CC BY
82
УДК 636.4.082.4.591.39
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ИСКУСТВЕННОЙ АКТИВАЦИИ НА РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНОВ СВИНЕЙ Ш УП^О
Г.Н. СИНГИНА, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
А.В. ЛОПУХОВ, младший научный сотрудник
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, член-корреспондент РАСХН, зам. директора
ВНИИ животноводства Россельхозакадемии
E-mail: g_singina@mail.ru
Резюме. Эффективность получения клонированных эмбрионов свиней in vitro во многом зависит от создания в культуре условий, препятствующих выделению второго полярного тельца и благоприятствующих сохранению диплоидного набора хромосом. В этой работе на партеногенетической модели проведено сравнительное исследование влияния цитохалазина Б и 6-диметиламинопурина (6-ДМАП) в системе постактивационного культивирования на последующее развитие ооцитов свиней in vitro. Ооцит-кумулюсные комплексы выделяли из фолликулов яичников половозрелых свинок и взрослых свиноматок и культивировали группами по 10...20 штук в модифицированной среде ТС199. Через 44 ч созревания проводили активацию освобожденных от кумулюса ооцитов при воздействии 5 мкМ иономицина в среде ТС199 в течение 5 мин. Затем в течение 3 ч ооциты I опытной группы инкубировали в среде NCSU-23, содержащей 2мМ 6-ДМАП, II опытной группы - в такой же среде с добавлением 7,5 мкг/мл цитохалазина Б, III группы (контроль) - в среде NCSU-23 без добавок. На следующем этапе ооциты всех групп переносили в свежую среду NCSU-23 без добавок и культивировали в течение 6 сут. Доля активированных, вступивших в первое деление дробления, ооцитов I и II опытных групп в средах с тестированными реагентами оказалась выше на 26,8 % (p<0,001) и 23,8 % (p<0,01) соответственно, чем в III группе. Кроме того, доля эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, в опытных группах была выше, чем в контроле, на 11,0 % (p<0,001) и 7,4 % (p<0,05). Таким образом, обработка искусственно активированных ооцитов свиней в течение 3 часов 6-ДМАП (2мМ) или цитохалазином Б (7,5 мкг/мл) благоприятно влияет на их последующее развитие in vitro. Значимых различий в эффекте воздействия между изучаемыми препаратами не установлено.
Ключевые слова: свиньи, ооцит, искусственная активация, цитохалазин Б, 6-диметиламинопурин, эмбрион, партеногенез, in vitro.
При получении трансгенных животных и в биомедицинских исследованиях широко используют пересадку ядер соматических клеток. Однако эффективность получения клонированных форм, в особенности у свиней, остается крайне низкой [1, 2, 3].
Для оптимизации условий реконструирования ооцитов, получения, активации и культивирования ци-топластов in vitro ряд ученых проводит исследования в направлении повышения качества цитопластов и донорских клеток [4, 5].
Ко времени энуклеации созревший ооцит находится в состоянии покоя на метафазе II мейоза. Проникновение сперматозоида инициирует процессы мейоза и ооцит вступает в интерфазу. При этом оплодотворенный ооцит редуцирует половину собственных хромосом за счет образования полярного тельца(ПТ), а нормальная плоидность ядра сохраняется благодаря объединению мужского и женского пронуклеусов.
В случае получения клонированных эмбрионов процессы, активируемые спермием при его контакте с плазматической мембраной яйцеклетки, нужно инициировать искусственно. Для активации ооцитов ис-
пользуют различные химические вещества, в частности этанол [6], иономицин [7], кальций ионофор А23187 [8], а также электрические импульсы [3, 9].
Одно из важных условий полноценного развития вне зависимости от выбранного способа активации ооцитов цитогибридов - создание в культуре условий, препятствующих выделению второго ПТ и сохранению диплоидного набора хромосом. Реконструированные ооциты стремятся изгнать часть хромосом донорской соматической клетки путем образования псевдо-ПТ. Это приводит к анеуплоидии и снижению жизнеспособности клонированных эмбрионов.
