мицелия штамма О-15.35 на сахарозо-соевой питательной среде соизмерим с выходом мицелия модельного штамма X апИ С-163, потенциального микогербицида бодяка полевого.
Сравнительный анализ биохимического состава мицелия разного возраста, на примере штаммов X сШ, на наш взгляд, сможет выявить новые факторы патогенеза этого узко специализированного патогена.
Проведенные исследования важны для решения проблемы устойчивости к высушиванию мицелия X сШ.
Рисунок 1. Динамика роста штаммов С-163, С-252, О-15.35,
S-47 S. сшп при глубинном культивировании на сахарозо-соевой питательной среде, НСР005=0.2
Для всех анализируемых штаммов высушивание различным образом влияло на микогербицидные свойства мицелия & апИ разного возраста. Тем не менее, количество жизнеспособных единиц на грамм материала после сушки для всех штаммов существенно уменьшалось. Анализ КОЕ высушенного мицелия достоверно показывает, что наилучшими микогербицидными свойствами обладает мицелий & апИ, находящийся в начале стационарной фазы роста (рис.2). Устойчивость к температурному воздействию такого мицелия для всех штаммов была в 1.2-2 раза выше, чем для мицелия в экспоненциальной фазе роста. Учитывая, что выход и жизнеспособность мицелия в начале стационарной фазы роста выше, чем в середине экспоненциальной и поздней стационарной фазах роста, применение мицелия штаммов & сш'И в начале стационарной фазы роста считаем технологически обоснованным.
Патогенность высушенного мицелия также у всех исследованных штаммов была различной и зависела от возраста культуры (рис. 3). Наиболее патогенными были быстрорастущие на оптимизированной сахарозо-соевой среде штаммы: & апИ С-163 в отношении бодяка полевого и & сгпа 0-15.35 в отношении осота розового.
Сравнение инфекционной нагрузки, необходимой для 50 % поражения листьев на 2-е сутки развития заболевания растения-хозяина, показало, что высушенный мицелий штаммов & апИ С-163 и & сгпИ 0-15.35, находящихся в середине экспоненциальной фазы роста, был достоверно более патогенный, чем высушенный мицелий других возрастов. Инфекционная нагрузка в этом случае составляла 2.2±0.2*104 и 1.8±0.2*104 КОЕ/г, соответственно (рис. 3). Ранее подобная тенденция была показана для сырого мицелия & сш'И С-163, полученного в аналогичных условиях культивирования [Сокорнова, Берестецкий, 2018].
Бодяк
Осот
12
ш
g 10 8 б 4
2 0
zAz
zAz:
_'_!_*
И
в
С-163
С-252 0-15,35 5-47
3 сутки а 6 сутки ■ 9 сутки Штаммы
Рисунок 2. Количество жизнеспособных единиц до и после высушивания разновозрастного мицелия штаммов & сШ. А - сырой мицелий: влажность 86.0±0.8 %, НСР005=2.0*104; В - сухой мицелий НСР0 =2.3*103
Штаммы
I 3 сутки б сутки ■ 9 сутки
Рисунок 3. Патогенные свойства мицелия штаммов & стп разного возраста. НСР005=12.0.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №16-16-00085 «Разработка технологий получения и применения микогербицидов для борьбы с трудноискоренимыми сорными растениями».
Библиографический
Берестецкий А.О. Штамм гриба Stagonospora cirsii Davis 1.41, обладающий гербицидной активностью против бодяка полевого / Берестецкий А.О., Кашина С.А., Сокорнова С.В. // 2014. Патент РФ № 2515899.
Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. Справочник / В.И. Би-лай // Киев: Наукова Думка, 1982. 550 с.
Доспехов Б.А. Методика полевого опыта с основами статистической обработки результатов исследований [Текст] / Б.А. Доспехов // М.: Колос, 1979. 416 с.
Павлова Н.А., Сокорнова С.В., Берестецкий А.О. Влияние возраста мицелия фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii С-163 на сохранность его микогербицидных свойств при высушивании / Н.А. Павлова, С.В. Сокорнова, А.О. Берестецкий // Вестник защиты растений. 2017, N4. С. 51-53.
