CC BY
57
© НА Муфазалсва, ЗА Ахметченко, 2006 Ш 612.017.1:547,963
Н.А. Муфазалова, З.А. Ахметченко ВЛИЯНИЕ ВИТАМИНА Е, ТАКТИВИНА И ИХ КОМБИНАЦИИ НА МОНООКСИГЕНАЗНУЮ СИСТЕМУ ПЕЧЕНИ ИНТАКТНЫХ КРЫС И В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИИ ХЛОРФЕНОКСИГЕРБИЦИДОВ
Башкирский государственный медицинский университет, Уфа
В статье оценено состояние монооксигеназной системы печени у крыс при подострой интоксикации гербицидом 2,4-ДА и характер изменения содержания цитохромов Р450и некоторых моноооксигеназных активностей в условиях применения витамина Е и Тактивина. Врезультате исследования установлено, что витамин Е, Тактивин и их комбинация изменяют конституитивные активности цитохром Р450зависимыхмонооксигеназ в печени имонооксигеназные активности в условиях интоксикации гербицидом 2,4-ДЛ. Введение гербицида 2,4-ДА вызывает резко выраженную индукцию моноокси-генирования, витамин Е и Тактивин препятствуют индукции, при этом больший эффект наблюдается при индивидуальном применении витамина Е.
Ключевые слова: хлорфеноксигербициды, монооксигеназная система, витамин Е, Тактивин.
N.A. Mufasalova, Z.A. Akhmetchenko VITAMIN E, TACTTVIN AND THEIRCOMBINATION INFLUENCE ON INTACT RATS
LIVER MONOOXIGEN SYSTEM IN CONDITIONSOFCHLORFENOXYGERBICIDES
TOXICAL INDUCTION
The author of the article considers the Monoxygenized activity system state of rats' liver under long influence of 2,4-Diclorfenoxygerbicides and the dependence of the data changing of450 and some Monoxygenized activities after Vitamin E and Taktivine application.
It was investigated that the Vitamin E and Taktivine application change cytochromes activities of450 depended Monoxygenized in rats' liver.
So the 2,4-Dichlorfenoxygerbicides injections provokes the strongly expressed induction of Monoxygenized activity but the Vitamin E and Taktivin application prevent the same induction, the greater effect takes place, when vitamin E is used individually. Key words: clorfenoxygerbicides, Monoxygenized activity system, Vitamin E, Taktivine.
Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы являются мембраносвязанными ферментами, которые обеспечивают биотрансформацию различных химических соединений путем внедрения активированного кислорода в их молекулу, что приводит к образованию окисленных, гидрофильных, легкоэк-скретируемых метаболитов и молекулы воды [3, 13,14, 22].
Этап окисления цитохромами называется I фазой биотрансформации. Гидроксилированные, гидрофильные метаболиты, затем элиминируются из организма непосредственно или с помощью ферментов II фазы биотрансформации (сульфотранс-феразы, глюкуронилтрансферазы и др.) [8].
Нередко, наряду с высокоэффективной детоксикацией ксенобиотиков, возможна их метаболическая биоактивация в процессе монооксигенирова-ния, что приводит к образованию высокотоксичных и реакционноспособных метаболитов, а также возможность "утечки" реактивных интермедиатов кислорода в процессе монооксигенирования. Эти продукты биотрансформации вызывают повреждение редокс-чувствительных внутриклеточных белков, связываются с нуклеиновыми кислотами [22].
Одно из основных свойств цитохром Р450-зави-симых моноокисгеназ является способность к индукции, то есть в адаптивном увеличении содержания гемопротеида соответствующих изоформ в присутствии субстратов, что приводит к ускорению метаболизма этого субстрата. Механизмы индукции различны и реализуются на генетическом уровне [15, 17, 19, 25, 26].
