CC BY
6УДК 579.61
Сидорова А.А., студент, направление подготовки 06.03.01 Биология, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: nastya_sid96@mail.ru
Научный руководитель: Каримов И.Ф., канд. биол. наук, доцент кафедры биохимии и микробиологии, Оренбургский государственный университет, Оренбург
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ
Эффективность действия антибиотиков на бактериальные клетки может зависеть от условий внешней среды, потенциально способных как увеличить чувствительность микроорганизмов к препаратам, так и уменьшить ее. В нашей работе было исследовано изменение чувствительности бактерий к антибиотикам при различных условиях культивирования (температура, концентрация хлорида натрия, кислотность среды). Показано, что в некоторых случаях наблюдается как увеличение диаметра зон подавления роста бактерий исследуемыми антибиотиками, так и противоположные эффекты.
Ключевые слова: антибиотикочувствительность, Escherichiacoli, Salmonellatyphimurium, Klebsiella-oxytoca, Proteusmirabilis.
Широкое применение разнообразных по химической природе и спектру антимикробного действия антибиотиков в медицинской практике [12], сельском хозяйстве [13] и пищевой промышленности [14] сопровождается нарушением микробного экологического равновесия в различных природных очагах и в организме человека. Это может сказаться на нарушении микробного равновесия в роль в обмене веществ [9]. Такие нарушения могут быть связаны с тем, что, во-первых, антибиотические вещества подавляют развитие лишь определенных, чувствительных к ним форм микроорганизмов, во-вторых, массовое практическое использование антибиотиков стимулирует возникновение и распространение в природе атипичных штаммов известных групп микроорганизмов, в той или иной степени резистентных к этим биологически активным соединениям [4]. Для борьбы с возникающими резистентными к антибиотикам формами микроорганизмов в практику вводят все новые антибиотические препараты, что, в свою очередь, ведет к появлению новых устойчивых форм микроорганизмов [1].
Тем не менее, стандартные методы оценки анти-биотикочувствительности осуществляются в идеальных условиях (на богатой питательной среде, оптимальной температуре и т. д.), что не отражает реальных условий существования бактерий. При этом формирование стресса (при голодании, нарушении проницаемости мембраны, низкой температуре) может индуцировать в клетке защитные механизмы, повышающие устойчивость к факторам внешней среды. Таким образом, существует потребность по изучению условий культивирования бактерий на антибиотикорезистентность, в том числе представителей семейства Enterobacteriaceae,
как семейства, в состав которого входят как обли-гатные обитатели кишечник млекопитающих, так и условно-патогенные и патогенные бактерии.
В работе были использованы клинические изоляты семейства Enterobacteriaceae, которые были идентифицированы как Escherichiacoli (тип Proteobacteria, класс Gammaproteobacteria, порядок Enterobacteriales, семейство Enterobacteriaceae, род Escherichia), Salmonellatyphimurium (тип Proteobacteria, класс Gammaproteobacteria, порядок Enterobacteriales, семейство Enterobacteriaceae, род Salmonella),Klebsiellaoxytoca входит в род клебсиелла (Klebsiella), семейство энтеробакте-рии (Enterobacteriaceae), порядок энтеробакте-рии (Enterobacteriales), класс гамма-протеобак-терии (y-proteobacteria), тип протеобактерии (Proteobacteria) и Proteusmirabilis - относится к роду протей (Proteus), который входит в семейство Morganellaceae, порядок энтеробакте-рии (Enterobacteriales), класс гамма-протеобак-терии (y-proteobacteria), тип протеобактерии (Proteobacteria).
В работе были использованы стандартные диски, пропитанные антибиотиками: ампициллин; ампициллин-сульбактам; цефазолин; ванкомицин в виде дисков (ООО НИЦФ, Россия) с дозировкой ампициллина - 10 мкг, ампициллин-сульбактама -10 мкг, цефазолина - 30 мкг, ванкомицина - 30 мкг.
Культивирование осуществляли на ГМФ агаре (ООО НИЦФ, Россия) путем внесения и растирания шпателем 50 мкл суспензии культуры с последующим нанесением на поверхность дисков с антибиотиками. Инкубирование осуществляли в течение суток в термостате ТС-80 (Смоленское СКТБ СПУ Россия) при 37 °C. В ряде экспериментов по оценке воздействия температуры культивирование
осуществляли параллельно при температуре 24 °С и 27 °С.
