CC BY
39
УДК 576.8:576.852.2
ВЛИЯНИЕ ВИТАМИНОВ НА РОСТ И КАРОТИНОГЕНЕЗ Rhodococcus sp.
© 2004 г. Г.Я. Дараселия
It is established, that entering of Vitamin B1 5 mkg of % biosynthesis carotinoids provided the maximal accumulation of a biomass, and 50 mkg of % biosynthesis carotinoids Addition of other vitamins of group B, and also an ascorbin acid and Vitamin K didnot render Stimulating action on growth and carotenogenesis culture.
В литературе имеются данные о влиянии некоторых витаминов на рост и образование каротиноидов различными микробами-продуцентами. Наиболее обстоятельно изучалось влияние витамина B1 и органических кислот в [1, 2].
Обнаружено, что витамин B1 необходим для роста и каротиногенеза как для Corhynebacterium poinsettae, так и для гриба Phycomyces blakesleeanus [3 - 6]. Авторами установлено, что за рост и биосинтез кароти-ноидов этих микроорганизмов ответственна тиазоль-ная часть молекулы витамина B1.
Отмечено стимулирующее влияние других витаминов группы В на рост и каротиногенез различных продуцентов. Например, в растущей культуре Ph. blakesleeanus рибофлавин стимулировал рост, биосинтез каротиноидов и липидов [7]. Пантотеновая кислота стимулировала биосинтез каротиноидов Mucor hiemalis [8], ПАБК, РР, фолиевая кислота и менадион способствовали образованию каротиноидов Penicil-lium sclerotiorum [9]. При культивировании Rhodotorula gracilis К-1 заметно увеличивалось количество клеток при добавлении к среде витамина B1, биотина и ПАБК [10].
В ряде случаев витамины не оказывали влияния на рост и каротиногенез отдельных продуцентов. В опытах Бобковой [11] со Sporobolomyces rossus витамин B1, пантотеновая кислота, ПАБК, РР, биотин и инозит не оказывали никакого эффекта ни на рост изучаемого организма, ни на каротиногенез. В исследованиях польских авторов [12] биотин, пири-доксин, РР, рибофлавин не оказывали значительного влияния на рост и каротиногенез Blakeslea trispora. В ряде случаев отдельные витамины даже угнетают рост и каротиногенез некоторых продуцентов. Например, пантотенат кальция подавлял образование каратиноидов Penicillium sclerotiorum.
По сообщению Зейле [13], присутствие в ацетатной среде витамина B1 подавляло каротиногенез Rhodotorula gracilis.
В литературе встречается сравнительно немного работ о потребнocти микобактерий в витаминах и о влиянии их на каротиногенез при выращивании этих микроорганизмов на синтетических средах. К тому же получены противоречивые результаты. Одни исследователи считают необходимым вносить в среду витамин Bi [14] или несколько витаминов группы В [11], в то время как другие отмечают хороший рост
микобактерий на средах без витаминов [13]. Отдельные представители рода микобактерий нуждаются в витаминах. Так, для развития Мус. 1асйсо1иш требуются никотиновая кислота и витамин В1. Многие представители белых и желтых почвенных микобактерий в отличие от красно-оранжевых не растут на минеральных средах без витаминов [15, 16].
Поскольку различные физиологические группы микроорганизмов отличаются по их потребности в витаминах, целью наших исследований является изучение влияния витаминов на рост и биосинтез каротиноидов ИИо^соссиБ Бр. в условиях глубинного культивирования на синтетической среде.
Объекты и методы исследования
Объектом исследования служила культура ЯИо^соссиБ Бр., полученная нами ранее методом химического мутагенеза и ступенчатой селекции [17].
Культивирование проводили в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих по 100 мл предложенной нами ранее [18] синтетической среды, при 30 °С и встряхивании на круговой качалке (230 об/мин). В качестве посевного материала использовали клетки экспоненциальной фазы роста в объеме 5 %. Витамины вносили асептически после стерилизации питательной среды. Биомассу определяли весовым методом, каротиноиды - по разработанной нами методике [19].
Результаты исследования и их обсуждение
На рис. 1, 2 приводятся данные о влиянии различных концентраций витамина В1 на рост и каротиногенез культуры. При наличии в среде следов витамина В1 наблюдался слабый рост культуры, вес биомассы составлял всего 1,5 - 2,0 г/л, выход каротиноидов был незначителен (0,3 - 0,4 мг/л), продуктивность также была низкой (0,15 - 0,2 мг/г).
При введении в среду 1 мкг % витамина В1 увеличивалось накопление биомассы и выход каротиноидов в 2,5 - 3,0 раза, при этом продуктивность культуры не изменялась. Повышение концентрации витамина В1 до 5 мкг% обеспечивало почти максимальное накопление биомассы, в то время как оптимальная концентрация витамина В1 для максимального биосинтеза каротиноидов находилась в пределах 50 мкг%. Дальнейшее повышение концентрации витамина В1 в среде до 1000 мкг% не оказывало существенного влия-
ния на рост и каротиногенез культуры (рис. 2).
