Факторы, влияющие на развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота invitro Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Биологий It

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РАЗВИТИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ІМУІТРО

Г. Н. СИНГИНА,

кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии,

А. А. ОВЧИННИКОВ, аспирант,

Т. Е. ТАРАДАЙНИК,

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник,

Н. А. ЗИНОВЬЕВА,

доктор биологических наук, заместитель директора,

А. В. ЛОПУХОВ,

младший научный сотрудник, ГНУ Всероссийский

научно-исследовательский институт с л - -

* * 142132, Московская область, Подольским район,

животноводства Россельхозакадемии п. Дубровицы; тел. (4967)65-ii-°i

Ключевые слова: крупный рогатый скот, invitro, ооцит, эмбрион, полярное тельце, клонирование, время созревания.

Keywords: cattle, invitro, oocyte, embryo, nuclear transfer, polar body, maturation time.

Время созревания ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) имеет существенное значение для получения клонированных эмбрионов invitro. В условиях invivo выделение первого полярного тельца (ППТ) происходит между 19-25 ч. [2]. Ученые из разных стран используют разное время созревания ОКК от 14 до 24 ч. [3], а также технику энуклеации ооцитов, которая может осуществляться несколькими способами. Один из них — применение флуоресцентного красителя Hoechst 33342 при энуклеации хромосом ооцита на стадии MII, который негативно влияет на жизнеспособность яйцеклеток и метод «слепой энуклеации», который проводится без окрашивания ооцитов, при этом ориентиром расположения метафаз-ных хромосом служит первое полярное тельце.

Целью нашей работы являлось получение клонированных эмбрионов коров invitro в зависимости от времени созревания ОКК.

Материалы и методы исследования.

Материалом для исследований служили яичники половозрелых коров и телок, отобранные после убоя. Выделение ОКК проводили методом рассечения видимых фолликулов. Культивирование ОКК осуществляли группами по 30-40 ооцитов в модифицированной среде ТС199, содержащей 25 мМHEPES, 1 мМ№-пирувата, 10 % фетальной сыворотки телят (FCS), 0,5 мкг/мл ФСГ и

0,5 мкг/мл ЛГ, 50 мкг/мл гентамицин сульфата. По окончанию периода созревания ОКК обрабатывали 0,1 % раствором гиалуронидазы, механически удаляли кумулюс-ные клетки (КК) и отбирали ооциты с ППТ. Источником кариопластов служили эмбриональные фибробласты из плода крупного рогатого скота в возрасте 50 дней, выделенные по стандартной методике [1]. Эмбриональные фибробласты культивировали в среде ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, дополненной 1 мМпирувата натрия, 10 % сыворотки плода коров, 1 % несущественных аминокислот и 50 мкг/мл гентамицин сульфата.

Синхронизацию клеточного цикла эмбриональных фибробластов на стадии G0/G1 проводили методом контактного ингибирования. Суспензию клеток для процедуры переноса получали, обрабатывая монослой раствором трипсин/ЭДТА.

Проведение процедуры энуклеации ооцитов и переноса соматических клеток в полученный цитопласт осуществляли методом прямого прокола зоны пеллюцида

на микроскопе NiconDiaphotc с использованием трехмерного гидравлического микроманипулятора с точной настройкой фирмы Narishige.

Цитопласт и кариопласт объединяли методом электрослияния в микрокамере с использованием Мультипоратора фирмы Eppendorf.

Активацию полученных цитогибридов проводили в среде ТС199, содержащей 25 мМHEPES, 10 % FCS, 50 мкг/мл гентамицин сульфата и 5 рМ иономицина в течение 5 мин. с последующим культивированием цитогибридов в среде содержащей 2 мМб-DMAP. Через 4 ч. их переносили в специализированную среду и культивировали в течение 7 дней до стадии бластоцисты.

Созревание ооцитов, культивирование цитогибридов и эмбриональных фибробластов происходило в условиях инкубатора при t = +38,5°С, 5 % СО2 и максимальной влажности.

С целью определения влияния времени созревания на эффективность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота ОКК культивировали invitro в течение 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ч.

В первом эксперименте по окончания периода созревания по общему количеству ооцитов с ППТ оценивали процент ядерного созревания, а также количество ооцитов, у которых хромосомы на стадии метафазы II находились непосредственно рядом с первым полярным тельцем (ППТ + MII). Процент ядерного созревания ооцитов определяли в 4 независимых экспериментах как отношение числа ооцитов с ППТ и ППТ + MII к общему числу ооцитов, поставленных на созревание.

Во втором эксперименте по окончания периода созревания ооциты подвергали процедуре «слепой» энуклеации и переноса соматических клеток. Оценивали эффективность энуклеации и процент развития цитогибридов до стадии бластоцисты.

Эффективность энуклеации ооцитов определяли в трех независимых экспериментах как отношение числа ооцитов без собственных хромосом и ППТ к общему числу ооцитов, подвергнутых процедуре энуклеации.

Для определения локализации хромосом относительно ППТ и степени удаления их при энуклеации, оголенные ооциты инкубировали в течение 5 мин. в растворе Hoechst 33342 (5 мкг/мл) и подвергали флуоресцентной микроскопии.

Биология

Таблица 1

Эффективность энуклеации ооцитов коров в зависимости от продолжительности созревания

Время созревания, ч

Рисунок 1

Выделение и локализация ППТ относительно МП в зависимости от продолжительности созревания ооцитов коров invitro. Число экспериментов: п = 4

Для оценки достоверности различий между исследуемыми группами использовали критерий х2. Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы SigmaStat.

