CC BY
13
УДК 579.64+632.4
Писаревская В.А., Журавлева А.С., Минич М.В., Бехбудзада Н.Б., Шагаев А.А., Марквичёв Н.С.
ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА РОСТ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA В УСЛОВИЯХ ЗАЩИЩЕННОГО ГРУНТА
Писаревская Виолетта Алексеевна, бакалавр 4-го года обучения кафедры биотехнологии; [email protected].
Журавлева Александра Сергеевна, магистрант 2-го года обучения кафедры биотехнологии; Минич Мария Владимировна, аспирант 1-го года обучения кафедры биотехнологии; Бехбудзада Нурлан Башир-оглы, аспирант 4-го года обучения кафедры биотехнологии; Шагаев Антон Александрович, ассистент кафедры биотехнологии;
Марквичёв Николай Семёнович, кандидат технических наук, доцент кафедры биотехнологии; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125480, улица Героев Панфиловцев, дом 20.
В статье рассмотрено влияние, оказываемое различными внешними факторами на рост некоторых представителей рода Trichoderma. В качестве исследуемых факторов были выбраны показатель рН, соленость среды, концентрация источника углерода, концентрация минеральных компонентов в среде и наличие некоторых фунгицидов.
Ключевые слова: Trichoderma; внешние факторы; скорость роста; сельское хозяйство.
INFLUENCE OF EXTERNAL FACTORS ON THE GROWTH OF FUNGI OF THE GENUS TRICHODERMA IN PROTECTED GROUND
Pisarevskaya V.A., Zhuravleva A.S., Minich M.V., Behbudzada N.B., Shagaev A.A, Markvichev N.S. D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
The article considers the influence exerted by various external on the growth of some representatives of the genus Trichoderma. The pH index, the salinity of the medium, the concentration of the carbon source, the concentration of mineral components in the medium, and the presence of some fungicides were chosen as the factors under study. Key words: Trichoderma; external factors; growth rate; agriculture.
Введение
Грибы рода Trichoderma широко применяются во многих отраслях биотехнологической
промышленности. Одна из наиболее широких областей применения — сельское хозяйство [1]. Грибы рода Trichoderma являются эффективными агентами биологического контроля за счет высокой скорости метаболизма субстрата и роста на экссудатах растений, а также за счет способностей к микопаразитизму и фитостимулированию [2]. Таким образом, Trichoderma spp. способны контролировать численность фитопатогенных микроорганизмов в прикорневой зоне и стимулировать защитные механизмы растений [3], что делает их перспективным объектом для дальнейшего использования в сельском хозяйстве.
В сельском хозяйстве применяется два основных метода выращивания культур - в открытом и закрытом грунте. В открытом грунте растения более подвержены влиянию окружающей среды, поскольку рядом нет защитных сооружений. В закрытом грунте некоторые параметры, например, влажность субстрата, интенсивность освещения и состав микробного сообщества в субстрате в той или иной степени контролируются. Но зафиксировать все параметры невозможно. К тому же, не все факторы, влияющие на растения, имеют природное происхождение, так как существуют различные удобрения, подкормки, фунгициды и другие вещества, вносимые человеком. Все они так или
иначе могут оказывать влияние на микробное сообщество, сформированное в субстрате.
Для применения в качестве агента биологического контроля Trichoderma spp. должны обладать повышенной устойчивостью к некоторым внешним факторам, влияющим на их рост. Если в изменившихся условиях фитопатоген, обитающий рядом с прикорневой зоной, оказывается более приспособлен к среде, чем Trichoderma spp., вероятность распространения бактериального или грибного заражения в разы повышается [4].
В условиях закрытого грунта концентрация экссудатов в прикорневой зоне значительно меняется по мере роста растения. Вместе с изменением концентрации и состава экссудатов может меняться и показатель рН - в том числе за счет растительных экссудатов [5]. Значение рН во многом оказывает влияние на состав почвенной микрофлоры [6]. Контролировать эти динамические факторы довольно сложно.
Соленость среды, как и концентрация минеральных компонентов, может зависеть от поливного раствора, орошающего субстрат: от его состава, интенсивности орошения и объема орошающих вод. Фунгициды - еще один пример абиотического фактора, значительно влияющего как на фитопатогенную микрофлору, так и на нейтральную или положительную.