о. о PQ g.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Витамин Bj, мг/л
Рис. 1. Влияние витамина B1 на рост и каротиногенез Rhodococcus sp.
Витамин В,, мг/л
Рис. 2. Влияние различных концентраций (0,05-10 мг/л) витамина B1 на рост и каротиногенез Rhodococcus sp.: 1 -биомасса (сухое вещество), г/л; 2 - общее количество каро-тиноидов, мг/л; 3 - продуктивность культуры, мг/г
низмам требуется витамин B1 в виде целой молекулы [20]. ' ' Для того чтобы выяснить, в какой части молекулы тиамина нуждается изучаемый штамм, поставили опыты с 2-метил-4-амино-5-бромметилен-пиримиди-ном (пиримидиновый компонент витамина B1) и 2-аминотиазолом, который, по некоторым данным [21], обладает действием витамина B1. Эти вещества вносили в среду в различных концентрациях.
Как видно из данных, приведенных в таблице, на среде с пиримидиновым компонентом накапливалось биомассы и каротиноидов на уровне среды с витамином Bb Диаминотиазол в данном случае не оказывал стимулирующего влияния на рост и каро-тиногенез культуры.
При выращивании Rhodococcus sp. на среде со следами витамина B1 рН снижался до 4,5 - 5,0. Введение в среду ацетата или цитрата в количестве 1 % поддерживало рН на уровне 6,8 - 7,0, но улучшения роста и каротиногенеза не наблюдалось. По-видимому, ацетат или цитрат в этих условиях культурой не использовались. Биохимический анализ среды после выращивания культуры показал, что при наличии следов витамина B1 в среде накапливаются пировиноградная и a-кетоглутаровая кислоты, содержание которых превышает их содержание в контроле более, чем в 300 раз. Накопление кетокислот происходит только на среде, дефицитной по витамину B1. Добавление витамина B1 и доведение рН до 6,5-6,8 приводит почти к полному исчезновению накопившихся кетокислот, к нормализации роста и каротиногенеза. Подобные данные по накоплению значительных количеств пирувата в среде с низким содержанием витамина B1 получены в опытах с Ph. blakesleeanus [7]. Присутствие кетокислот свидетельствует о недостатке кофактора для ферментативного окисления этих субстратов (низкая активность пируват и a-кетоглутаратдегидрогевазы) и образования ацетил -КОА.
Следует отметить, что витамин B1 в концентрации, превышающей оптимальную в 20 раз, не оказывал ингибирущего действия ни на рост, ни на каротиногенез культуры. Методом тонкослойной хроматографии не обнаружено изменения в качественном составе пигментов в зависимости от различной концентрации витамина B1 в среде.
Как известно, молекула витамина B1 состоит из 2 частей: пиримидиновой и тиазольной. Многим микроорганизмам, нуждающимся в витамине B1, достаточно присутствия пиримидиновой или тиазольной его части, поскольку вторую часть молекулы синтезирует сам микроорганизм. Другие микроорганизмы удовлетворяются смесью пиримидинового и тиа-зольного компонентов, так как соединение обеих половин с образованием витамина B1 осуществляется самим микроорганизмом. Некоторым же микроорга-
Влияние пиримидинового компонента витамина Bj и 2-аминотиазола, %, на рост и каротиногенез Rhodococcus sp.
Синтетическая среда рН ко- неч- ный Биомасса (сухое вещество), г/л Общее количество каротинои- дов, мг/л
Контроль (без витамина В!) 5,1 2,0 ±0,2 0,44±0,1
То же + 2-аминотиазол 50 мкг% 5,2 2,3 ±0,18 0,53±0,1
- “ - + - “ - 100 мкг% 5,0 1,9 ±0,09 0,47±0,08
- “ - + пиримидиновый компонент 20 мкг% 6,1 10,7 ±0,2 27,4± 1,07
- “ - + - “ - 50 мкг% 6,0 11,0 ±0,33 29,64±1,18
- “ - + - “ - 100 мкг% 6,2 11,33±0,4 30,24±1,4
- “ - + витамин В1 50 мкг% 6,0 11,74±0,29 31,0 ±1,37
Таким образом, в данном случае недостаток витамина В1 в среде приводит прежде всего к нарушению углеводного обмена в клетке, а впоследствии и азотистого, так как пировиноградная кислота является источником синтеза аланина, а а-кетоглутаровая - глу-таниновой кислоты, которая, как известно, занимает одно из главных мест в аминокислотном обмене.
