CC BY
29
БИОЛОГИЯ
УДК 579.812.11.017
КИНЕТИКА РОСТА И БИОСИНТЕЗА КАРОТИНОИДОВ ЯНОБОСОССШ 8Р. ПРИ ЛИМИТИРОВАНИИ ФОСФАТАМИ
© 2008 г. r.H. flapacenun, H.K. Рогаeа, r.Œ. fleanu, r.H. Kaurnaypu
It is established, that for the given culture there is a narrow range (optimum) concentration of the phosphates growth. Decrease in the concentration of phosphates in the medium leads to limitation of phosphates, causes reduction of specific growth rate and number of carotenes in biomass.
Теоретическая проблема лимитирования роста микробной популяции разными факторами среды -широко рассматриваемая тема многих исследователей. Кинетика роста коринеподобных бактерий хорошо проанализирована в обзорной статье Паникова и др. [1]. Кроме теоретического аспекта нас интересовала проблема лимитирования и в практическом плане, так как объект наших исследовании КИо^соссш Бр. является активным продуцентом каротиноидов и витаминов группы В [2, 3]. Цель данной работы -изучение кинетики роста и биосинтеза каротиноидов в периодической культуре КИо^соссш Бр. при лимитировании фосфатами.
Материалы и методы исследования
В работе использовали КИо^соссш Бр. - продуцент каротиноидов, полученный нами методом мутагенеза и ступенчатой селекции [2]. Выращивание клеток проводили на синтетической среде следующего состава, г/л: мочевина - 1,5; глюкоза - 30,0; сахароза -10,0; ]^04 - 1,0; РеС13 - 8 мг/л; В! - 1,0 мг/л.
Подаваемое количество солей фосфата в разных опытах менялось в следующем диапазоне (№2НР04 и КН2РО4 соответственно), г/л: 1) 3,33, 2,50; 2) 2,0, 1,50; 3) 1,67, 1,25; 4) 0,82, 0,61.
В качестве посевного материала брали вегетативную культуру, выращенную в качалочных колбах на 750 мл с 50 мл среды того же состава, что описано ранее [4], на круговой качалке при 220 об/мин, 30 оС и в стадии замедленного роста. Количество вносимого посевного материала - 5 %.
Культуру выращивали в аппаратуре АНКУМ-2М с рабочим объемом 7 л, скорость вращения мешалки -600 об./мин и аэрации - 0,20 л/(л среды мин). В опытах определяли количество биомассы весовым методом, редуцирующие вещества - по Бертрану, фосфор - по общепринятой методике [5], каротиноиды - по разработанной нами методике [3]. Кинетические параметры роста расчитывали по общепринятым методам [1].
Результаты и их обсуждение
Основные результаты лимитирования роста ИИо^-соссш Бр. по фосфату приведены на рис. 1. Рассматриваются зависимости максимальной концентрации сухой биомассы (Хм), максимальное значение содержания каротиноидов в биомассе (Хм), максимальное значение удельной скорости роста (цм) от начальной концентрации
ионов P043-(Sop). Базисной выбирали концентрацию фосфата, которая принималась за оптимальную при выращивании Rhodococcus sp. в качалочных колбах (Na2HPO4 = 4,0 г/л, KH2PO4 = 3,0). Так как отдельно стоял вопрос установления оптимальной концентрации фосфатсодержа-щего субстрата в условиях культивирования в ферментере, опыт проводили с повышенным значением Sop Na2HPO4 = 4,67 г/л, KH2PO4 = 3,50 г/л. В результате исследований наблюдается ухудшение кинетических характеристик роста по сравнению с полученными ранее [4] при базисном значении Sор (рис. 1).
