Влияние цитохалазина б на реконструирование ооцитов методом переноса ядер соматических клеток крупного рогатого скота Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

Биологий It

ВЛИЯНИЕ ЦИТОХАЛАЗИНА Б НА РЕКОНСТРУИРОВАНИЕ ООЦИТОВ МЕТОДОМ ПЕРЕНОСА ЯДЕР СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

А. А. ОВЧИННИКОВ, аспирант, Г. Н. СИНГИНА, кандидат биологических наук, Всероссийский НИИ животноводства Россел ьхозакадемии

142132, Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы

Ключевые слова: крупный рогатый скот, ооцит, перенос ядра. Keywords: cattle, oocyte, nuclear transfer.

Одним из элементов технологии клонирования является получение цитогибрида. Чаще всего для этого проводят полную энуклеацию хромосом ооцита на стадии метафазы второго деления мейоза с последующим переносом в перивителлиновое пространство соматической клетки. Известно также, что микроманипуляции, направленные на реконструирование яйцеклетки, негативно влияют на жизнеспособность яйцеклеток. В практике клонирования для снижения отрицательного воздействия микроманипуляций, связанных с реконструированием ооцитов, используется цитохалазин Б.

Известны случаи использования цитохолозина Б перед энуклеацией, в процессе энуклеации и после энуклеации ооцитов млекопитающих.

Считается, что обработка ооцитов цитохалазином Б приводит к дестабилизиции их цитоскилета, разглаживанию оболочки и предотвращению лизиса в процессе манипуляций.

Показано, что культивирование ооцитов свиней в среде NCSU-37 в течение 30 мин. в присутствии 5 мкг/мл данного митотоксина существенно повышало уровень их энуклеации [5].

На цитопластах крупного рогатого скота Jonathan R. Hill с соавторами [3] проводил успешно энуклеацию ооцитов после предварительного культивирования их в течение 15 мин. в среде ТС199, содержащей 7,5 мг/мл цито-халазина В и 5 мг/мл Hoechst 33342. Также есть примеры использования цитохалазина В непосредственно во время энуклеации ооцитов крупного рогатого скота в концентрации 5,0 мг/мл [1, 4].

Однако в литературе имеются данные о отсутствии эффекта цитохалазина Б [2] на развитие реконструированных ооцитов и возможности получения клонированных эмбрионов без его использования [6].

Цель и методика исследований.

Целью данной работы было изучить влияние преин-кубации ооцитов в среде, содержащей цитохалазин Б, на получение полноценных цитогибридов после энуклеации и переноса ядер эмбриональных фибробластов у крупного рогатого скота.

Материалом для исследований служили яичники половозрелых коров и телок, отобранные после убоя. Транспортировку яичников осуществляли в физиологическом растворе при температуре 28-35°С в течение 3—4 часов. Выделение ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) проводили методом рассечения видимых фолликулов. Культивирование ОКК осуществляли группами по 35-40 ооцитов в модифицированной среде ТС199, содержащей 25 мМ HEPES, 1 мМ Na-пирувата, 10 % фетальной www.m-avu. narod. ru

сыворотки телят (FCS), 0,5 мкг/мл ФСГ и 0,5 мкг/мл ЛГ, 50 мкг/мл гентамицина сульфата.

По окончанию периода созревания ОКК обрабатывали 0,1 % раствором гиалуронидазы, механически удаляли кумулюсные клетки и отбирали ооциты с первым полярным тельцем (ППТ).

Источником кариопластов служили эмбриональные фибробласты крупного рогатого скота, которые культивировали в среде ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, дополненной 1 мМ пирувата натрия, 10 % сыворотки плода коров, 1 % несущественных аминокислот и 50 мкг/мл гентамицина сульфата.

Суспензию клеток для процедуры переноса получали, обрабатывая монослой 0,25 % раствором трипсин/ЭДТА.

Проведение процедуры энуклеации ооцитов и переноса соматических клеток в полученный цитопласт осуществляли методом прямого прокола зоны пеллюцида (рис. 1) на микроскопе Мсоп Diaphot с использованием трехмерного гидравлического микроманипулятора с точной настройкой фирмы №^Ыде.

Таблица 1

Влияние Цитохолозина Б на эффективность реконструирования ооцитов коров методом энуклеации и переноса

соматической клетки

Г руппа Количество ооцитов Эффективность реконструирования

n %

Контроль (без цитохалазина Б) 117 95 81,2 ± 3,483

Опыт (с цитохалазином Б) 105 84 80.0 ± 3,838

OicliiHniknv Л.

Рисунок 1

Энуклеация ооцита крупного рогатого скота

Биология It

Перед проведением микроманипуляций ооциты с ППТ культивировали в течение 15 мин. в среде ТС199, содержащей 7,5 мкг/мл Цитохалазина Б. В контроле обработку цитохалазином Б не проводили.

Норму реконструирования ооцитов определяли в 6 независимых экспериментах как отношение числа морфологически полноценных ооцитов к общему числу ооцитов, подвергнутых процедуре энуклеации/пересадки.

