CC BY
63
Мамедова Л.В.1, Лебедев Л.Р.2 ©
1Дипломница, ФГБОУ ВО Кубанский государственный университет, Краснодар;
2д.м.н., зав. лабораторией нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков, Институт медицинской биотехнологии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, Бердск, Россия
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus subtilis НА ПРОДУКЦИЮ
ПРОТЕОЛИТИЧЕКИХ ФЕРМЕНТОВ
Аннотация
Исследовано влияние условий культивирования Bacillus subtilis: продолжительности роста, значения рН среды, добавления субстратов на рост клеток и продукцию внеклеточных протеаз. Показано, что оптимальная продолжительность культивирования на среде LB, рН 7,5-8,0 с интенсивностью качания 160 об/мин при 37 °С составляла 24±2 ч. Внесение казеина в культуральную среду до 0,5% способствовало повышению продукции протеазы.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, культивирование, протеазы, биосинтез. Keywords: Bacillus subtilis, cultivation, protease, biosynthesis.
Особенностью штаммов Bacillus subtilis является то, что они продуцируют во внеклеточную среду комплекс ферментов, в том числе протеазы. Нейтральные протеазы нашли применение при создании ранозаживляющих препаратов [1], щелочные - могут быть использованы при разработке ферментных препаратов для коррекции проблем с пищеварением (компенсирует недостаток ферментов для переваривания пищи). В связи с расширением употребления продуктов из сои, содержащих ингибиторы трипсина [2], замедляющие процессы переваривания белков, спрос на препараты протеаз увеличивается. В основном используются препараты животного происхождения: фестал, мезим и др. Разработка протеолитических препаратов на основе микробиологического сырья позволит снизить технологические затраты.
Цель работы состояла в исследовании влияния условий культивирования на рост клеток штамма Bacillus subtilis 296 и биосинтез внеклеточных протеаз.
Материалы и методы исследования
В работе использовали штамм В. subtilis 296, полученый из Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Для культивирования клеток использовали среду LB следующего состава (%): пептон (MERCK, Германия) - 1.0; дрожжевой экстракт (Диа-М) - 0.5; NaCl - 0.5. Посевной материал готовили из 24-часовой культуры клеток, добавляя глицерин до 15%, хранили при температуре минус 180 С. Объем инокулята для засева составлял 1,0% от объема питательной среды. Ферментацию проводили в колбах на термостатируемой качалке с интенсивностью качания 160 об/мин при 37 °С.
Прирост биомассы определяли нефелометрически на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 550 нм. Концентрацию белка и активность ферментов в культуральных жидкостях определяли после удаления клеток центрифугированием (8000g - 15 мин).
Протеолитическую активность определяли по методу Ансона [3] в модификации, используя в качестве субстрата 2%-ый раствор казеина. За единицу активности протеаз принимали такое количество фермента, которое переводит в кислоторастворимую фракцию 1 мг тирозина за 15 мин при 37 С.
Результаты и обсуждение
На биосинтез протеолитических ферментов оказывают влияние не только компоненты питательной среды, но и условия культивирования продуцента: величина pH питательной
© Мамедова Л.В., Лебедев Л.Р., 2016 г.
среды, температура, аэрация, количество и возраст посевного материала. Изучение влияния этих факторов на биосинтез протеаз позволяет определить оптимальные условия культивирования бактериальных клеток с целью получения максимальной продукции фермента.
В качестве посевного материала использовали 24-часовую культуру клеток (1010 кл/мл). Объем вносимого инокулята при засеве составлял 1,0% от объема питательной среды. Было показано, что при добавлении к посевному материалу глицерина до 15% клетки Bacillus subtilis 296 могут храниться при температуре минус 18 С до 6 месяцев без снижения выживаемости и продуктивности по протеазам. Это позволяет создать банк стандартизованного посевного материала.
При исследовании динамики роста культуры В. subtilis на среде LB, рН 7,5 с интенсивностью качания 160 об/мин было установлено, что после 24-26 ч рост клеток выходит на стационарную фазу (рис. 1). При этом уровень содержания протеолитической активности в культуральной жидкости. наблюдался максимальным. Изменение интенсивности качания в пределах ± 30 об/мин не приводило к значительным изменениям роста клеток и продукции ферментов.