Для изменения концентрации хлорида натрия вносили дополнительные порции данной соли к имеющимся в составе среды 5 г/л (0,5 %) для получения конечной концентрации 1 %, 1,5 % и 2 % №01.
Для сдвига рН в кислую сторону в ходе эксперимента добавляли 0,1 М раствор уксусной кислоты в среду (до рН = 6; 5), для сдвига в щелочную сторону использовали 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия (до рН = 8; 9). Контроль осуществляли с помощью рН-метра.
Определение чувствительности к антибиотикам проводили методом бумажных дисков, основанном на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам, что соответ-
ствует средней терапевтической дозе для стандартных штаммов микроорганизмов.
Полученные результаты обрабатывали методом вариационной статистики с использованием компьютерной программы <^аЙБЙса 6.0» и «М1сшзойЕхсе1». При определении достоверности различий между анализируемыми выборками вычисляли среднюю арифметическую ряда абсолютных или относительных единиц, среднее квадратичное отклонение, среднюю ошибку средней величины, критерий значимости Стьюдента. Выводы об уровне значимости различий делали исходя из полученной величины коэффициента Стьюдента и количества наблюдений в анализируемых выборках.
На первом этапе определяли влияние температуры культивирования на антибиотикочувствитель-ность бактерий. Был проведен высев клинических изолятов на МПА-агар при температуре 24 °С, 27 °С и 37 °С с использованием дисков с антибиотиками таблицы 1.
Таблица 1 - Диаметр зон подавления роста (мм) при исследовании свойств клинических изолятов при различной температуре
Препарат Штамм Температура
24 °С 27 °С 37 °С
Ампициллин P. mirabilis 11±0,3* 16±0,4* 19±0,3
E.coli 20±0,3 18±0,3 20±0,4
S. typhimurium 6±0 6±0 7±0,4
K. oxytoca 5±0,3 7±0,4 7±0,3
Ампициллин-сульбактам P. mirabilis 21±0,3 22±0,3 23±0,4
E.coli 24±0,3 23±0,4 23±0,3
S. typhimurium 19±0,3 21±0,4 20±0,4
K. oxytoca 12±0,4* 12±0,4* 14±0,4
Цефазолин P. mirabilis 27±0,3* 25±0,4* 23±0,4
E.coli 31±0,4* 28±0,4* 25±0,4
S. typhimurium 28±0,4* 27±0,3* 23±0,3
K. oxytoca 7±0,4 7±0,3 7±0,3
Ванкомицин P. mirabilis 10±0,4 10±0,3 10±0,3
E.coli 11±0,3 12±0,3 10±0,4
S. typhimurium 11±0,3 12±0,4 10±0,3
K. oxytoca 9±0,3 7±0,4 8±0,4
* - достоверное отличие от значений в стандартных условиях при t 37 оС (р < 0,05)
При этом внутри групп с различными антибиотиками достоверные варианты культивирования, отличающиеся от контроля при 37 оС, наблюдались при использовании ампициллина у P. mirabilis и K. oxytoca при использовании комбинации ампициллина и сульбактама. Помимо этого обнаружено, что
понижение температуры для штаммов, чувствительных при стандартных условиях к цефазолину, привело к росту чувствительности. Так, P. mirabilis характеризовалсяростом зоны подавления с 23±0,4 мм до 27±0,3 мм, таким образом, повышение чувствительности составило около 17 %. Аналогичная
картина наблюдалась для Е. соНиБ. typhimurium, для которых повышение чувствительности составило 24 % и 21 %, соответственно. При этом для К. оху^са, оказавшейся устойчивой к данному препарату, подобных изменений не наблюдалось.
Как известно, грамотрицательные бактерии способны продуцировать бета-лактамазы - ферменты, которые способны разрушать путем гидролиза бета-лактамное кольцо антибиотика. В этой связи,ввиду нарастающего распространения антибиотикорези-стентности, встал вопрос о применении ингибиторов бета-лактамаз и создании так называемых «защищенных» антибиотиков. Сульбактам - это производное пеницилловой кислоты, является необратимым ингибитором бета-лактамаз [3].
Интересно отметить, что с уменьшением температуры культивирования, антибиотикочувстви-тельность клинических изолятов увеличивалась, особенно для варианта с цефазолином.