Сокорнова С.В., Берестецкий А.О. Получение вирулентного глубинного мицелия Stagonospora cirsii С-163- потенциального микогербицида
список (References)
для борьбы с бодяком полевым Cirsium arven.se (L.) Scop. / С.В. Сокорнова, А.О. Берестецкий // Сельскохозяйственная биология. 2018. Том 53. N5. С. 1054-1061. Cordeau S. Bioherbicides: Dead in the water? A review of the existing products for integrated weed management / S. Cordeau // Crop protection. 2016. Vol. 87. P. 44-49.
Bailey K.L. The bioherbicide approach to weed control using plant pathogens / K.L. Bailey // In: Integrated pest management: current concepts and ecological perspective / D.P. Abrol (ed.). San Diego, Academic Press. 2014. P. 245.
Qiang S. Mycelium of Alternaría alternata as a potential biological control agent for Eupatorium adenophorum / S. Qiang, Y. Zhu, B. A. Summerell, Y. Li // Biocontrol Science and Technology. Vol. 16, N 7. 2006. P. 653-668.
Translation of Russian References
Berestetskiy A.O., Kashina S.A., Sokornova S.V. Strain of fungus Stagonospora cirsii Davis 1.42 having herbicidal activity against Canada thistle. RU Patent N 2515899. (In Russian).
Bilay V.I. Methods of experimental mycology. Handbook. Kiev. Naukova Dumka. 1982. 550 p. (In Russian).
Dospekhov B.A. Method of field experiment with bases of statistical processing of results of researches. // Moscow: Kolos, 1979. 416 p. (In Russian).
Pavlova N.A., Sokornova S.V., Berestetskiy A.O. Influence of age of mycelium of the phytopathogenic fungus Stagonospora cirsii-163 to the safety of his mycoherbicide properties when dried. // Vestnik zashchity rastenij. 2017, N 4. P. 51-53. (In Russian).
Sokornova S.V., Beresteckij A.O. Getting virulent submerged mycelium Stagonospora cirsii-163 - potential mycoherbicide to combat field Thistle Cirsium arvense (L.) Scop. // Selskohozyajstvennaya biologiya. 2018, V 53. N 5. P. 1054-1061. (In Russian).
Plant Protection News, 2018, 4(98), p. 67-69
EFFECT OF DRYING ON VIABILITY OF DIFFERENT AGES MYCELIUM
OF STAGONOSPORA CIRCII N.A. Pavlova, S.V. Sokornova
All-Russian Institute of Plant Protection, St. Petersburg, Russia
The choice of a producer strain is an important stage in the development of mycoherbicides technology. Developing storage formulations, the mycoherbicidal properties of various strains of Stagonospora cirsii were evaluated. The strains C-163 and C-252, isolated from necrotic spots of Cirsium arvense, and strains O-15.35 and S-47, found on Sonchus arvensis was used. The strains had a different growth rate of 10 g/day and 9 g/day for strains C-163 and O-15.35, as well as 5 g/day and 3 g/day for strains C-252 and S-47. The smallest loss of viability of propagules during drying is observed at the early stationary growth phase. The most pathogenic mycelium is S. cirsii C-163 and S. cirsii O-15.35. The most pathogenic dried mycelium of S. cirsii C-163 and S. cirsii 0-15.35 is formed in the middle of the exponential phase. These strains can serve as the basis for further work on the development of long-term storage formulations.
Keywords: Stagonospora cirsii, mycoherbicides, Sonchus arvensis, Cirsium arvense, viability, pathogenicity, drying.
Received: 30.10.2018 Accepted: 20.11.2018
Сведения об авторах
Всероссийский НИИ защиты растений, шоссе Подбельского, 3, 196608 Санкт-Петербург, Пушкин, Российская Федерация Павлова Наталья Александровна. Научный сотрудник, кандидат биологических наук, e-mail: nat5356@yandex.ru *Сокорнова Софья Валерьевна. Ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук, e-mail: svsokornova@vizr.spb.ru
Information about the authors
All-Russian Institute of Plant Protection, Podbelskogo Shosse, 3, 196608, St. Petersburg, Pushkin, Russian Federation Pavlova NatalyaAleksandrovna. Researcher, PhD in Biology,
e-mail: nat5356@yandex.ru *Sokornova Sonie V. Leading researcher, PhD in Biology, e-mail: svsokornova@vizr.spb.ru
* Ответственный за переписку
* Corresponding author