Индукция определенных изоформ цитохромов у живых организмов является "маркерным" процессом загрязнения окружающей среды различными ксенобиотиками [5, 6, 22]. В этой связи представляло интерес оценить состояние монооксиге-назной системы печени у крыс при длительном воздействии гербицида аминной соли 2,4 - дихлор-феноксиуксусной кислоты (2,4-ДА) и характер изменения содержания цитохромов Р450 и некоторых монооксигеназных активностей в условиях применения витамина Е и Тактивина.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на 50 белых неинб-редных половозрелых крысах самцах массой 180200 г. В каждой серии опытов все животные были разделены на 8 групп по 5 животных в каждой. Первая группа - контроль (интактные животные), вторая группа получала токоферол, третья - Такти-вин, четвертая - витамин Е и Тактивин, пятая - токсикант (2,4-ДА), шестая - токсикант и токоферол, седьмая - токсикант и Тактивин, восьмая - токсикант (2,4-ДА), витамин Е и Тактивин.
Токоферол (30% раствор токоферола ацетата, ОАО "1СК Марбиофарм", РФ, Йошкар-Ола) вводили внутрижелудочно на оливковом масле в течение 7 дней (самостоятельно - вторая группа или после окончания введения токсиканта - шестая группа) в оптимальной иммуноактивной дозе - 50 мг/кг [11]. Тактивин 0,01% раствор для инъекций (АООТ "Би-омед" им. И.И.Мечникова) разводили в физиологическом растворе хлористого натрия и вводили также (самостоятельно - третья группа или после
окончания введения токсиканта - седьмая группа) ежедневно внутримышечно в течение 7 дней в дозе 0,25 мг/кг [12]. Токсикант (2,4-ДА) с помощью специального зонда вводили внутрижелудочно. Был использован коммерческий препарат гербицида, содержащий диметиламинные соли 2,4-Д - 50%, хлорфенолы - около 2%, в том числе 2,4-дихлорфе-нол - 0,25% и другие хлорорганические соединения - около 1,5%, включая диоксины в средней концентрации 30 нг/кг, в том числе ТХДД - 1 нг/кг (по данным лаборатории Уфимского АО "Химпром"). Подострое отравление моделировали ежедневным внутрижелудочным введением 2,4 ДА в дистиллированной воде в течение 28 дней в дозе 42 мг/кг, что соответствует суммарной дозе 1200 мг/кг, то есть ЛД50 [4,10]. Контрольные животные получали оливковое масло или дистиллированную воду внутрижелудочно в том же объеме, что и при введении соответствующих препаратов.
Для оценки монооксигеназных активностей использовалась субмитохондриальная фракция печени (12000 g - гомогенаты или 812-фракция), которая адекватно заменяет очищенные микросомы при определении монооксигеназных активностей [21, 24]. Все процедуры получения S12 - фракции производили на холоде (при 14°С). Навеску органа помещали в 50 mM TRIS-HC1 буфер (рН 7.4), содержащий 1,15% КС1. Соотношение "масса навески : буфер" составляло 1 : 10 (вес : объем). Далее навеску печени гомогенизировали в тефлоновом гомогенизаторе (3000 об/мин, 3 мин). Гомогенат центрифугировали на центрифуге JUAN K23 с угловым ротором в режиме 12000 g, 20 мин, t 4°C. Супернатант (S12 - фракцию) переносили в пластиковые пробирки (Eppendorf) и хранили при t - 70°С. Содержание белка в 812-фракции оценивали, используя метод Брэдфорда и стандартный набор для определения белка ProteinAssay Kit (BioRad). Калибровку осуществляли по раствору бычьего сывороточного альбумина.