В литературе имеются данные, что температура культивирования неоднозначно влияет на ростовые качества, так, например, при понижении температуры бактерии утрачивают жгутики [6]. Однако, в целом, сведений по влиянию температуры культивирования на антибиотикочувствительность бактерий на данный момент имеется недостаточно.
Следующим этапом работы стало исследование зон подавления роста антибиотиками при разной рН
среды, таблица 2. Статистически значимыми были наблюдения для P. mirabilis и E. col/при использовании ампициллина при рН = 6, для S. typhimurium при использовании ампициллина при рН = 7,5 по сравнению со стандартным рН = 7. А также достоверно отличались значения для Рж/шЬ/Шпри использовании ампициллина/сульбактама при рН = 6, для Рж/юЬ/Н^при использовании цефазолина при рН = 6,5,Е.со1/при использовании цефазолина при рН = 7,5.
В литературе встречаются данные о том, что в условиях кислотного стресса накапливаются полиамины - основные катионные соединения, присутствующие во всех живых организмах, что, возможно, служит защитным фактором и позволяет бактериям приобретать антибиотикорезистент-ность по одной из гипотез [7].
Таким образом, активная кислотность среды оказывает сильное влияние на антибактериальную активность исследованных антибиотиков и устойчивость к ним представленных изолятов. Самыми устойчивыми при изменении рН среды и сохраняющими антибактериальную актив-ностьстали ампициллин-сульбактам и цефазолин (кроме K. oxytoca). Самая слабая активность при различныхрН среды наблюдалась у ванкомицина, ампициллин в то же время занимает среднее положение в данном ряду.
Таблица 2 - Диаметр зон подавления роста (мм) при исследовании свойств клинических изолятов при разной рН среды
АБ штамм рН
6 6,5 7 7,5 8
Ампициллин P. mirabilis 27±0,4* 18±0,4 19±0,3 19±0,3 18±0,3
E.coli 23±0,3* 21±0,4 20±0,3 15±0,3 19±0,3
S. typhimurium 7±0,3 8±0,4 7±0,3 15±0,3* 7±0,3
K. oxytoca 7±0,3 6±0,4 7±0,3 6±0 6±0
Ампициллин-сульбактам P. mirabilis 27±0,4* 25±0,4 23±0,3 24±0,4 21±0,4
E.coli 25±0,3 24±0,3 23±0,4 18±0,3 22±0,3
S. typhimurium 16±0,4 19±0,3 20±0,3 21±0,4 21±0,4
K. oxytoca 18±0,3 16±0,4 14±0,3 14±0,4 10±0,4
Цефазолин P. mirabilis 26±0,3 27±0,3* 22±0,4 23±0,4 25±0,4
E.coli 27±0,3 26±0,4 25±0,4 12±0,4* 24±0,4
S. typhimurium 26±0,3 24±0,3 23±0,4 23±0,4 22±0,3
K. oxytoca 7±0,4 8±0,3 7±0,3 6±0 6±0
Ванкомицин P. mirabilis 10±0,4 11±0,3 10±0,4 10±0,3 10±0,4
E.coli 10±0,4 10±0,4 10±0,3 8±0,4 10±0,4
S. typhimurium 11±0,3 11±0,4 10±0,4 6±0 8±0,4
K. oxytoca 9±0,3 8±0,4 8±0,4 6±0,4 6±0
*- вариант, достоверно отличающийсяот значений в стандартных условиях при Рн = 7 (p < 0.05)
Наибольшее значение зон подавления роста для P. mirabilis, E. coli, S. typhimurium и K. oxytoca при тестировании с ампициллином, ампицилли-ном-сульбактамом и цефазолином наблюдали при рН в диапазоне 6-6,5. В тоже время K. oxytoca был устойчив к ампициллину и цефазолину при рН = 7,5-8, ванкомицину при рН = 8, S. typhimurium был устойчив к ванкомицину при рН =7 ,5.
Однако статистически значимыми были наблюдения для P.mirabilis и E. col/при использовании ампициллина при рН = 6, для S. typhimurium при использовании ампициллина при рН = 7,5 по сравнению со стандартным рН = 7. А также достоверно отличались значения для P.mirabilisпри использовании ампициллина/сульбактама при рН = 6, для P.mirabilisпри использовании цефазолина при рН = 6,5,E.coli при использовании цефазолина при рН = 7,5.