Целью данного исследования являлось изучение влияния таких параметров как концентрация источника углерода, показатель рН, соленость среды,
наличие минеральных солей и фунгицидов в среде на скорость роста некоторых представителей рода Trichoderma.
Экспериментальная часть
Для изучения влияния различных факторов на рост Trichoderma spp. проводили поверхностное культивирование штаммов Trichoderma viride F2001, Trichoderma harzianum F2009, Trichoderma longibrachiatum F2124 на агаризованных средах. Штаммы были предоставлены кафедрой биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева и не являются патогенными.
Для проведения эксперимента подготавливали несколько модифицированных сред, моделирующих экссудаты растения. Основываясь на предыдущих исследованиях [7], в качестве стандартной среды, моделирующей экссудаты растения, применяли среду следующего состава: фруктоза - 0,1 г/л; янтарная кислота - 0,1 г/л; яблочная кислота - 0,1 г/л; лимонная кислота - 0,1 г/л; дрожжевой экстракт -0,1 г/л; агар - 20 г/л. Суммарная концентрация углеродсодержащих веществ составляла 0,5 г/л. Ранее было показано [8], что исследуемые штаммы способны к росту на среде данного состава.
При исследовании зависимости скорости роста Trichoderma spp. от концентрации экссудатов в среде готовили среды, моделирующие экссудаты растения, со следующей суммарной концентрацией углеродсодержащих веществ: 0 г/л; 0,25 г/л; 0,5 г/л. Выбор таких концентраций обусловлен наличием градиента экссудатов в почве [9] и моделирует скорость роста Trichoderma spp. по мере удаления от зоны ризосферы.
При исследовании зависимости скорости роста Trichoderma spp. от показателя рН готовили среды, моделирующие экссудаты, с суммарной концентрацией углеродсодержащих компонентов 0, 5 г/л и показателем рН 5, 6 и 7. Данные показатели рН являются наиболее близкими к рН в верхнем слое почвы, где развиваются грибы Trichoderma spp.
При исследовании зависимости скорости роста Trichoderma spp. от солености среды готовили среды, моделирующие экссудаты, с суммарной концентрацией углеродсодержащих компонентов 0, 5 г/л и концентрацией №С1 в среде, равной: 0 г/л; 5 г/л; 10 г/л. В закрытом грунте концентрация КаС1 обычно очень низкая, однако может повышаться из-за неправильного полива.
При исследовании зависимости скорости роста Trichoderma spp. от концентрации минеральных компонентов в среде готовили среды, моделирующие экссудаты, с суммарной концентрацией углеродсодержащих компонентов 0, 5 г/л. В контрольный вариант не вносили дополнительных компонентов, в экспериментальный вносили минеральные соли для огурца следующего состава (г/л): Са(Шз)2 - 0,6963; КШз - 0,5407; КЩКОз - 0,0492; ^04 - 0,1269; КН2РО4 - 0,17; М§(Шз)2 - 0,2223; МпБ04 - 0,0017; 2пБ04 - 0,0015; СиБ04 - 0,0003; Н3ВО3 - 0,0028. Данные
минеральные компоненты были выбраны в связи с тем, что зачастую вносятся в субстрат вместе с поливным раствором.
При исследовании зависимости скорости роста Trichoderma spp. от наличия фунгицидов готовили среды, моделирующие экссудаты, с суммарной концентрацией углеродсодержащих компонентов 0, 5 г/л и добавлением одного из следующих фунгицидов: Стрекар, Страйк форте, Свитч. Выбор фунгицидов обусловлен их популярностью для применения в закрытом грунте.
