CC BY
22
УДК 579.64+632.4
Писаревская В. А., Журавлёва А.С., Бехбудзаде Н.Б., Шагаев А.А., Марквичёв Н.С.
ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA НА СРЕДАХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ ЭКССУДАТЫ CUCUMIS SATIVUS
Писаревская Виолетта Алексеевна, бакалавр 3-го года обучения кафедры биотехнологии; [email protected].
Журавлёва Александра Сергеевна, магистрант 1-го года обучения кафедры биотехнологии; Шагаев Антон Александрович, аспирант 3-го года обучения кафедры биотехнологии; Бехбудзаде Нурлан Башир Оглы, аспирант 4-го года обучения кафедры биотехнологии; Марквичёв Николай Семёнович, кандидат технических наук, доцент кафедры биотехнологии;
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125480, улица Героев Панфиловцев, дом 20.
В статье была исследована скорость роста Trichoderma viride F2001, Trichoderma longibrachiatum F2124, Trichoderma harzianum F2009 при поверхностном культивировании на средах, моделирующих экссудаты растения Cucumis sativus. Проведено сравнение скорости роста различных штаммов Trichoderma spp. Показано различие в скоростях роста различных штаммов Trichoderma spp. при росте на питательной среде, моделирующей экссудаты.
Ключевые слова: скорость роста; Trichoderma; экссудаты.
SURFACE CULTIVATION OF A FUNGUS OF THE TRICHODERMA SPECIES ON A MEDIUM MODELING EXUDATE OF CUCUMIS SATIVUS
Pisarevskaya V.A., Zhuravleva A.S., Behbudzade N.B., Shagaev A.A, Markvichev N.S. D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
The article investigated growth rate of Trichoderma viride F2001, Trichoderma longibrachiatum F2124, Trichoderma harzianum F2009 during surface cultivation on a medium simulating exudates of the Cucumis sativus plant. Comparison of growth rates of different Trichoderma strains was carried out. The difference in the growth rates of different strains of Trichoderma spp. was shown while growing on a nutrient medium that simulates exudates.
Key words: growth rate; Trichoderma; exudates.
Введение
В данный момент существует большое количество параметров, по которым можно оценивать эффективность действия Trichoderma spp. в качестве агента биологического контроля. Одним из важных параметров является скорость роста. Скорость роста микроорганизмов зависит от многих факторов, среди которых можно выделить источник углерода, рН, температуру, при которой развиваются микроорганизмы, влажность и т.д. [1]. Однако оценка данного параметра затруднена вследствие того, что состав питательных веществ в прикорневой зоне растений значительно отличается от состава богатых питательных сред, которые используются в лабораторных экспериментах.
Грибы рода Trichoderma широко применяются во многих отраслях биотехнологической
промышленности. Из Trichoderma spp. можно получать сырье для производства ферментов, разрушающих целлюлозу, пектин, лигнин, хитин. Наличие целлюлазной активности позволяет роду Trichoderma развиваться на труднодоступных субстратах, содержащих целлюлозу [2]. Помимо
этого, грибы рода Trichoderma используют в производстве фунгицидных антибиотиков и токсинов [3]. Благодаря способности разлагать органические ксенобиотики (например, пестициды) и повышенной толерантности к высоким концентрациям тяжелых металлов, Trichoderma spp. может применяться в биоремедиации почв [4]. Также грибы рода Trichoderma в процессе роста в ризосфере выделяют фитогормоны, оказывающие стимулирующее воздействие на рост растений [5]. Многие из перечисленных свойств послужили обоснованием для использования Trichoderma spp. в качестве агента биологического контроля.
Грибы рода Trichoderma считаются эффективными агентами биологического контроля вследствие их способности активно колонизировать прикорневую зону растения, низкой фитотоксичности в отношении растений и антагонистического воздействия на фитопатогенные микроорганизмы [6]. В естественных условиях Trichoderma spp. развивается в прикорневой зоне в верхнем слое почвы, так как являясь аэробным микроорганизмом нуждается в кислороде [7].