Преимущественно, более высокие значения pH способствовали уменьшению зон подавления роста, что может быть связано с изменением активности самого антибиотика, так и метаболическими процессами, происходящими в бактериях, а низкие значения рН повышали антибиотикочувствитель-ность клинических изолятов.
Немаловажно, что устойчивость бактерий к антибиотикам при рН ниже 7 считается неблагоприятным прогностическим признаком, так как бак-
териимогут выживать в условиях кислой среды в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, перемещаясь в его нижние отделы [2].
В литературе встречаются данные о том, что в условиях кислотного стресса, накапливаются полиамины - основные катионные соединения, присутствующие во всех живых организмах, что, возможно, служит защитным фактором и позволяет бактериям приобретать антибиотикорезистент-ность, по одной из гипотез [7].
Следующим этапом стала оценка антибиоти-кочувствительности при различной концентрации NaCl в питательной среды таблица 3.
Достоверно отличались от контроля варианты сиспользованиям 2 % концентрации хлорида натрия для E. coli и S. typhimurium с ампициллином, для P. mirabilis, E. coli и S. typhimurium с комбинацией ампициллина/сульбактама, для P. mirabilis и S. typhimurium с цефазолином и P. mirabilis и E. coli с ванкомицином.
При этом повышение концентрации хлорида натрия в отдельных вариантах вело к резкому повышению диаметра зон подавления роста, что обусловлено высоким осмотическим давлением в растворах, которое вызывает большую или меньшую дегидратацию клеток микроорганизмов, изменение их размеров и формы и нарушение водного обмена
[5].
АБ Штамм Концентрация NaCl
0,5 1 1,5 2
Ампициллин P. mirabilis 19±0,4 19±0,3 20±0,8 18±0,5
E.coli 21±0,3 20±0,4 21±0,5 25±0,3*
S. typhimurium 7±0,4 6±0 6±0 26±0,3*
K. oxytoca 7±0,5 6±0 7±0,3 7±0,8
Ампициллин-сульбактам P. mirabilis 23±1 23±0,4 24±0,3 35±2*
E.coli 23±0,4 22±0,3 26±0,4 11±0,5*
S. typhimurium 20±0,4 21±0,3 20±0,8 10±0,4*
K. oxytoca 14±0,3 15±0,4 14±0,4 7±0,3
Цефазолин P. mirabilis 22±0,8 24±0,3 23±0,4 7±0,3*
E.coli 25±0,4 24±0,4 25±0,8 24±0,7
S. typhimurium 23±0,4 24±0,4 27±0,8 7±0,4*
K. oxytoca 7±0,4 6±0 7±0,3 7±0,3
Ванкомицин P. mirabilis 10±0,4 10±0,3 11±0,4 35±2*
E.coli 10±0,4 7±0,3 10±0,4 20±0,8*
S. typhimurium 10±0,3 11±0,3 11±0,4 22±0,8
K. oxytoca 7±0,4 6±0 7±0,4 14±0,8
*- вариант, достоверно отличающийся от значений в стандартных условиях при 0,5 % NaCl (p<0.05)
Таблица 3 - Диаметр зон подавления роста (мм) при исследовании свойств клинических изолятов при разной концентрации №С1
В целом, колебания физических факторов воздействия вели к модулированию эффектов антибиотиков, что может быть связано, по одной из имеющихся гипотез с тем, что антибиотики способны вызывать окислительный стресс, что может служить общим механизмом бактерицидного действия антибиотиков с различными внутриклеточными мишенями [8]. Предполагается, что воздействие бактерицидных антибиотиков на специфические мишени сопровождается значительными неспецифическими изменениями центрального метаболизма, в том числе дыхания и баланса ионов железа, что приводит к повышению продукции активных форм кислорода (АФК), окислительному повреждению и гибели клеток. При этом резкие колебания температурного режима также вели к гибели бактерий.
