CC BY
41
УДК 579.66
A. А. Шараева (асп.), Н. И. Петухова (к.биол. н., доц.),
B. В. Зорин (д.х.н., проф., зав. каф., чл.-корр. АН РБ)
Исследование условий синтеза экзополимера S- диссоциантом актинобактерий Rhodococcus sp. USPTU-21
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
A. A. Sharaeva, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Research of exopolymer synthesis conditions by S-dissociant of actinobacterium Rhodococcus sp. USPTU-21
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
Показано, что 5-диссоциант культуры КЬойо-соссиэ эр. иБРТи-21, способной осуществлять энантиоселективную биотрансформацию рацемического 6-бензилокси-2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана в 5-(—)-6-бензилокси-2(2-гид-роксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхроман — перспективный синтон природных цитопротекторов, таких как а-токоферол ((2К,4'К,8'И)-6-гидро-кси-2,5,7,8-тетраметил-2-(4',8',12'-триметилтри-децил)хроман) и а-токотриенол ((2И)-6-гидро-кси-2,5,7,8-тетраметил-2-(4' ,8' ,12'-триметилтридека-3',7',11'-триенил)-хроман), а также их синтетического аналога МЭЬ-73404, синтезирует внеклеточный полимер, обладающий флокулирую-щей активностью. Установлено, что в качестве источника углерода для синтеза полимера может быть использован глицерин в концентрации 3—5 %. Показано, что активный синтез полимера начинается в фазе замедления роста культуры и достигает максимального выхода в стационарной фазе. Обнаружено, что синтез полимера зависит от концентрации дрожжевого автолизата и уровня фосфатов в среде.
Ключевые слова: биофлокулянты; микроорганизмы; КЬойососсш; экзополимеры.
It is shown that S-dissociant of Rhodococcus sp. USPTU-21, capable to provide an efficient biotransformation of racemic 6-benzyloxy-2(2-acetoxyethyl)-2,5,7,8-tetramethylchroman into S-( — )-6-benzyloxy-2(2-hydroxyethyl)-2,5,7,8-tetramethylchroman — the perspective synthone of natural cytoprotectors such as a-tocopherol ((2R,4'R,8'R)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2-(4',8',12'-trimethyltridecyl)chroman, R-3) and a-tocotrienol ((2R)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2-(4',8',12'-trimethyltrideca-3',7',11'-trienyl)-chroman) and their analogue MDL73404, is able to produce an extracellular polymer with floculating activity. It is found that glycerol in concen-trations between 3 and 5 % may be used as a carbon source for polymer synthesis. It is revealed that the active stage of polymer synthesis begins in the culture growth suppression stage and achieve its maximum at stationary phase of growth. It is found that polymer synthesis depends on yeast extract and phosphates contents in the medium.
Key words: microorganisms; Rhodococcus; exopolymer; biofloculant.
Растущие требования к экологической безопасности производств определяют высокий интерес к использованию природных полимеров в качестве биосорбентов, флокулянтов и деэмульгаторов в технологиях очистки водоемов сточных вод, а также в процессах концентрирования клеточных суспензий и других биоколлоидов 1'2.
Несмотря на многообразие описанных в литературе биополимеров, продолжается поиск новых более эффективных соединений и
Дата поступления 2.11.12
их продуцентов 1, способных расти и синтезировать продукты на основе недорогого доступного сырья 3-7, в частности, на базе глицерина — отхода производства биодизеля 4-7.
Ранее было обнаружено, что 5-диссоциант культуры КНойососсш эр. иБРТи-21, способной осуществлять энантиоселективную биотрансформацию рацемического 6-бензилокси-2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана (гас-1) в 5-( — )-6-бензилокси-2(2-гидрокси-этил)-2,5,7,8-тетраметилхроман (5-2) 8 — перспективный синтон природных цитопротекто-ров, таких как а-токоферол ((2Я,4' Я,8' Ю-6-
гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-2-(4',8',12' -три-метилтридецил)хроман, Я-3) и а-токотриенол ((2 Я )-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-2-(4',8/,12/-триметилтридека-3',7/,11/-триенил)-хроман, Я-4), а также их синтетического аналога МЮЬ-73404 (5-5), обладающего антиоксидант-ной активностью 9, синтезирует внеклеточный полимер в процессе роста на среде ГРМ, содержащей гидролизат рыбной муки и глицерин (1%) 10 (схема 1).
Показано, что экзополимер способен увеличивать агрегацию нефти и адгезию к ней клеток Я-диссоцианта ЯНойососсиэ эр. иБРТи-21, не способного синтезировать внеклеточный полимер, а также ряда других микроорганизмов, выделенных из образцов почв, загрязненных нефтью 10. Это позволяет полагать, что он может быть перспективен для интенсификации процессов биодеструкции нефти аборигенной или интрадуцированной микрофлорой, поскольку адгезия микроорганизмов является начальным этапом процесса деградации нефти 11.