Результаты исследований и обсуждение.

Установлено, что выделение первого направительного тельца и его расположение относительно хромосом на стадии метафазы второго деления мейоза зависит от продолжительности созревания ооцитов коров ^йго (рис. 1).

Через 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ч. созревания доля ооцитов с ППТ составила 29,16 ± 4,15 %, 34,16 ± 4,33 %, 65,8 ± 4,33 %, 80,0 ± 3,65 %, 82,2 ± 3,52 %, 77,0 ± 3,94 %, 74,5 ± 4,09 %, 65,25 ± 4,38 % соответственно. Данный показатель линейно нарастал и имел наибольшее значение через 24 созревания, затем тенденция менялась в обратную сторону. Достоверно ниже (Р < 0,001) по сравнению с другими группами была доля ооцитов с ППТ через 16 и 18 ч. культивирования. В ооцитах, созревающих в течение 20 и 30 ч., также наблюдалось достоверное снижение (Р < 0,01) доли ооцитов с ППТ (на 16,4 % и 16,95 % соответственно) по сравнению с максимальным значением. Не обнаружено существенных отличий в степени выделения ППТ в ооцитах, созревающих в течение 22 и 26 ч. (ниже пикового значения на 2,2 % и 5,2 % соответственно).

Сходная динамика наблюдалась по показателю расположения ППТ непосредственно рядом с хромосомами на стадии метафазы второго деления мейоза. Доля ооцитов с ППТ + М11 через 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ч. созревания составило 6,67 ± 2,28 %, 20,0 ± 3,69 %, 45,90 ± 4,55 %, 75,0 ± 3,95 %, 79,67 ± 3,70 %, 73,69 ± 4,12 %, 44,74 ± 4,66 %, 13,56 ± 3,15 % соответственно. Данный показатель был выше в период с 22-26 ч. созревания по сравнению с другими группами (Р < 0,001) с максимальным значением в группе ооцитов, культивированных в течение 24 ч. До данного периода и после него локализация ППТ резко менялась и процент ооцитов с оптимальным его расположением достоверно снижался.

Оценка эффективности «слепой» энуклеации в зависимости от продолжительности периода созревания ОКК представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что энуклеация ооцитов, созревающих в течение 16, 18, 20, 22 и 24 ч., сопровождается высокой степенью удаления собственного генетического

Время созревания, ч Количество энуклеированных ооцитов, n Получено цитопластов, n Эффективность энуклеации, %

16 110 102 92,80 ± 2,467

18 109 106 97,30 ± 1,553

20 112 110 98,30 ± 1,223

22 106 104 98,20 ± 1,293

24 110 107 97,30 ± 1,546

26 105 90 85,71 ± 3,410

28 109 70 64,22 ± 4,592

30 104 47 45,19 ± 4,885

20

h 15

5

О 1- 10

ч

ш ГС с 5 п —

й 0 II ,

16 18

J__________________L

20 22 24 26 28 30

Время созревания, ч

Рисунок 2

Развитие клонированнных цитогибридов в зависимости от продолжительности созревания коров invitro. Число

экспериментов: n = 3

материала. С увеличением продолжительности созревания до 26 ч. наблюдалось резкое изменение результативности реконструирования и доля ооцитов, в которых не обнаруживалось после окрашивания Hoechst 33342 свечения хромосом, достоверно снижалась (P < 0,01). Возможной причиной снижения эффективности энуклеации является миграция ППТ относительно метафаз-ных хромосом и/или его постепенное разрушение вследствие старения яйцеклетки. Поэтому более длительное культивирование ОКК (28 , 30 ч.) приводило к еще большему достоверному снижению доли полноценных цитопластов после энуклеации (Р < 0,001).

Время созревания ОКК коров invitro существенно влияло и на развитие клонированных цитогибридов до стадии бластоцисты (рис. 2).

Наивысший процент развития бластоцист был получен при использовании в качестве цитопласта ооцитов, созревающих в течение 22 и 24 ч. (17,3 % и 17,0 % соответственно). Он был больше по сравнению с группами 16, 18 и 30 ч. на 13,9 % (Р < 0,01), 12,0 % (Р < 0,01) и 11,3 % (Р < 0,05) соответственно.

Выводы.

Время созревания ооцит-кумулюсных комплексов существенно влияет на результативность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота invitro. В данной системе созревания оптимальным временем культивирования ОКК является период с 22-24 ч. Использование ооцитов, созревающих в течение данного периода, позволяет проводить энуклеацию без предварительного окрашивания флуорисцентными красителями и получать наибольший процент клонированных бластоцист.

Литература

1. Савченкова И. П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. Дубровицы, 1999. С. 94.

2. Van der Westerlaken L. A. J., Van der Schans A., Eyestone W. H., de Boer H. A. Kinetics of first polar body extrusion and the effect of time of stripping of the cumulus and time of insemination on developmental competence of bovine oocytes // Theriogenology. 1994. № 42. P. 361-70.

3. Ward F., Enright B., Rizos D., Boland M., Lonergan P. Optimization of in vitro bovine embryo production: effect

of duration of maturation, length of gamete co-incubation, sperm concentration and sire // Theriogenology. 2002. № 57. P. 2105-2117.