Результаты исследования.

Показано, что обработка ооцитов в течение 15 мин. в среде, содержащей цитохалазин Б, перед проведением процедуры энуклеации и пересадки в перивителлиновое пространство эмбриональных фибробластов не влияла на эффективность реконструирования ооцитов (табл. 1).

Вывод.

Получение клонированных цитогибридов крупного рогатого скота возможно без использования цитохала-зина Б.

Литература

1. Brendan G., Tatham Aneta Т., Dowsing and Alan O. Trounson. Enucleation by Centrifugation of In Vitro-Matured Bovine Oocytes for Use in Nuclear Transfer // Biol. Reprod. 1995. V. 53. P. 1088-1094.

2. Du F., Jiang S., Yang X. Beneficial effect of oocyte activation prior to and during nuclear transfer in cattle using in vitro matured oocytes 24 h of age // Reprod. Nutr. 1995. V. 35 (6). P. 703-712.

3. Jonathan R. Hill, Quinton A. Winger, Robert C. Burghardt, Mark E. Westhusin Bovine nuclear transfer embryo development using cells derived from a cloned fetus // Anim. Reprod. 2001. V. 67. P. 17-26.

4. Xiang Chen Li, Yong Zhang, Song Hua, Jian Hong Shu, Zhi Peng Zhang and Jun Wei Cao. The use of demecolcine for enucleation of bovine oocytes // J. Zool. 2007. V. 137 (2). P. 209-214.

5. Zhu Xiu-ping, Zhu Shu-wen, Zhang Jing, Hua Xiu-guo, Tang Feng. Effect of Cytochalasin B on Porcine Oocyte Enucleate // J. Agric. Science. 2005.

6. Ricardo Felmer D., Maria Elena Arias. Developmental rates of bovine nuclear transfer embryos derived from different fetal non transfected and transfected cells // Animal Biotechnology. 2011. V. 14 (3).

ОСОБЕННОСТИ БИОХИМИЧЕСКОГО И БИОЭЛЕМЕНТНОГО СТАТУСА ИМПОРТИРОВАННОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ГОЛШТИНО-ФРИЗСКОЙ ПОРОДЫ В УСЛОВИЯХ ЮЖНОГО УРАЛА

Т. А. ШЕПЕЛЕВА,

. . . 457100, Челябинская область, г. Троицк,

кандидат ветеринарных наук, Уральская 1АВМ ул. Гагарина, д. 13; тел. 89043020419

Ключевые слова: биогеохимические провинции, адаптация, микроэлементы, нарушение обмена веществ, биохимические показатели крови, рацион кормления животных, голштино-фризская порода.

Keywords: biogeochemical provinces, adaptation, trace substances, metabolism disturbance, biochemical indicators of a blood, a ration of feeding of animals, golshtino-frizskaja breed.

Процесс адаптации крупного рогатого скота, завезенного из Германии и Голландии, в биогеохимических провинциях Уральского региона проходит через глубокие изменения в состоянии обменных процессов и связан с нарушением белкового, углеводного, жирового и особенно минерального обмена [1, 2, 4].

Целью нашей работы явилось изучение влияния биогеохимической провинции на биохимический и микроэлементный статус крупного рогатого скота голштино-фризской породы, импортированного из Германии и Голландии, в условиях ООО «Агрофирма Магнезит» Саткинского района и ООО «Песчаное» Увельского района Челябинской области.

Материал и методы.

Содержание макро- и микроэлементов в кормах, крови, молоке и моче определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре ААS-3. Общий белок — рефрактометрически, глюкозу — с ортотолуидиновым реактивом, мочевину — уреазным и белковые фракции — нефелометрическим методами, кальций и магний — триллонометрически, фосфор — по

Бригсу-Юделовичу с дополнениями Ивановского, титруемую кислотность молока — по Тернеру в модификации А. А. Кабыша.

Результаты исследований и их обсуждение.

Исследование макро- и микроэлементного состава кормов и воды ООО «Агрофирмы Магнезит» показали, что в них имеет место аномальное содержание макро-и микроэлементов, характерное для биогеохимиче-ской провинции. Так, количество кальция снижено до 1,67 г/кг при норме 10-14 г/кг, магния — 0,5 г/кг при норме 2,2-4,0 г/кг и фосфора — 0,37-0,51 г/кг при норме 4-5 г/кг. Содержание меди в кормах ниже нормативных данных и составляет 1,4-3,4 мг/кг при норме 7-10 мг/кг. Количество железа — 44,8-62,9 мг/кг при норме 50-70 мг/кг. Уровень кобальта составляет 0,28 мг/кг при норме 1-1,5 мг/кг. Цинк снижен до 0,64 мг/кг при норме 50-100 мг/кг. Уровень марганца — 16,84-22,8 мг/кг при норме 60-80 мг/кг.

Исследование кормов ООО «Песчаное» показали, что они бедны по содержанию кальция. Количество кальция в сене — 3,95 г/кг при норме 4,2-8,3 г/кг, в силосе —

18

www. m-avu. narod. ru