В каждую из сред добавляли агар в концентрации 20 г/л. Все среды автоклавировали 30 минут при 1 ати, а затем разливали в стерильные чашки Петри. Объем среды в одной чашке составлял 20 мл. После полного застывания агара методом укола засевали следующие штаммы Trichoderma: Trichoderma viride F2001, Trichoderma harzianum F2009. Trichoderma longibrachiatum F2124. Засевали так, чтобы расстояние от места посева до края чашки Петри не превышало 2 см, а расстояние между штаммами было одинаковым. Чашки ставили в термостат при температуре 28оС и культивировали в течение 5 дней. Каждые сутки сравнивали макроморфологию выросших колоний и измеряли их диаметр. Скорость роста в экспоненциальной фазе рассчитывали по формуле (1), где d - диаметр колонии в момент измерения, мм; т - время между посевом и моментом измерения, ч; - скорость роста, мм/ч.
Имея данные о диаметральных размерах и скоростях роста колоний Trichoderma viride F2001, Trichoderma harzianum F2009 и Trichoderma longibrachiatum F2124, строили гистограммы зависимостей скорости роста от концентрации веществ, моделирующих экссудаты (рис.1), показателя рН (рис.2), содержания №С1 в среде (рис.3), а также гистограммы, показывающие влияние наличия минеральных солей и фунгицидов в среде на скорость роста (рис.4-5).
1,4
т
2 1Д 1
Р 0,8
и о
0,6
0,4 0,2 О
1Т.\лпс1е Р2001
ш\
) 0,25 0,5
Концентрация экссудатов, г/л
IТ.Ьагаапит Р2009 ■ Т.1опв1ЬгасЫа1:ит Р2124
Рис.1. Зависимость скорость роста Trichoderma spp. от концентрации веществ, моделирующих экссудаты, при поверхностном культивировании.
Рис.2. Зависимость скорость роста Trichoderma spp. от показателя рН при поверхностном культивировании на среде, моделирующей экссудаты Cucumis sativus.
5 о 5 ю
■ Т. viride F2001 ИТ. harzianum F2009
■ т. longibrachiatum F2124 Концентрация NaCl, г/л
Рис.3. Зависимость скорость роста Trichoderma spp. от концентрации NaCl при поверхностном культивировании на среде, моделирующей экссудаты Cucumis sativus.
Рис.4. Зависимость скорость роста Trichoderma spp. от наличия в среде солей минерального раствора для огурца при поверхностном культивировании на среде, моделирующей экссудаты Cucumis sativus.
Рис.5. Зависимость скорость роста Trichoderma spp. от наличия фунгицидов при поверхностном культивировании на среде, моделирующей экссудаты Cucumis sativus.
На рисунках 1-5 показаны гистограммы, отражающие изменения в скорости роста колоний при изменении различных параметров среды. На рисунке 1 можно заметить, что при повышении концентрации веществ, моделирующих экссудаты, разница в скоростях роста штаммов Trichoderma растет. На рисунке 2 показано изменение скорости роста Trichoderma spp. по мере роста показателя рН. Можно отметить, что все три штамма имеют большую скорость роста при показателе рН 5, и по мере увеличения рН скорость роста всех трех штаммов падает. Однако скорость роста Trichoderma viride F2001 падает более резко по сравнению с другими штаммами. По данным, представленным на рисунке 3, можно заметить, что штаммы Trichoderma viride F2001 и Trichoderma longibrachiatum F2124 лучше всего растут при добавлении NaCl в концентрации 5 г/л. Для штамма Trichoderma harzianum F2009 скорость роста при концентрации NaCl 0 г/л и 5 г/л была практически одинакова. Скорость роста всех штаммов при концентрации NaCl 10 г/л была ниже скорости роста при концентрации NaCl 5 г/л. На рисунке 4 показано, как изменялась скорость роста колоний Trichoderma spp. при добавлении в среду солей для минерального раствора огурца. Штаммы Trichoderma viride F2001 и Trichoderma longibrachiatum F2124 росли быстрее при добавлении минеральных солей, а штамм Trichoderma harzianum F2009 - при их отсутствии. На рисунке 5 показано влияние фунгицидов на скорость роста штаммов Trichoderma. Во всех случаях скорость роста была очень низка, либо рост практически отсутствовал. Однако рост Trichoderma spp. на среде, содержащей фунгицид Свитч, был выше по сравнению с другими средами. Самой высокой скоростью роста при добавлении фунгицида Свитч обладал штамм Trichoderma harzianum F2009.