Таким образом, можно сделать следующие выводы:
1) температура культивирования, рН и концентрация питательной среды влияет на антибиотикочув-ствительность бактерий; преимущественно при увеличении температуры увеличивается диаметр зон подавления роста при внесении ампициллина, ами-циллина-сульбактама, в то время как цефазолин оказывал наибольшее влияние при температуре 24 °С, а действие ванкомицина было разнонаправленным;
2) ампициллин и его комбинация с сульбакта-мом проявляла наибольшую активность в отношении P. mirabilis, E.coli и K. oxytoca при рН = 6; S. thyphimurium при рН = 7,5.В отношении цефазо-лина наибольший диаметр зон подавления роста наблюдался при рН = 6-6,5. Действие ванкомицина было разнонаправленным при различной реакции среды. В тоже время K. oxytoca обнаруживал резистентность к ампициллину, цефазолину и ванкоми-цину при рН выше 7,5;
3) наибольшая концентрация среды способствовала и большей чувствительности E. coli и S. thyphimurium к ампициллину, а обычная концентрация среды способствовала резистентности S. thyphimurium и K. oxytoca к ампициллину. P. mirabilis при высокой концентрации среды показывал наибольшие зоны подавления роста при использовании ампициллин-сульбактама, E. coli - при концентрации среды, равной 1,5.S. thyphimurium и K. oxytoca - при стандартной концентрации. С цефазолином наименьшую чувствительность изоляты показывали при наибольшей концентрации среды, в то время как K. oxytocaбыл к нему резистестен при нормальной концентрации среды. С ванкомицином наибольшую чувствительность изоляты проявили при наибольшей концентрации среды, в то время как K. oxytocaбыл к нему резистентен при нормальной концентрации среды.
Практическая значимость исследования заключается в том, что полученные результаты исследования могут быть использованы на практике в качестве теоретической основы по работе, на-правленнойна изучение условия культивирования энтеробактерий на чувствительность к антибиотикам. Результаты исследования отражают условия, при которых может изменяться чувствительность, что, в свою очередь, позволит доработать свойства антибиотических препаратов.
Нами было установлено, что антибиотикочув-ствительность повышается при изменении данных показателей и позволяет модулировать активность антимикробных препаратов, что может быть в дальнейшем использовано в биотехнологии и медицине. Полученные данные предоставляют новые знания о антибиотикочувствительности бактерий при различных условиях окружающей среды.
Литература
1. Виноградова, К.А. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам: резистома, её объём, разнообразие и развитие / К.А. Виноградова, В.Г. Булгакова, А.Н. Полин, П.А. Кожевин // Антибиотики и химиотерапия. - 2013. - Т. 58. - №. 5-6. - С. 45-51.
2. Ивашкина, Н.Ю., Ботина, С.Г. Оригинальный отечественный пробиотик аципол: молекулярно-би-ологические и метаболические характеристики // РЖГГК. - 2009. - Т. 2. - С. 58-64.
3. Козлов, Р.С., Веселов, А.В. Амоксициллин / сульбактам - новый представитель ингибиторозащи-щенных бета-лактамов / Р. С. Козлов, А.В. Веселов // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. - 2006. - Т. 8. - № 2. - С. 173-185.
4. Литвин, В.Ю., Гинцбург, А.Л., Пушкарева, В.И., Романова, Ю.М., Боев, Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. - М.: Фармарус-принт, 1998. - 255 с.
5. Сомов, Г.П., Бузолева, Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. - Владивосток: Примполиграфкомбинат, 2004. - 167 с.
6. Ткаченко, А.Г. Адаптивные функции полиаминов Escherichia coli при сублетальных воздействиях антибиотиков / А.Г. Ткаченко, М.С. Шумков, А.В. Ахова // Микробиология. - 2009. - Т. 78. - №. 1. -С. 32-41.
7. Dwyer, D.J. Antibiotics induce redox-related physiological alterations as part of their lethality / D.J. Dwyer, P.A. Belenky, J.H. Yang, I.C. MacDonald, J.D. Martell, N. Takahashi, D.Y. Jonathan // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - Vol. 111. - pp. 2100-2109.
8. Francino, M.P. Antibiotics and the human gut microbiome: dysbioses and accumulation of resistances / M.P. Francino // Frontiers in microbiology. - 2016. - Vol. 6. - pp. 1543.
9. Kohanski, M. A. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics / M.A. Kohanski, D.J. Dwyer, B. Hayete, C.A. Lawrence, J.J. Collins // Cell. - 2007. - Vol. 130. - pp. 797-810.
10. Majcher-Peszynska, J. Ampicillin/sulbactam in elderly patients with community-acquired pneumonia / J. Majcher-Peszynska, M. Loebermann, S. Klammt, S. Frimmel et al. // Infection. - 2014. - Vol. 42. -pp. 79-87.
