CC BY
33
шением толерантности к глюкозе (уровень гликемии через 2 ч после употребления глюкозы составил 7,2+0,3 ммоль/л). Через 2—3 мес. после лечения начиналось снижение утренних показателей сахара крови у пациентов с СД 2 типа, нормализация наступала через 5-7 мес. В течение 2—3 мес. после введения СК постепенно снижалась концентрация С-пептида, а его нормализация наступала через 6—9 мес. Нормализация липидного профиля отмечалась через 9—12 мес. после лечения у 75% пациентов на фоне снижения показателей триглицеридов, холестерина, ЛНП, ЛОНП и ЛВП.
Работы проводились с соблюдением международных норм биоэтики, в соответствии с Законом Украины «О трансплантации органов и других анатомических материалов человека» № 1007 — XIV от 16.07.1999 г.
М.М. Одинак, Г.Н. Бисага, А.В. Новицкий,
В.В. Тыренко, Д.Г. Полынцев, П.В. Кругляков,
А.А. Билибина, М.С. Фоминых, А.Д. Соболев Клиническая эффективность аутогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при рассеянном склерозе и боковом амиотрофическом склерозе
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия bisaga@yandex.ru
М.М. Odinak, G.N. Bisaga, A.V. Novitsky, V.V. Tyrenko,
□.G. Polintsev, P.V. Krugljakov, A.A. Bilibina, M.S. Fominykh,
A.D. Sobolev
Clinical efficacy of autologous multipotent mesenchymal stem cells transplantation in multiple sclerosis and amyotrophic latéral sclerosis
Трансплантация стволовых клеток признана наиболее перспективным направлением терапии прогрессирующих и дегенеративных заболеваний центральной нервной системы.
Обследовано 12 пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС; 5 женщин, 7 мужчин, возраст 41—63 года, длительность заболевания 18—57 мес., степень тяжести 32—20 баллов шкалы ALSSS) и 8 пациентов с рассеянным склерозом (PC; 3 женщины,
5 мужчин, возраст 24—47 лет, длительность заболевания 4—14 лет, тип течения - 3 с рецидивирующе-ремиттирующим, 3 с вторично-прогрессирующим, 1 с прогрессирующе-ремиттирующим, 1 с первично-прогрессирующим, степень тяжести 3,543,5 баллов шкалы EDSS). Мультипотентные мезенхимальные стромаль-ные клетки (ММСК) были получены из красного костного мозга этих пациентов. Рост ММСК, иммунофенотип и кариотип, стерильность, отсутствие примеси гемопоэтических клеток, хромосомных аберраций и признаков старения контролировали в процессе выращивания.
Обратное введение ММСК проводили в соответствии с разработанным протоколом путем короткой внутривенной инфузии в дозе 2,0x108/кг массы тела, кратностью 1 раз в 30 сут. Длительность терапии составляла от 1 до 22 мес.
Повторные внутривенные трансфузии ММСК все больные перенесли хорошо, какие-либо значимые побочные эффекты как в раннем, так и в отдаленном периоде терапии не выявлены. Легкий побочный эффект в виде невысокой транзиторной гипертермии в течение 8—10 часов наблюдали у 2 пациентов после
одного из введений; умеренная головная боль в течение 3—4 ч отмечена у 2 пациентов с БАС; повышение общей утомляемости в течение 2 сут. после каждого введения наблюдали у 2 пациентов с PC.
У 6 больных с БАС в процессе лечения отмечали стабилизацию состояния, отсутствие прогрессирования и регресс отдельных симптомов заболевания в течение 4—10 мес. В последующем эффективность лечения снижалась, несмотря на продолжение лечения, и общее состояние и неврологический статус постепенно вновь начинали ухудшаться. У остальных 6 пациентов с БАС эффект от лечения отсутствовал с самого начала.