При работе с Рк ЫакеБ1ееапш была установлена корреляция между количеством витамина В1 в среде и ассимиляцией азотистых веществ, а также пигментооб-разованием. Витамин В1 стимулировал развитие этого гриба даже в том случае, когда в качестве источника углерода использовались этиловый спирт, уксусная кислота, ацетальдегид, т.е. соединения, не требующие при их расщеплении участия кокарбоксилазы [4]. Эти данные, а также и другие дали основание предполагать более значительную и многогранную функцию витамина В1 в метаболизме микроорганизмов наряду с участием его как кофермента некоторых дегидрогеназ [22].
Используя меченый витамин Вь удалось показать, что витамин В1 участвует в биосинтезе каротиноидов РЪ.Ъ1акеБ1ееапиБ [23].
Опыты, проведенные нами с Ию^соссш Бр., позволяют сделать вывод, что данный штамм ауксотрофен в отношении пиримидинового компонента витамина Вь т.е. культура не способна синтезировать пиримидиновую часть молекулы витамина Вь Можно предположить, что в данном случае витамин В1 не только косвенно (через недостаток ацетил-КОА исходного соединения в биосинтезе каротиноидов), но и непосредственно участвует в образовании каротиноидов ИИо^соссш Бр.
В ряде опытов выясняли влияние других витаминов группы В, а также витаминов С и К, на рост и биосинтез каротиноидов ИИо^соссиБ Бр.
Добавление к среде этих витаминов несколько увеличивало накопление биомассы по сравнению с контролем, где витамины отсутствовали. Но ни один из витаминов, кроме В1, не оказывал значительного стимулирующего действия на рост и каротиногенез ИИо^соссш Бр. Дополнительное внесение некоторых витаминов группы В в среду с витамином В1 также не оказывало существенного влияния на рост и каротиногенез КЬо^соссдо Бр. Это можно объяснить тем, что культура способна синтезировать ряд витаминов группы В [24].
Астраханский государственный технический университет
Литература
1. Кравченко Л.В. и др. // Микробиология. 2003. Т. 72. № 1. С. 48 - 53.
2. Косенко Л.В. и др. // Микробиология. 2003. Т. 72. № 1. С. 40 - 47.
3. Schopfer W.H. // Arch. Mikrobiol. 1934. Vol. 5. P. 511.
4. Schopfer W.H. // Protoplasma. 1937. Vol. 28. № 3. P. 381.
5. FriendJ., Goodwin T.W. // Biochem J. 1954. Vol. 57. № 3. P. 434.
6. StarrM.P. // J.Bact. 1949. Vol. 57. № 2. P. 253.
7. Goodwin T.W., Jamikorn M., Willmer J.S. // Biochem. J.
1953. Vol. 53. № 4. P. 531.
8. Grob E.C., Grundbacher V., Shopfer W.H. // Experientia.
1954. Vol. 10. P. 378.
9. Mase Y. // J.Vitaminol. 1959. Vol. 5. № 3. P. 161.
10. Гуринович Е.С.и др. // Исследования по физиологии и биохимии растений. Минск, 1966.
11. Бобкова Т.С. Условия образования каротиноидов некоторыми дрожжами и микобактериями: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1966. 21 с.
12. Pazola Z. et al. // Pzace Inst. I. Lab. Bad. Przem. Spoz. 1967. Vol. 17. № 3. P. 240.
13. ЗейлеМ. // Изв. АН Латв. ССР. 1969. Т. 11. С. 83.
14. Goodwin T.W., Jamikorn M. // Biochem. J. 1956. Vol. 62. № 2. P. 275.
15. Гречушкина Я.П. // Прикладная биохимия и микробиология. 1967. Т. 3. № 6. С. 644.
16. Скрябин Г.К., Кузнецов В.Д., Глухова А.А., Ерошин В.К. Способ производства каротина: А.с. 179427 СССР. 1966.
17. Дараселия Г.Я., Даушвили Л.П. Штамм бактерий М. rubrum шт. 44 продуценткаротиноидов: А.с. 1071636 СССР. 1982.
18. Дараселия Г.Я. // Сообщения АН ГССР. 1976. Т. 82. № 1. С. 74 - 79.
19. Дараселия Г.Я. Методы биохимических исследований растений. Ростов н/Д, 1983. С. 92 - 100.
20. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. М., 1963.
21. Мейсель М.Н. Рефераты работ учреждений отделения биол.наук АН СССР за 1941 - 1943 гг. М., 1945.
22. Одинцова Е.Н. // Микробиология. 1940. Т. 9. № 3. С. 253.
23. Zowry Z.K., Chichester C.O. // Phytochemistry. 1971. Vol. 10. № 2. Р. 323.
24. Дараселия Г.Я. Изменчивость и селекция каротинсин-тезирующих микобактерий: Автореф дис. ... д-ра биол. наук. Киев, 1989. 48 с.
________________________________________10 февраля 2004 г