В прикорневую зону растения выделяют экссудаты, которые служат субстратом для роста различных микроорганизмов. Как правило, экссудаты представляют собой смесь органических кислот, ферментов, белков, сахаров, аминокислот и т.д. Экссудаты, выделяемые растениями, могут стимулировать развитие одних микроорганизмов и подавлять рост других, тем самым выступая в качестве механизма защиты растения от фитопатогенов. Было доказано[8], что при избыточном стрессе (например, при повреждении корня, повышенной концентрации соли или в присутствии фитопатогенных микроорганизмов) стимулируется рост Trichoderma spp. в прикорневой зоне. Поскольку в прикорневой зоне существует градиент концентраций, и по мере удаления от корня концентрация экссудатов падает, важна зависимость скорости роста Trichoderma spp. от концентрации экссудатов. Эта зависимость была исследована на среде, содержащей экссудаты Cucumis sativus [9]. Результаты показали, что при повышении концентрации экссудатов скорость роста Trichoderma spp. возрастает и при определенной концентрации превышает скорость роста в данных условиях фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum. Следовательно, оценку эффективности Trichoderma spp. в качестве агента биологического контроля следует проводить при поверхностном культивировании на модельных средах, в состав которых входят экссудаты растений.
При подборе штамма в качестве агента биологического контроля, как правило, учитывают множество факторов: скорость роста, способность развиваться при различных температурах и рН, накопление метаболитов и влияние, которое они оказывают на растение, антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным микроорганизмам и т.д. Определяют интервалы температуры, рН и иных нефиксированных параметров, естественно изменяющихся в течение суток, при которых происходит активное развитие микроорганизма.
Существует несколько методов оценки эффективности применения грибов Trichoderma spp. в качестве агента биологического контроля. Многие включают в себя оценку скорости роста Trichoderma spp. при выращивании на различных питательных средах. Однако, как показывают исследования[10], скорость роста различных штаммов Trichoderma spp. может значительно меняться в зависимости от состава среды и количества доступного источника углерода в ней. Экссудаты, выделяемые растениями, значительно отличаются по составу от стандартных лабораторных сред для культивирования грибов. Поэтому пока не представляется возможным говорить об оценке скорости роста на основе лабораторных исследований вследствие различного состава питательных сред, используемых в экспериментах, и экссудатов, выделяемых растениями в ризосферу.
Экспериментальная часть
Для изучения скорости роста проводили поверхностное культивирование штаммов Trichoderma spp., принадлежащих коллекции лаборатории и не являющихся фитопатогенными. Штаммы Trichoderma viride F2001, Trichoderma longibrachiatum F2124, Trichoderma harzianum F2009 культивировали поверхностно в стерильных условиях на чашках Петри на поверхности агаризованной среды, моделирующей состав экссудатов Cucumis sativus [9]. Для этого в пробирках подготавливали по 20 мл среды следующего состава (г/л): Янтарная кислота - 0,1, Яблочная кислота - 0,1, Лимонная кислота - 0,1, Фруктоза - 0,1, Дрожжевой экстракт -0,1, Агар - 17,5. Далее пробирки со средой автоклавировали в течение 30 минут при 1 ати и в стерильных условиях переносили среду заданного объема на чашки Петри. После в условиях стерильности производили посев штаммов Trichoderma viride F2001, Trichoderma longibrachiatum F2124, Trichoderma harzianum F2009 уколом в центр чашки и помещали в термостат при постоянной температуре 28оС. В течение трех дней наблюдали скорость роста штаммов Trichoderma spp. и измеряли диаметр колоний в миллиметрах (через 16, 39 и 67 часов после посева). Полученные результаты представлены на рисунке 1.
шп
О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66
Т.Ч
Рис.1. Диаметральный рост колоний Trichoderma spp. на среде, моделирующей экссудаты.