Выбор пациентов с PC по этическим аспектам осуществляли с учетом эффективности предшествующей терапии: 6 пациентов были резистентны ко всем (или большинству) видам терапии, обычно применяемой при PC (препараты ПИТРС (копаксон, бетаферон), кортикостероиды, плазмаферез). У 2 пациентов была отмечена невосприимчивость ко всем видам лечения, включая эскалацию терапии с проведением высоко-дозной иммуносупрессивной терапии с последующей аутотрансплантацией стволовых кроветворных клеток. Положительный ответ на лечение ММСК у высокорезистентных к лечению больных с PC наблюдали в 4 из
6 случаев. В целом у 6 из 8 больных с PC наблюдали улучшение состояния с снижением степени тяжести PC на 0,5—1,0 балла по шкале EDSS.
Полученные результаты свидетельствуют о безопасности разработанного протокола лечения и значимой клинической эффективности данного варианта клеточной терапии (в 50% у больных БАС и 75% у больных PC) у некурабельных или труднокурабельных больных с БАС и PC, что позволяет рассчитывать на продолжение исследования и включение в него новых пациентов.
Г.В. Павлова, А.В. Ревищин
Влияние трансгенных нейротрофических
факторов на развитие нейральной ткани
ГУ Институт биологии гена РАН,
Москва, Россия G. Pavlova, A. Revishchin
Influence of neurotrophic factors transfected into Drosophila cells on the development of mammalian neural tissue
Исследованы возможности использования эмбриональных нервных клеток, экспрессирующих трансгенные нейротрофические факторы, для управления дифференцировкой и развитием нервной ткани млекопитающих. Для этой цели проводили эксперименты по сокультивированию эмбриональных спинальных ганглиев крысы с трансгенными эмбриональными клетками дрозофилы, в геном которых введены гены нейротрофических факторов: NGF — фактора роста нервов, GDNF — глия производного нейротрофического фактора, BDNF — мозг-производного нейротрофического фактора. Наблюдали направленное прорастание волокон из спинального ганглия к трансгенной ткани, которое начиналось уже через 1—2 ч кокультивации. Показано, что присутствие трансгенных нейротрофических факторов NGF, GDNF и BDNF стимулирует прорастание отростков нервных клеток спинальных ганглиев.
В экспериментах по исследованию влияния гиперэкспрессии нейротрофических факторов на образование
глиального рубца клетки линии НЕК-293, трансфици-рованые конструкцией, содержащей ген gdnf, трансплантировали взрослым мышам линии СВА. Имму-ногистохимическая окраска срезов мозга мышей, проживших после трансплантации 18 сут., на белковые маркеры рубцовой ткани, показала, что присутствие трансгенного gdnf в трансплантированных клетках уменьшает глиальную посттравматическую реакцию окружающей трансплантат ткани мозга. Результаты подтверждают перспективность применения GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии.
Для успешного применения перечисленных выше трансгенов в генной и клеточной терапии необходимо иметь конструкции с управляемой экспрессией трансгенного продукта. Полученная нами конструкция, содержащая промотор гена белка теплового шока дрозофилы Ihsp70) и репортерный ген синего флуоресцентного белка (СФБ) под тем же промотором, была введена в геном эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) мышей. Трансформированные клетки обнаруживали выраженное голубое свечение только после предварительного температурного шока, полученного прогреванием культуры ЭСК при 39°С в течение 30 мин.
Таким образом, показана возможность использования промоторов дрозофилы для регуляции экспрессии в клетках млекопитающих чужеродных генов, полезных при лечении различных, в частности, нейродеге-неративных, заболеваний.