Определение бензилоксирезоруфин-О-дебензи-лазной (БРОД) активности. БРОД-активность скорее всего, отражает суммарную активность изоформ подсемейств CYP2B и CYP3A и в незначительной мере CYP1A1/2. Постановку реакции де-бензилирования бензилоксирезоруфина осуществляли по методу Burke M. [1985]. Реакционная система общим объемом 1 мл содержала 50 тМ КР04 буфер (рН 7.4), 3 тМ MgCb, 1 nmol 7-этокси-резоруфина (Sigma) и 0.5 -1 мг белка 812-фракции, содержание субстрата в реакционной среде составило 2.5 М. Реакцию инициировали добавлением
0.25 mol НАДФ*Н (Sigma). Пробы инкубировали на шейкер-бане (Juan) при 137°C в течение 45 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 мл ледяного метанола, затем центрифугировали. Содержание резоруфина в супернатанте оценивали флюорометрически на флюориметре VERSA FLUOR 1.3 (BioRad) при длине волны возбуждения флюоресценции 546 нм, эмиссии - 590 нм. Количество обра-
зовавшегося резоруфина рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору резоруфина (Sigma).
Определение дибензилфлюоресцеин-дебензи-лазной (ДБФД) активности. Биотрансформация ди-бензилфлюоресцеина осуществляется изоформами цитохрома Р450 подсемейства CYP2C и частично CYP3A [27, 28]. Реакцию осуществляли по методу, описанному D. Stresser и соавт. [27]. Реакционная система общим объемом 1 мл содержала 50 тМ КР04 буфер (рН 7,4), 3 тМ MgCb, НАДФ*Н-гене-рирующую систему (6,6 тМ глюкозо-6-фосфата (Sigma), 0,8 Ш глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Sigma), 2,6 mM НАДФ (Sigma)) и 0,5 - 1 мг белка 812-фракции. Количество образовавшегося флюо-ресцеина рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору флюорес-цеина (Fluka).
Определение р-нитрофенол-гидроксилазной (ПНФГ) активности производили по методу, описанному P.-G. Forkert и соавторами. Реакционная система общим объемом 1 мл содержала 50 тМ КР04 буфер (рН 6,8), 5 тМ MgCb, 1 тМ аскорбиновой кислоты, 1,5 mM EDTA (Merck), НАДФ*Н-генерирующую систему (7,5 тМ глюкозо-6-фосфа-та (Sigma), 2 IU глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Sigma), 0,4 mM НАДФ (Sigma)) и 0.5 - 1 мг белка 812-фракции. Количество образовавшегося 4-нит-рокатехола рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору нит-рокатехола (Sigma).
Статистическую обработку результатов проводили в рамках пакета статистической программы Statistica для Windows, версия 6. Различия считали достоверным при уровне значимости р <0,05.
Результаты и обсуждение
Характер изменения бензилоксирезоруфин-О-деэтилазной активности (БРОД-активности), реализуемой несколькими изоформами цитохром Р450-зависимых монооксигеназ (CYP2B и в незначительной мере CYP1A1) был следующий. Витамин Е вызывал статистически значимую, в сравнении с контрольной группой животных (PLSD=0.03), индукцию монооксигеназной активности (интенсивность монооксигенирования возрастала на 38 % ), что соответствовало данным, полученным в исследовании Н.А Муфазаловой [9]. Эффект индукции отсутствовал при комбинированном использовании витамина Е и Тактивина. Длительное введение 2,4-ДА не вызывало статистически значимой индукции БРОД-активности в сравнении с интакт-ными крысами, прослеживалась лишь тенденция к ее нарастанию (PLSD=0,09). Эта тенденция исчезала при совместном использовании 2,4-ДА с витамином Е и Тактивином, но при комбинированном введении 2,4-ДА, витамина Е и Тактивина вновь наблюдалась статистически значимая, в сравнении с контрольной группой, индукция метаболизма бен-зилоксирезоруфина в печени (PLSD=0,005).
Интересные закономерности были получены
при анализе СУР2Е1-зависимого гидроксилирова-ния р-нитрофенола. Витамин Е, а также Тактивин при изолированном введении существенно не изменяли ПНФГ-активности. Комбинированное же их применение приводило к существенному ее угнетению как в сравнении с контрольной группой (РЬ8Б=0,007), так и в сравнении с группами, получавшими только витамин Е (РЬ8Б=0,001) или только Тактивин (РЬ8Б=0,036). Введение 2,4-ДА не изменяло СУР2Е1-зависимого монооксигенирования, что свидетельствует о том, что данная изоформа не принимает участие в ее биотрансформации. В то же время при совместном введении 2,4-ДА нивелировал ингибиторные эффекты комбинации витамина Е и Тактивина на эту изоформу.