Выделение второго ПТ можно регулировать посредством использования химических субстанций, которые нарушают структуру веретена деления. В результате в клетке присутствует два набора хромосом, но ее деления не происходит. Чаще всего для этих целей используют цитохалазин Б [9, 10] и 6-диметиламинопурин (6-ДМАП) [11, 12, 13]. В связи с тем, что сведения об эффективности этих веществ у разных авторов сильно варьируют, мы провели собственное исследование, целью которого было на партеногенетической модели изучить влияние цитохалазина Б и 6-диметиламинопу-рина в системе постактивационного культивирования ооцитов на их последующее развитие in vitro.
Условия, материалы и методы. Материалом для исследований служили яичники половозрелыхсвинок и взрослых свиноматок, отобранные после убоя. Транспортировку яичников осуществляли в физиологическом растворе при температуре 28...35 0С в течение 1.2 часов. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) выделяли рассечением видимых фолликулов. Их разделили на три группы по 10.20 ооцитов и культивировали в модифицированной среде ТС199 [12]. Через 20 ч ОКК переносили в свежую среду созревания, из которой были исключены гормоны. В конце 44-часового периода культивирования ооциты обрабатывали 0,1 %-ным раствором гиалуронидазы и удаляли прилегающие к ним КК. Активацию созревших предварительно денудированных ооцитов осуществляли в среде ТС199, содержащей 25 мМ HEPES, 10 % FCS, 50 мкг/мл гентамицин сульфата и
5 цМ иономицина, в течение 5 мин.
После активации ооциты переносили в среду NCSU-23 различающуюся по своему составу. I группу ооцитов культивировали в среде, содержащей 2мМ 6-ДМАП, II группу - в среде с 7,5 мкг/мл цитохалазина Б, ооциты III группы служили контролем, их культивировали без указанных добавок. Продолжительность культивирования составила 3 часа, после чего ооциты всех экспериментальных групп переносили в свежую среду NCSU-23 без 6-ДМАП и цитохалазина Б и культивировали в течение
6 сут. Эффективность активации определяли по доле ооцитов, вступивших в первое деление дробление, а также достигших стадии бластоцисты.
Эксперимент проводили в семи повторах. Полученные данные выражали как средний показатель, подвергали арксинусной трансформации, затем обрабатывали методом однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки достоверности различий сравниваемых средних значений использовали критерий Тью-
Рис. 1. Влияние 6-ДМАП и цитохалазина Б на дробление созревших ооцитов свиней in vitro после активации иономицином.
ки. Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы SigmaStat.
Результаты и обсуждение. Доля дробления активированных ооцитов в I и II группе составила 77,11±4,902 и 74,48±4,344 % (рис.1) соответственно, что на 26,8 (p<0,001) и 23,8 % (p<0,01) выше, чем в контроле (50,31±2,824).
Доля развития бластоцист из ооцитов I опытной группы составила 21,36±2,524 % (рис. 2), II группы -17,80±1,628 % соответственно, что на 11,0 (p<0,001) и 7,44 % (p<0,05) выше, чем в контроле (10,36±1,044).
Лучшие результаты развития отмечены для искусственно активированных ооцитов культивируемых с 6-ДМАП. Однако существенной разницы между этой
Рис. 2. Развитие искусственно активированных ооцитов свиней до стадии бластоцисты.
группой и группой ооцитов, обработаных цитохалази-ном Б не выявлено ни по доле дробления, ни по доле развития бластоцист.
Выводы. Таким образом, мы установили положительное влияние 6-диметиламинопурина (6-ДМАП) и цитохалазина Б на развитие ооцитов свиней in vitro: доля дробления активированных ооцитов после культивирования в течение 3 часов в присутствии 6-ДМАП и цитохалазина Б повышалась на 26,8 (p<0,001) и 23,8 % (p<0,01), а доля развитых бластоцист на 11,0 (p<0,001) и 7,4 % (p<0,05), по сравнению с контролем, соответственно. Несмотря на лучшие показатели, полученные при использовании 6-ДМАП достоверных различий между I и II группой ооцитов по изучаемым параметрам не выявлено.
Литература.
1. Lee G.S., Kim H.S, Hyun S.H., Kim D.Y., Lee S.H., Nam D.H., Jeong Y.W., Kim S., Kang S.K., Lee B.C., Hwang W.S. Improved developmental competence of cloned porcine embryos with different energy supplements and chemical activation. //Mol. Reprod. Dev. - 2003. - 66. - 17-23.