На рисунке 1 показано различие в диаметральном росте штаммов Trichoderma spp. на субстрате, моделирующем экссудаты Cucumis sativus. Полученные кривые представляют собой кривые роста микроорганизмов. Кривая, образующаяся при росте штамма Trichoderma longibrachiatum F2124, представляет собой наиболее характерную для всех микроорганизмов S-образную кривую роста. Для анализа полученных данных вынесем кривую роста штамма Trichoderma longibrachiatum F2124 отдельно в рисунок 2.
Ш!4 Ji*
О 3 Ь 3 12 1Ь 1В 21 21 21 30 33 ЗЬ ЗУ 4Z 4Ь 4S Ь1 М Ъ/ ЬО ЬЗ №
Рис. 2. Кривая роста штамма Trichoderma longibrachiatum F2124 на среде, моделирующей экссудаты.
На рисунке 2 показано наличие трех фаз развития микроорганизма: lag-фазы, или фазы задержки роста; фазы экспоненциального роста, при которой скорость роста микроорганизма развивается до максимальной; фазы торможения, в которой рост культуры замедляется.
Перечисленные фазы развития характерны и для штаммов Trichoderma viride F2001, Trichoderma harzianum F2009. Однако по рисунку 1 можно отметить, что различны временные промежутки, которые микроорганизмы провели в различных фазах.
Проанализировав длительность lag-фазы у всех представленных штаммов по методу касательных, предложенному Пертом [11], получили следующие результаты: для Trichoderma viride F2001 - 1 час, для Trichoderma longibrachiatum F2124 - 6 часов, для Trichoderma harzianum F2009 - 12 часов.
Скорость роста в экспоненциальной фазе определялась по следующей формуле: w= dr/dx (1)
где dr - изменение диаметра колонии в миллиметрах,
dr - время, за которое произошло изменение диаметра колонии dr.
Результаты скорости роста в экспоненциальной фазе: для Trichoderma viride F2001 - 1,09 мм/час, Trichoderma longibrachiatum F2124 - 1,07 мм/час, Trichoderma harzianum F2009 - 0,9 мм/час.
Продолжительность фазы экспоненциального роста: для Trichoderma viride F2001 - 66 часов, для Trichoderma longibrachiatum F2124 - 35 часов, для Trichoderma harzianum F2009 - 51 час.
Фаза торможения на представленных на рисунке 1 кривых у Trichoderma viride F2001 отсутствует, у Trichoderma longibrachiatum F2124 начинается после 48 часов роста, у Trichoderma harzianum F2009 отсутствует.
Полученные из рисунка 1 результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты анализа кривых роста Trichoderma spp. на средах, моделирующих экссудаты.
Штамм Продолжительность Продолжительность Скорость роста в Начало фазы
Trichoderma spp. lag-фазы, ч экспоненциальной фазы, ч экспоненциальной фазе, мм/ч торможения
Trichoderma viride 1 66 1,09 Отсутствует
F2001
Trichoderma 6 35 1,07 Через 48 часов
longibrachiatum F2124 роста
Trichoderma harzianum F2009 12 51 0,9 Отсутствует
По результатам, отображенным в таблице 1, можно предположить, что штамм Trichoderma viride F2001 развивается быстрее по сравнению с другими представленными штаммами при данных условиях, поскольку имеет наименьший период lag-фазы, наибольшую скорость роста в экспоненциальной фазе и не достигает начала фазы торможения при выращивании на чашке Петри на протяжении 3 дней. Это может означать, что Trichoderma viride F2001 легче приспосабливается к субстрату и быстрее начинает потреблять углерод при культивировании на средах, моделирующих экссудаты Cucumis sativus. Штамм Trichoderma longibrachiatum F2124, несмотря на больший период lag-фазы и меньшую продолжительность экспоненциальной фазы, имеет достаточно высокую скорость роста в экспоненциальной фазе. Штамм Trichoderma harzianum F2009 имеет наибольший период lag-фазы
и наименьшую скорость развития в экспоненциальной фазе.
Следует добавить, что за 4 дня роста все штаммы достигали края чашки Петри, и дальнейшая оценка скорости роста не проводилась.