При анализе метаболизма дибензилфлюоресце-ина была установлена мощная, почти трехкратная индукция ДБФД-активности в субмитохондриаль-ной фракции печени крыс, получавших 2,4-ДА, что отражает адаптивное возрастание активности тех семейств изоформ цитохрома Р450 (СУР2С и СУР3А), которые участвуют в метаболизме данного ксенотоксиканта. Полученные результаты согласуются со сведениями об активирующем воздействии 2,4-ДА и ее производных на систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ [7], однако сведения об "изоформном спектре" индуцируемых изоформ крайне малочисленны. Следует подчеркнуть, что появление токсических метаболитов в большей степени связано с механизмами арилугле-водородзависимой индукции, чрезмерная же активация СУР3А и СУР2С также весьма нежелательна для организма [5, 6, 25]. Витамин Е и Тактивин, а также их комбинация существенно не изменяли интенсивности биотрансформации дибензилфлюо-ресцеина, в то же время статистически значимо препятствовали 2,4-ДА-опосредованной индукции. Так, ДБФД-активность возрастала в группе животных, получавших 2,4-ДА, на 283% (РЬ8Б=0,0009 В сравнении с контрольной группой); в группе животных, получавших 2,4-ДА и витамин Е, ДБФД-активность возрастала на 71%, РЬ8Б=0,0006 в сравнении с группой крыс, получавших только 2,4-ДА). В группе животных, получавших 2,4-ДА и Тактивин, ДБФД-активность возрастала на 141 % (РЬ8Б=0,014, в сравнении с группой крыс, получавших только 2,4-ДА). В группе животных, получавших 2,4-ДА, витамин Е и Тактивин, ДБФД-ак-тивность возрастала на 154 % (РЬ8Б=0,023, в сравнении с группой крыс, получавших только 2,4-ДА).
Интерпретация полученных результатов довольно сложна. В литературе результаты анализа влияния Тактивина на монооксигеназы печени представлены лишь в ранних работах В.Я. Ариона [1,2]. При этом как и в наших экспериментах отмечается неоднозначное его влияние: Тактивин на фоне бензольной интоксикации в зависимости от условий эксперимента был способен как восстанавливать ферментативную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, так и угнетать ее,
по-разному воздействовать на цитохром Р450-зави-симые монооксигеназы нормальных животных и животных-гнотобиотов. Важно иметь в виду, что эффект Тактивина, который является иммунологически активным пептидом, может быть связан с активацией продукции ряда цитокинов. Последние, в свою очередь, являются ключевыми эндогенными регуляторами монооксигенирования [14]. Более изученным представляется влияние витамина Е, который способен препятствовать свободнорадикальному повреждению тканей, связанному с индукцией некоторых изоформ цитохрома [18, 23]. С другой стороны, антиоксиданты снимают репрессию генов некоторых изоформ [20] и способны стабилизировать активность монооксигеназ, которая в значительной мере зависит от состояния фосфоли-пидного слоя мембран [19]. Разноплановый характер влияния витамина Е, Тактивина и их комбинации как на конституитивные изоформы, так и в условиях воздействия 2,4-ДА неудивителен, поскольку различные изоформы цитохром Р450-зависимых монооксигеназ имеют индивидуальные механизмы регуляции монооксигенирования и транскрипции генов [15, 19, 25, 26]. Наиболее существенной представляется способность витамина Е, Тактиви-на и их комбинации уменьшать вызванную 2,4-ДА индукцию монооксигенирования, что в конечном счете способствует уменьшению токсического воздействия гербицида.