A.Ю. Петренко 1 а, Ю.А. Петренко 1 а, А.И. Правдюк \
С.П. Мазур 1 а, Р.В. Иванов 3, Ю.В. Степаненко 3,
B.И. Лозинский 3, В.И. Грищенко 1 а Пролиферация и дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при культивировании в альгинатных микрокапсулах и широкопористых губках
1 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАНУ, Харьков, Украина
2 Межведомственный научный центр криобиологии и криомедицины, Харьков, Украина
3 Институт элементоорганических соединений им. АН. Несмеянова, РАН, Москва, Россия alexanderjetrenko@cryo.org.ua
A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, A.I. Pravduk, S.P. Mazur,
R.V. Ivanov, Yu.V. Stepanenko, V.l. Lozinsky, V.l. Grischenko Proliferation and differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells in culture within alginate microbeads and wide pore sponges
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) характеризуются мультилинейным дифференцировочным потенциалом, что определяет перспективу их применения в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Монослойное культивирование является классическим подходом для изучения клеток, в том числе и ММСК. Однако в этой системе клеткам доступно только двухмерное пространство, тогда как в естественных условиях они имеют трехмерную архитектонику.
Целью работы явилось изучение пролиферации и диф-ференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека при монослой-ном и объемном культивировании в составе альгинатных микрокапсул и широкопористых криогелевых губок.
ММСК выделяли из костного мозга взрослого человека в соответствии с этическими нормами. После экспансии в монослойной культуре иммунофенотип
клеток определяли методом проточной цитофлуори-метрии. Для инкапсуляции ММСК смешивали с раствором альгината натрия и распыляли в раствор, содержащий ионы кальция. После гелеобразования получали микрокапсулы размером 500^1000 мкм с иммобилизированными клетками. Широкопористые губки изготавливали из альгината методом криоструктурирования. Модификацию адгезивных свойств носителя проводили ковалентным присоединением к поверхности пор желатина типа А. Пролиферацию и метаболическую активность определяли Alamar Blue тестом. Дифференцировку осуществляли добавкой соответствующих индуцирующих факторов в среду культивирования, продукты дифференцировки определяли биохимическими и гистологическими методами.
Цитофлуориметрические исследования показали, что клетки, изолированные из костного мозга взрослого человека, после 4-го пассажа имели иммунофенотип, характерный для ММСК (CD29 + , CD44 + , CD73+, CD105+, CD34\ CD450. В ходе последующего монослойного культивирования в среде экспансии клетки активно пролиферировали, а в присутствии соответствующих индуцирующих факторов ММСК дифференцировались в остеогенном и адипогенном направлениях. После инкапсуляции в альгинатные микрокапсулы ММСК не распластывались, сохраняя сферическую форму, и практически не пролиферировали при последующем культивировании в среде экспансии. Вместе с тем, альгинат-инкапсулированные ММСК сохраняли жизнеспособность, метаболическую активность и способность к индуцированной дифферен-цировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях. Остановка пролиферации ММСК в альгинатных микрокапсулах может быть обусловлена потерей ориентации клеток в гомогенном полужидком окружении или низкими адгезивными свойствами альгината. Для выяснения этого вопроса ММСК культивировали в широкопористых губках на основе альгината. При заселении таких губок ММСК вели себя так же, как при инкапсуляции в микросферы — не адгезирова-лись к их поверхности, что сопровождалось потерей способности к пролиферации. Прямое введение желатина в концентрациях от 0,125% до 0,5% в альгинатный носитель не обеспечивал адгезию и пролиферацию ММСК. Модификация альгинатных губок путем ковалентной сшивки желатиновых наночастиц к поверхности пор увеличивала адгезивные свойства носителя. В ходе последующего культивирования в широкопористых альгинатных губках с модифицированной желатином поверхностью пор ММСК пролиферировали и мигрировали, занимая весь объем носителя. Изучение дифференцировочных возможностей показало, что ММСК в составе вышеуказанных губок способны дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях.
Выводы:
1. ММСК в составе альгинатных микрокапсул или широкопористых губок не способны к пролиферации в результате низких адгезивных свойств альгината.
2. Модификация альгинатного носителя путем химического присоединения якорных частиц желатина к поверхности пор сопровождается адгезией клеток и их пролиферацией.
3. Для индуцированной дифференцировки ММСК в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях не требуется столь прочный контакт с поверхностью как для пролиферации; дифференцировочный