В настоящей работе при исследовании влияния экзополимера на процесс осаждения каолина обнаружено, что он проявляет высокую флокулирующую активность (более 90%) и может рассматриваться как перспективный биофлокулянт.
С целью разработки эффективного метода получения экзополимера 5-диссоцианта ЯЬойо-соссиэ эр. иБРТи-21 был исследован рост продуцента и синтез целевого продукта на питательных средах с различным содержанием источника углерода, органических добавок и фосфат-ионов.
В результате исследования роста актино-бактерий при 28—30 оС в течение 9 сут на ми-
неральной среде МС (ЫаМ03 — 0.3%, М^804-7Н20 - 0.03%, КН2Р04 - 0.03%, агар-агар — 1.5%, дистиллированная вода — 1000 мл), содержащей в качестве источника углерода глицерин (1%) было обнаружено, что в этих условиях они не растут. Однако, добавление дрожжевого автолизата в минеральную среду в концентрации 0.1—1.0 % стимулирует рост бактерий и синтез экзополимера (рис. 1), что указывает на потребность продуцента в органических ростовых факторах. Наибольший выход биомассы с одной чашки Петри был достигнут на среде с 1% дрожжевого авто-лизата и составил около 1.2 г (по сырому весу).
1,4 > 100
1,2 ' 90
и 80
1 - 70
о а г 0,8 60
о и - 50
ю ч 0,6 40
§ 0,4 - 30
га 20
0,2 10
0 ¿—о-о - 0
О ь й о
:5 я ч
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Дрожжевой автолизат, %
Рис. 1. Выход биомассы и экзополимера при росте З-диссоиионта культуры Нко^соссш sp. иБРТи-21 при 28—30 оС на среде МС с различным содержанием дрожжевого автолизата в течение 9 сут
При культивировании 5-клеток ЯНоёососсиэ эр. иБРТи-21 в тех же условиях (при 28— 30 оС, 9 сут) на среде ГРМ с глицерином (1%),
содержащей в качестве органической добавки гидролизат рыбной муки (1.2%), был достигнут более высокий выход биомассы — 1.6 г (рис. 2). Исследование динамики выхода биомассы и полимера в процессе культивирования бактерий на данной среде в течение 11 сут показало, что биосинтез экзополимера начинается в фазе замедления роста культуры и достигает максимального выхода в конце культивирования (рис. 2).
1,6
1,2 -
0,8 -- -/---А------
0,4 - -,
-биомасса - полимер
0 2 4 6 8 10 12 Время, сут
Рис. 2. Динамика выхода биомассы и полимера при росте З-диссоцианта НЬоЫососсш sp. иЗРТи-21 при 28—30 оС на среде ГРМ, содержащей 1% глицерина
Наибольший выход полимера на среде ГРМ с глицерином (1%), составляет около 0.8 г (по сырому весу), т.е. около 50% от общей массы клеток.
Обнаружено, что в отсутствие глицерина выход биомассы через 3 сут культивирования достигает не более 40% от уровня, полученного в присутствии 1% этого источника углерода (рис. 3). Напротив, увеличение содержания глицерина в среде с 1 до 5% приводит к приросту биомассы почти на 60%.
1,8 1,6 1,41,210,8 0,6 0,40,20
о К
м
0 1 2 3 4 5 Глицерин, %
Рис. 3. Выход биомассы при росте З-диссоцианта ИкоЫососсш sp. иЗРТи-21 при 28—30 оС на среде ГРМ с различным содержанием глицерина в течение 3 сут
Также установлено, что выход полимера через 9 сут культивирования на среде ГРМ с 5% глицерина в 2.7 раза превышает этот параметр при использовании среды с 1% глицерина.
Обнаружено, что уровень фосфатов в среде также оказывает существенное влияние на процессы роста биомассы и синтеза полимера Б-диссоциантом ЯНойососсиэ эр. иБРТи-21. При культивировании бактерий на среде ГРМ, содержащей 1% глицерина, в присутствии 0.1% КН2Р04 в течение 3 сут было получено в 6 раз меньше биомассы, чем на среде без дигидро-фосфата калия (рис. 4). При этом установлено, что на среде с добавлением 0.1% КН2Р04 полимер не синтезируется. Небольшой инги-бирующий эффект фосфатов на рост культуры наблюдается также при использовании для культивирования минеральной среды МС, содержащей 0.1% дрожжевого автолизата и 1% глицерина (рис. 4).