Влияние 2,4-ДА, витамина Е, Тактивина и их комбинаций на монооксигеназные активности в печени крыс иллюстрирует рисунок.
Выводы
Таким образом, витамин Е, Тактивин и их комбинация изменяют конституитивные активности цитохром Р450-зависимых монооксигеназ в печени и монооксигеназные активности на фоне введения 2,4-ДА, причем эффекты их неоднозначны:
- Витамин Е повышает конституитивную
Рис. Изменение некоторых цитохром Р450-зависимых мо-нооксигеназных активностей в печени крыс при введении витамина Е, Тактивина, 2,4-ДА и их комбинаций. По оси ординат: значения ферментативных активностей в % от контрольных значений (100%) (М±доверительный интервал для =0,95). По оси абсцисс: 1- контрольная; 2-витамин Е; З-Тактивин; 4- витамин Е + Тактивин; 5 - 2,4-ДА; 6 - 2,4-ДА + витамин Е; 7-2,4-ДА + Тактивин; 8-2,4-ДА + витамин Е+Тактивин.
СУР2В-зависимую монооксигеназную активность в печени, Тактивин не изменяет ее, но устраняет активирующий эффект витамина Е; 2,4-ДА не изменяет БРОД-активность; на фоне гербицида устраняется индуцирующий эффект витамина Е, но при введении комбинации витамина Е и Тактивина на фоне 2,4-ДА наблюдается индукция активности,
- Витамин Е и Тактивин не изменяют конститу-итивное СУР2Е1-зависимое монооксигенирова-ние, а в комбинации угнетают его; на фоне введения 2,4-ДА ингибиторный эффект комбинации ви-
тамина Е и Тактивина нивелируется,
- Витамин Е и Тактивин, а также их комбинация не влияют на СУР2С-зависимую монооксигеназную активность; введение 2,4-ДА вызывает резко выраженную индукцию монооксигенирования, причем витамин Е и Тактивин препятствуют индукции, при этом больший эффект наблюдается при индивидуальном применении витамина Е.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арион В.Я. Изменение некоторых иммунологических и биохимических параметров под действием Т-активина у безмикробных животных // Бюлл. экспер. биол. Мед.- 1987.- №7.-С 332 - 334.
2. Арион В.Я., Хроменков Ю.И., Тагирова А.К. Влияние Т-активина на ферменты метаболизма ксенобиотиков // Вопр. мед. химии.- 1987.- №6.- С. 56 - 59.
3. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. -М.: Наука, 1975.- 240 с.
4. Буслович С. Ю. Влияние на организм гербицидов - хлорпроизводных феноксиуксусной кислоты// Здравоохр. Беларуси.- 1963.- № 9.- С. 41-45.
5. Гуляева Л.В., Гришанова А.Ю., Громова О.А и др. Микросомальная монооксигеназная система
живых организмов в биомониторинге окружающей среды: Аналит. обзор.- Новосибирск: СО РАМН, ГПНТБ СО РАН, 1994. - 100 с. -
6. Гуляева Л.В., Каледин В.И., Вавилин В.А., Ляхович В.В. и др. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков в химическом канцерогенезе.- Новосибирск: СО РАМН, ГПНТБ СО РАН, 1997.- 112 с.
7. Каган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. - Киев: Здоровья, 1981. - 177 с.
8. Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. Биотранс формация лекарственных веществ. - М.: Медицина, 1981. -167 с.
9. Муфазалова Н.А. Фармакологическая коррекция иммуно- и гепатотоксических эффектов ксенобиотиков.- Уфа: РИО ГУП "Иммунопрепарат", 2002.- 119с.
10. Пестициды (справочник)/ Мартыненко В.И., Прамоненков В.К., Кукаленко С.С., Володкович С.Д., Каспаров В.А.- М., 1992.- С. 209-212.
11. Прошина Л.Г. Макрофаги подкожной соединительной ткани при введении -токоферола и дегидратации// Бюлл. экспер. биол. и мед.- 1998.- № 5.- С. 587-591.