Заключение
В заключение можно предположить, что все исследуемые штаммы Trichoderma spp. способны развиваться на средах, моделирующих экссудаты. Однако можно отметить, что скорость при изучении роста различных видов Trichoderma spp. на модельной среде экссудатов будет различаться. Причиной может являться различная скорость метаболизма видов Trichoderma viride, Trichoderma
longibrachiatum и Trichoderma harzianum. Из полученных результатов можно сделать вывод, что наибольшей скоростью роста на средах, моделирующих экссудаты, будет обладать Trichoderma viride F2001. Можно отметить, что для всех штаммов существуют различия в скорости роста по сравнению с результатами, полученными на богатой питательной среде. Таким образом, важной частью подбора штамма в качестве агента биологического контроля является учет состава питательной среды. Поскольку в естественных условиях в прикорневой зоне наблюдается градиент концентрация экссудатов, и по мере удаления от корня концентрация падает, состав среды, в которой развиваются микроорганизмы, меняется, что, в свою очередь, оказывает влияние на скорость их роста. Также необходимо принимать во внимание, что в прикорневой зоне сосуществуют многие микроорганизмы, которые могут вступать в определенные связи и влиять на развитие друг друга. При этом микробиологический состав почвы в прикорневой зоне тоже во многом зависит от концентрации и состава выделяемых растением экссудатов. Следовательно, подробное изучение свойств микроорганизмов при подборе штаммов в качестве агентов биологического контроля следует проводить на питательных средах, моделирующих экссудаты растений при поверхностном культивировании.
Список литературы
1. Begoude B. A. D. et al. Response surface methodology study of the combined effects of temperature, pH, and aw on the growth rate of Trichoderma spp asperellum //Journal of Applied Microbiology. - 2007. - Т. 103. - №. 4. - С. 845-854.
2. Гнеушева И. А., Павловская Н. Е., Яковлева И. В. Биологическая активность грибов рода Trichoderma и их промышленное применение //Вестник аграрной науки. - 2010. - Т. 24. - №. 3.
3. Ghisalberti E. L., Sivasithamparam K. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp //Soil
biology and Biochemistry. - 1991. - Т. 23. - №. 11.
- С. 1011-1020.
4. Tripathi P. et al. Trichoderma: a potential bioremediator for environmental clean up //Clean Technologies and Environmental Policy. - 2013. - Т. 15. - №. 4. - С. 541-550.
5. Martinez-Medina A. et al. Phytohormone profiles induced by Trichoderma isolates correspond with their biocontrol and plant growth-promoting activity on melon plants //Journal of chemical ecology. -2014. - Т. 40. - №. 7. - С. 804-815.
6. Исследование взаимодействия Trichoderma spp viride и fusarium oxysporum на ранних этапах проростания спор / С. И. Ривера, Н. Б. Бехбудзада, А. С. Журавлёва и др. // Успехи в химии и химической технологии. — 2020. — Т. 34, № 11.
- С. 75-77.
7. Изучение колонизации корневой системы огурца грибом Trichoderma spp viride / А. С. Журавлёва, А. А. Шагаев, Е. Н. Дмитриева и др. // Успехи в химии и химической технологии. — 2018. — Т. 32, № 12. — С. 15-17.
8. Lombardi N. et al. Root exudates of stressed plants stimulate and attract Trichoderma spp soil fungi //Molecular Plant-Microbe Interactions. - 2018. - Т. 31. - №. 10. - С. 982-994.
9. Исследование роста Trichoderma spp viride и fusarium oxysporum на твёрдых микробиологических средах, содержащих экссудаты растений огурца / А. А. Шагаев, В. В. Соколова, А. А. Самородова и др. // Успехи в химии и химической технологии. — 2016. — Т. 30, № 9. — С. 39-41.
10. Rossi-Rodrigues B. C. et al. Comparative growth of Trichoderma spp strains in different nutritional sources, using bioscreen c automated system //Brazilian Journal of Microbiology. - 2009. - Т. 40.
- №. 2. - С. 404-410.
11. Перт Дж.С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. 331 с.