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
среда МС, содержащая 1% глицерина и 0,1 % дрожжевого автолизата 1 среда ГРМ, содержащая 1% глицерина
III II
0 0,03 0,06 0,08 0,1 Дигидрофосфат калия,%
Рис. 4. Выход биомассы З-диссоцианта актинобак-терий ИЬоЫососсш sp. иБРТи~21 при культивировании при 28—30 оС в течение 3 сут на среде МС с дрожжевым автолизатом (0.1%) и среде ГРМ в присутствии 1% глицерина и различных концентраций дигидрофосфата калия
Таким образом, подобраны условия эффективного синтеза экзополимера Б-диссоци-антом актинобактерий ЯЬойососсиэ эр. иБРТи-21 на среде, содержащей в качестве источника углерода глицерин и с добавлением органических добавок.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали в чашках Петри при 28—30 оС в течение 3—11 сут на ага-ризованном панкреатическом гидролизате рыбной муки ГРМ (35 г/л) производства ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, и минеральной среде МС следующего состава:
2
0
0
ЫаМ03 - 0.3%, MgSO4•7H2O - 0.03%, КН2Р04 — 0.03%, агар-агар — 1.5%, дистиллированная вода — 1000 мл. В обеих средах в качестве источника углерода использовали глицерин (1—5 %). Выращенную биомассу собирали с поверхности среды. Выход биомассы с одной чашки Петри оценивали весовым методом.
Выделение экзополимера. Биомассу микроорганизмов суспендировали в 0.05 М фосфатном буфере и выдерживали суспензию клеток при 60 оС в течение 10 мин, после чего удаляли клетки центрифугированием при 8 тыс. об/мин в течение 15 мин. Для осаждения экзополимера к супернатанту добавляли ацетон (кратность растворителя 3:1). Осадок отделяли центрифугированием при 8 тыс. об/мин в течение 15 мин. Полученный препарат высушивали на воздухе при комнатной температуре. Выход полимера, полученного из биомассы, собранной с одной чашки Петри, оценивали весовым методом.
Определение флокулирующей активности проводили по модифицированному методу, описанному в работе 12. К 10 мл суспензии каолина (10 г/л) добавляли 0.6 мл 1% раствора хлорида кальция и 0.1 мл раствора экзополимера (50 мг/мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре, отстаивали в течение 10 мин и измеряли оптическую плотность верхней фазы суспензии на спектрофотометре «Спекол» при 0Э540. В качестве контроля использовался аналогично приготовленный раствор без добавления экзополимера.
Флокулирующую активность рассчитывали по формуле:
ФА __контроль пробы 100%
_ оБ~~. 0
Литература
1. Багаева Т. В., Зинурова Е. Е. // Ученые записки Казанского государственного университета. Книга 2.- 2008.- Т.150.- C.8.
2. Братская С. Ю. // Владивосток: Вестник ДВО.-2006.- №5.- С.47.
3. Fujita M., Ike M., Jang J. H., Kim S. M., Hirao T. // Water Sci. Technol.- 2001.- №44.- P.237.
4. Jung H., Jeong J., Lee O., Park G., Kima K., Park H., Lee S., Kima Y., Son H. // Bioresource Technology.- 2010.- №101.- P.3602.
5. Dua G., Yanga G., Qub Y., Chena J., Luna Sh. // Process Biochemistry.- 2005.- №40.- P. 2143.
6. Paulo da Silva G., Mack M., Contiero J. // Biotechnology Advances.- 2009.- №27.- P.30.
7. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // Российский химический журнал им. Д. И. Менделеева.- 2011.- Т.55, №1.- С.77.
8. Хабибуллина И. И., Сучкова Е. В., Петухова Н. И. и др. Интенсификация биокаталитических методов получения оптически активных синтонов a-токоферола // Химия и медицина: материалы II Всерос. науч. конф.- Уфа, 2005.- С.166.
9. Coffen D. L., Cohen N., Pico A. M., Schmid R., Sebastian M. J., Wong F. // Chem Inform.-1995.- V.26.- Р.26.
10. Шараева А. А., Петухова Н. И., Федорова В. В., Зорин В. В. // Нефтегазовое дело.- 2012.-Т.10, №3.
11. Рубцова Е. В., Куюкина М. С., Ившина И. Б. // Прикадная биохимия и микробиология.-2012.- №5.- C.501.
12. Liu W., Wang K., Li B., Yuan H., Yang J. // Bioresource Technology.- 2010.- №101.-P.1044.
где ФА — флокулирующая активность;
ОD контроль — оптическая плотность, измеренная для контрольной пробы;
ОD пробы — оптическая плотность, измеренная для анализируемой пробы.