12. Сибиряк С. В. Иммуностимуляторы и аутоиммунитет// Фармакол. и токсикол.- 1990.- № 3.- С. 67-72
13. Сибиряк СВ., Вахитов ВА, Курчатова Н.Н. Цитохром Р450 и иммунная система. - Уфа.: ГИЛЕМ, 2003.- 232 с.
14. Сибиряк СВ., Черешнев В. А., Симбирцев А.С, Сибиряк Д.С, Гаврилова ТВ. Цитокиновая регуляция биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных липофильных соединений. - Екатеринбург: УрО РАН, 2006.- 148 с.
15. Aranda A., Pasqual A. Nuclear hormone receptor and gene expression // Physiol. Rev. - 2001. - Vol. 81. -P.1269-1304.
16. Burke M., Thompson C, Elcombe T. et al. Ethoxy-, penthoxy- and benzyloxyphenoaxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P450 // Biochem. Pharmacol. -1985. - Vol. 34. - P. 3337 - 3345.
17. Denison M., Whitlock J. Xenobiotik-inducible transcription of CYP450 genes // J. Biol. Chem. -1995. -Vol.270.-P. 18175-18178.
18. Griffin J., Gilbert K., Pumford N. Inhibition of CYP2E1 Reverses CD4+ T-Cell Alterations in Trichloroethylene-Treated MRL+/+ Mice // Toxicol. Sciences. - 2000. - Vol. 54. - P. 384 - 389.
19. Hines R., Luo Z., Cresteil T. et al. L. Molecular regulation of genes encoding xenobiotic-metabolizing enzymes: mechanisms involving endogenous factors //Drug Metab. Dispos. - 2001. - Vol. 29. - P. 623 - 633.
20. Morel Y., De Waziers I., Barouki R. A Repressive Cross-Regulation between Catalytic and Promoter Activities ofthe CYP1A1 and CYP2E1 Genes: Role of H202 // Mol. Pharmacol. - 2000. - Vol. 57. - P. 1157 -1164.
21. Myers M.} Farrel D., Howard K., Kawalek J. Identification of multiple constititive and inducible hepatic cytochrome P450 enzymes in market weight swine // Drug Metab. Dispos. - 2001. - Vol. 29. - P. 908 - 915.
22. Parke D., Ioannides С The role of metabolism studies in the safety evaluation of new chemicals / / Acta. Pharm. Jugosl. -1990. - vol. 40. - P. 363 - 382.
23. Pastorino J., Shulga N., Hoek J. TNF-induced cell death in ethanol-exposed cells depends on p38 МАРК signaling but is independent of Bid and caspase-8 //Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. - 2003. -Vol. 285.-G. 503-516.
24. Pelkonen O., Eero M., Kaltiala M. et al. Comparison od activities of drug-metabolizing enzymes in human fetal and adult livers // Clin. Pharmacol. Ther. -1974. - Vol. 14. - P. 840 - 846.
25. Quattrochi L., Guzelian Ph. CYP3A Regulation: From Pharmacology to Nuclear Receptors // Drug. Metab. Dispos. - 2001. - vol. 29. - P. 615 - 624.
26. Savas U., Griffin K., Johnson E. Molecular Mechanisms of Cytochrome P-450 Induction by Xenobiotics: An Expanded Role for Nuclear Hormone Receptors // Mol. Pharm. -1999. - Vol. 56. - P. 851 - 857.
27. Stresser D., Blanchard A., Turner S. et al. Substrate-dependent modulation of CYP3A4 catalytic activity : analysis-of 27 test compounds with four fluoromertric substrates // Drug Metab. Dispos. - 2000. - Vol. 28. -P. 1440 - 1448.
28. Stresser D., Turner S., Blanchard A., Miller V, Crespi Ch. Cytochrome P450 fluorometric substrates: identification of isoform-selective probes for rat CYP2D2 and human CYP3A4 // Drug. Metab. Dispos. - 2002.
- Vol. 30. - P. 845 - 852.