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8
Рис. 1. Зависимость максимальных значений кинетических параметров от начальной концентрации фосфатов. 1 ч-1;
2 - хш, г/л; 3 - .ткш, мкг/г-ч
Все названные выше параметры достигали своего максимума именно при базисном значении Бор. Во всех экспериментах лимитирования фосфатом не было ни одного случая снижения его остаточного количества до нулевого значения, хотя уменьшение Бор во всех опытах сопровождалось значительными изменениями развития клеточного метаболизма, сокращались темп и интенсивность развития популяции, что выражалось в значительном понижении накопленного количества сухой биомассы Хм, тогда как содержание каротиноидов в биомассе не так резко уменьшалось. Вышесказанное можно понять, если учесть, что максимальное значение удельной скорости роста полностью определяется начальной концентрацией углеродсодержащего (основного) субстрата и не зависит от текущей концентрации [6], что связано с накоплением микроорганизмами основного субстрата.
Зависимость дм от Бор указывает на важность фосфатов для роста микробной культуры, что не уди-
Х
Х
9
8
3
7
0.1
6
2
5
4
0.05
3
2
0
0
0
вительно, так как фосфор играет весьма важную роль в развитии энергетического метаболизма клетки.
Во всех экспериментах лимитирования фосфатом прослеживается одна закономерность: на начальной стадии развития культуры усвоение фосфатов не происходит. Затем идет интенсивное потребление, и достигнутый вследствие этого процесса уровень остаточного количества фосфата сохраняется в среде до конца культивирования.
Почти во всех случаях период активного потребления фосфатов совпадает с фазой замедления роста культур и интенсивного синтеза каротиноидов. Предполагаем, что для объяснения вышеописанной закономерности надо учесть следующее обстоятельство. Когда инокулюм, в котором в основном находятся голодающие по энергетическому субстрату (глюкоза, сахароза) клетки, попадает в свежую среду ферментера с избыточным количеством субстратов, развитие клеточного метаболизма происходит предпочтительнее в сторону энергетического типа, который ведет к быстрому возрастанию внутриклеточного пула АТФ, выполняющего роль связующего звена между типами метаболизма энергетического и конструктивного [7]. Как правило, в наших экспериментах первую пробу брали через 15-20 мин после засева инокулюма, когда считалось, что культуральная среда с помощью перемешивания становится максимально гомогенной. Поэтому первое снижение концентрации фосфатов нами не фиксируется ввиду их быстрого усвоения. В результате получаем вышеописанную картину.
Сравнение кривых (рис. 1) дает информацию, которую вкратце можно получить из следующих зави-
- и
- 1.4
. и 1,2 1.1 1,0 0,9 0.8 0.7
" 0.6
- 0S
t, ч
симостей: ^ (Sop), Хм (Sop) и Хкм (5ор), более зительный экстремум имеют дм (Sop) и Хм (Sop).
Графики 1 и 2 явно отличаются от графика 3 как по экстремуму, так и по лимитированию роста фосфатами. Это означает, что наблюдается явное различие в зависимости от начальной концентрации фосфата между двумя процессами, ростом клеточной биомассы и синтезом каротиноидов, которое в новом ракурсе подтверждает ранее нами высказанное мнение о разобщенности по времени этих двух процессов, и, что биосинтез каротиноидов относится к сфере вторичного ме-табоВшвмтояЩее время хорошо известно, что синтез многих биологически активных веществ микроорганизмами начинается после исчерпания каких-либо источников в среде [8-10]. Однако благодаря наличию в среде остальных компонентов питания часть процессов биосинтеза продолжается, но при этом метаболизм клетки приводит к синтезу уже новых веществ, называемых веществами 2-й фазы роста.
Как уже отмечалось выше, каротиноиды тоже относятся к веществам 2-й фазы роста. Если лимитирование фосфатом действует как подавляющий фактор роста Rhodococcus sp. и соответственно уменьшается, то его воздействие на процесс каротиногенеза нельзя считать непосредственным, хотя лимитирование фосфатом действует как отрицательный фактор.
Динамика процессов усвоения углеродсодержащих субстратов (глюкоза, сахароза), фосфата, роста биомассы и каротиногенеза при различных концентрациях фосфата приведена на рис. 2, 3 .