Заключение
Из полученных в ходе эксперимента результатов можно предположить, что исследуемые представители рода Trichoderma в большинстве
случаев сохраняют способность, расти на среде даже в достаточно экстремальных условиях.
При росте на среде, моделирующей экссудаты, скорость роста для всех штаммов была различна. При понижении концентрации экссудатов скорость роста колоний значительно замедлялась, данный результат был характерен для всех штаммов Trichoderma.
Можно предположить, что Trichoderma spp. имеют более высокую скорость роста при поверхностном культивировании в слабокислых условиях, и при повышении показателя рН их скорость роста замедляется. При этом штамм Trichoderma viride F2001 имеет более узкий диапазон рН, обеспечивающий оптимальные условия для развития, поскольку скорость его роста при переходе от рН 5 к рН 6 снижается сильнее по сравнению с другими штаммами.
Высокие концентрации КаС1 (10 г/л) негативно сказывались на скорости роста всех штаммов. Однако средние концентрации (5 г/л) №С1 Trichoderma spp. переносили хорошо, в некоторых случаях средние концентрации КаС1 оказывали стимулирующий эффект на рост колоний. Отсутствие в среде КаС1 значительно снижало скорость роста Trichoderma viride F2001, однако не оказывало сильного эффекта на другие штаммы.
Наличие минеральных солей в среде оказывало как положительное, так и отрицательное влияние на скорость роста Trichoderma spp.
Было обнаружено, что штамм Trichoderma harzianum F2009 имеют большую устойчивость к одному из используемых фунгицидов, что может указывать на различную устойчивость исследуемых штаммов к различным видам фунгицидов.
Проведенные эксперименты показали, что каждый из исследуемых штаммов Trichoderma по-разному реагировал на изменения в окружающей среде. Также различными оказывались скорости роста всех штаммов в одинаковых условиях культивирования. Вероятность того, что один штамм окажется устойчив ко всем возможным факторам влияния окружающей среды, очень низок. Для решения данной проблемы возможно применение препаратов Trichoderma spp., состоящих из нескольких микроорганизмов. Таким образом, значительно расширяется диапазон устойчивости препарата к изменению факторов внешней среды, и,
соответственно, повышается его эффективность в
качестве агента биологического контроля.
Список литературы
1. Zin N. A., Badaluddin N. A. Biological functions of Trichoderma spp. for agriculture applications //Annals of Agricultural Sciences. - 2020. - Т. 65. -№. 2. - С. 168-178.
2. Rajani P. et al. Inhibition of plant pathogenic fungi by endophytic Trichoderma spp. through mycoparasitism and volatile organic compounds //Microbiological research. - 2021. - Т. 242. - С. 126595.
3. Adnan M. et al. Plant defense against fungal pathogens by antagonistic fungi with Trichoderma in focus //Microbial pathogenesis. - 2019. - Т. 129. -С. 7-18.
4. Hoshino T., Xiao N., Tkachenko O. B. Cold adaptation in the phytopathogenic fungi causing snow molds //Mycoscience. - 2009. - Т. 50. - №. 1.
- С. 26-38.
5. Vives-Peris V. et al. Root exudates: from plant to rhizosphere and beyond //Plant cell reports. - 2020.
- Т. 39. - №. 1. - С. 3-17.
6. Qi D. et al. Soil pH is the primary factor correlating with soil microbiome in karst rocky desertification regions in the Wushan County, Chongqing, China //Frontiers in microbiology. - 2018. - Т. 9. - С. 1027.
7. Изучение колонизации корневой системы огурца грибом Trichoderma spp viride / А. С. Журавлёва, А. А. Шагаев, Е. Н. Дмитриева и др. // Успехи в химии и химической технологии. — 2018. — Т. 32, № 12. — С. 15-17.
8. Писаревская В. А. и др. ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA НА СРЕДАХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ ЭКССУДАТЫ CUCUMIS SATIVUS //Успехи в химии и химической технологии: сб. науч. тр. Том XXXV. - С. 164.
9. Gao Y. et al. Gradient distribution of root exudates and polycyclic aromatic hydrocarbons in rhizosphere soil //Soil Science Society of America Journal. - 2011. - Т. 75. - №. 5. - С. 1694-1703.