2. Kurome M., Ueda H., Tomii R., Naruse K., Nagashima H. Production of transgenic-clone pigs by the combination of ICSImediated gene transfer with somatic cell nuclear transfer. //Transgenic Research. - 2006. - 15. - 229-240.
3. Song K., Hyun S.H.,Shin T., Lee E. Post-Activation Treatment With Demecolcine Improves Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos in Pigs by Modifying the Remodeling of Donor Nuclei. // Mol.Reprod. Dev. - 2010. - 76. - 611-619
4. Сингина Г.Н., Ермакова С.Г., Лопухов А.В., Зиновьева Н.А. Влияние дбцАМФ на созревание и развитие искусственно активированных ооцитов свиней в зависимости от прилегающих к ним слоев кумулюсных клеток// Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - №1. - С. 51-55.
5. Gil M.A., Cuello , Parrillal С., Vazquez J.M.,Roca J., Martinez I.A. Advances in Swine In Vitro Embryo Production Technologies. //Reprod. Dom. Anim. - 2010. - 45 (Suppl. 2) . - 40-48
6. Uhm S. J., Chung H.M., Kim C., Shim H., Kim N.H., Lee H.T., Chung K. S. In vitro development of porcine enucleated oocytes reconstructed by the transfer of porcine fetal fibroblasts and cumulus cells. //Theriogenology. - 2000. - 54. - 559-570.
7. Silvestre M.A., Alfonso J., Garcia-Mengual E., Salvador I.,.Duque C.C., Molina I. Effect of recombinant human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone on in vitro maturation of porcine oocytes evaluated by the subsequent in vitro development of embryos obtained by in vitro fertilization, intracytoplasmic sperm injection, or parthenogenetic activation. //J Anim Sci. - 2007. - 85. - 1156-1160
8. Kragh P. M., Vajta G., T. J. Corydon T.J., Purup S., Bolund L., Callesen H. Production of transgenic porcine blastocysts by handmade cloning. //Reproduction Fertility and Development. - 2004. - 6. - 315-318
9. Koo D.B., Kang Y. K., Park J.S., J. K. Park J.K.,. Chang W.K., Lee K.K., Han Y.M. A paucity of structural integrity in cloned porcine blastocysts produced in vitro.//Theriogenology. - 2004. - 62. - 779-789
10. Lee J.W., Tian X.C., Yang X. Optimization of parthenogenetic activation protocol in porcine. //Mol. Reprod. Dev. - 2004. - 68. - 51-57.
11. Kim Y.S., Lee S.L., Ock S.A., Balasubramanian S., Choe S.Y., Rho G.J. Development of cloned pig embryos by nucleartransfer following different activation treatments. //Mol.Reprod. Dev. - 2005. - 70. - 308-313.
12. Im G.S, Samuel M., Lai L., Hao Y., Prather R.S. Development and calcium level changes in pre-implantation porcine nuclear transfer embryos activated with 6-DMAP after fusion. //Mol. Reprod. Dev. - 2007. - 74. - 1158-1164
13. Li Y., Liu J, J Dai J., Xing F., Fang Z, Zhang T., Z Shi Z., D Zhang D., Chen X.. Production of Cloned Miniature Pigs by Enucleation using the Spindle View System .//Reprod Dom Anim. - 2010. - 45. - 608-613.
EFFECT OF ACTiVATiON CONDiTiONS ON DEVELOPMENT OF PARTHENOGENETiC PORCiNE
EMBRYOS iN ViTRO
G.N Singina, A.V. Lopukhov, N.A. Zinovieva
Summary. The positive effect of 6-dimetilaminopurin (6-DMAP) and cytochalasin B on the development of pig oocytes in vitro was shown. The cleavage rate of activated oocytes after their culture in presence of 6-DMAP and cytochalasin B for 3 hours was increased on 26.8 (p <0.001) and 23.8 (p <0.01) per cent and the blastocyst formation rate was increased on 11.0 (p <0.001) and 7.4 (p <0.05) per cent, respectively comparing to controls.
Key word: pig, oocytes, activation, cytochalasine B, 6-dimethylaminopurine, embryo, parthenogenesis, in vitro.