Si
Si
- 1.0 - 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
О 10 20 30 40 50
б
во 90 100
t, ч
S„
t, ч
Рис. 2. Усвоение сахаров и фосфата периодической культурой КЬо<!ососсш 8р. при разной концентрации РО34. 1 - глюкоза, г/л; 2 - сахароза, Б2, г/л; 3 - концентрация ионов РО34, Бр, г/л
Si
S
Si
а
Si
S
р
в
г
VK 1-1
Х
Хк
200
. 150 100
50
- 40
- 30
20 10 0
Х
Vk
Хк - 140
120
100
80
4 - 60
3 40
2 20
1 . 10
0
0
О 10 20 30 40 50 60 70
О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
а
Хк
10 20 30
40 50
в
60 70 80 90 100
Рис. 3. Динамика роста и развития КЬо(!ососсш Бр. на глюкозо-сахарозной среде при лимитировании фосфатами.
1 - сухая биомасса, X, г/л; 2 - удельная скорость роста, ¡х, ч"1; 3 - общее количество каротиноидов, Хк, мкг/г;
4 - скорость синтеза каротиноидов, Ук, мкг/(г-ч)
Как известно, с точки зрения наиболее полного описания физиологического состояния микроорганизмов и по воспроизводимости результатов из кинетических характеристик бактериальных культур особенно выделяется удельная скорость роста д . Поэтому мы рассматривали влияние экспериментально выявленных закономерностей на динамику изменения удельной скорости роста биомассы (рис. 3). Первое, что сразу можно заметить, это два пика на графике д(Г). Ясно, что они соответствуют периодам активного усвоения глюкозы, а потом сахарозы клетками. Вслед за понижением Бор 2-й пик приближается к 1-му, что соответствует смещению момента начала вышеописанного процесса утилизации сахарозы в зависимости от уровня лимитирования фосфатом.
Для описания общей картины усвоения углеродсо-держащих субстратов рассчитывали метаболический и экономический коэффициенты по общему количеству усвоенных сахаров. Сравнение этих результатов показывает, что коэффициенты q и у претерпевают резкие колебания как в разных опытах, так и в течение одного
культивирования. Между тем зависимость максимального значения этих коэффициентов от Бор имеет максимум при значениях Бор чуть ниже базисного. Во всех опытах лимитирования фосфатом экономический коэффициент значительно ниже, чем теоретически допустимое максимальное значение (75 %). Это явление еще раз доказывает, что лимитирование фосфатами приводит периодическую культуру ИИо^соссш Бр. в неблагоприятное физиологическое состояние, откуда следует ухудшение метаболических и экономических показателей культуры.
Литература
1. Паников Н.С. и др. // Успехи микробиологии. 1989. № 23.
С. 23.
2. Дараселия Г.Я. // Микробиология. 1982. Т. 51. Вып. 6.
С. 968.
3. Дараселия Г.Я. // Методы биохимических исследований
растений. Тбилиси, 1983. С. 92.
4. Дараселия Г.Я. и др. // Микробиология. 1989. Т. 58. Вып. 4.
С. 596.
V
б
5. Баславская Л.Д., Трубецкова И.Н. Практикум по физио-
логии растений. М., 1964.
6. Уенг Д. и др. Ферментация и технология ферментов. М.,
1983.
7. Перт C.Дж. Основы культивирования микроорганиз-
мов и клеток. М., 1978.
8. Ткаченко А.Г. // Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 2.
С. 553.
Астраханский государственный технический университет,
Институт биотехнологий НАНГрузии_22 июня 2007 г.
9. Чемерис Н.А. и др. // Микробиология. 1989. Т. 58. Вып. 4.
С. 579.
10. Штоффер Л.Д. и др. Ферментация. Рига, 1974. С. 31.
11. Miles R.J., Pirt S.J. // J. Gen. Microbiol. 1973. Vol. 76.
Р. 305.
12. Demain A.L. // Ann. Rev. Microbiol. 1972. Vol. 26. P. 369.