4ч 8ч 12ч 16ч 20ч 24ч 28ч 32ч
Рис.1. Динамика роста культуры В. (Д550, пунктирная линия) и накопления
нейтральной протеазы в культуральной жидкости (ед.акт./мл, столбики). Левая ось ординат -
активность фермента, ед.акт./мл, правая - Д550.
В последующих экспериментах по влиянию значения рН культуральной среды и субстратов культивирование проводили 24 ч до выхода прироста оптической плотности на плато.
При исследовании влияния рН культуральной среды на продукцию нейтральной протеазы использовали значения рН 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; и 9,0.
pH 6,0 pi 17,0 pi 17,5 pus,0 pus,5 рН9,0
Рис.2. Зависимость концентрации белка в культуральной жидкости (мг/мл, пунктирная линия) и продукции нейтральной протеазы (ед.акт./мл, столбики) от значения рН среды для культивирования. Левая ось ординат - активность фермента, ед.акт./мл, правая -
концентрация белка, мг/мл.
Как видно на рис.2 наиболее высокая протеолитическая активность наблюдалась при культивировании в среде с значениями рН 7,5 - 8,0. При этом содержание белка в культуральной жидкости тоже было максимальным (рН 7,5). Следует отметить, что количество белка в культуральной жидкости кореллировало с количеством клеток в культуре (Д550). Удельная активность протеаз в точке рН 7,5 - 14,4 ед.акт./мг суммарного белка, при рН 8,0 она достигала 18,7 и затем снижалась при рН 8,5 до 12,5.
При исследовании влияния субстратов на стимуляцию синтеза протеаз В. subtilis добавляли в среду желатин или казеин до конечных концентраций 0,5%. Культивирование проводили 24 ч в среде LB, рН 7,6 с интенсивностью качания 160 об/мин. Результаты представлены на рис.3.
Рис.3. Влияние внесенных в культуральную среду субстратов на рост клеток (Д550, пунктирная линия) и продукции нейтральной протеазы (ед. акт./мл, столбики). Левая ось ординат - активность фермента, ед.акт./мл, правая - Д550
В этом эксперименте вместо фиксации концентрации белка в культуральной жидкости замеряли количество клеток (Д550), т.к. внесенные белки-субстраты могли исказить значения. Как видно на рис.3 желатин незначительно ингибировал рост культуры и немного (до 96%) снижал продуктивность по протеазе. Казеин, на фоне ингибирования роста культуры повышал выход фермента до 117%. Была выявлена зависимость способности казеина влиять на продуктивность от значения рН среды: если при рН 7,5 повышение наблюдалось до 117%, то при рН 8,5 продукция протеазы в аналогичных условиях повышалась до 150%.
Анализ состава белков культуральных жидкостей после удаления клеток проводили методом электрофореза в 13%-ом ПААГ с последующей окраской Кумасси 0-250. Результат представлен на рис.4.
Рис. 4. Электрофореграмма образцов культуральных жидкостей в 13%-ном ПААГ,
окрашивание Кумасси 0-250, дорожки:
1 - контрольная среда;
2 - среда с желатином;
3 - среда с казеином;
М - маркеры молекулярных масс (10000 - 250000Д, «СибЭнзим»).
На электрофореграмме видно, что основные полосы соответствуют белкам с молекулярными массам 60±2, 40±2, 30±2, 20±2 и 12-14 кДа, доминирующей полосой является белок с молекулярной массой 30±2 кДа.
Таким образом показано, что в качестве посевного материала для культивирования В.зыЪИЫз 296 можно использовать стандартизованный посевной материал, полученный из 24 часовой культуры, хранящейся в 15%-ом глицерине при температуре - 180 С. При этом для максимальной продукции внеклеточных протеаз оптимальная продолжительность культивирования на среде ЬБ, рН 7,5-8,0, с интенсивностью качания 160 об/мин при 37 °С составляла 24±2 ч. Внесение казеина в культуральную среду до 0,5% способствовало повышению продукции протеазы.
Литература
1. Патент РФ 686377, кл. А 61 К 37/48 «Способ получения препарата иммобилизованной протеазы ВасШш 8иЫШ8». Аветисов Л.А., Загребельный С.Н., Земцова Л.В., Кузмарева Т.И., Салганик Р.И., Старостина В.К. , 1993 г.
2. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов у растений // Прикладная биохимия и микробиология. —1995. —Т. 31, №6. —С. 579—589.
3. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов - М. : Легкая и пищевая пром-сть (1982), сс. 36-41.
