CC BY
51
Контролем служили клетки, культивировавшиеся без гелевого препарата. Культуру клеток наблюдали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diavert (Nikon, Япония). Фотографии делали цифровой камерой Nikon D5000. Цифровое усиление контраста проводили с помощью программы Image J. Люминесцентную микроскопию проводили с помощью микроскопа Olympus ВХ61 (Япония). Использовали цифровую камеру CoolSNAP (США).
В результате проведенных исследований было выяснено, что оба вида ММСК для сохранения жизнеспособности требуют доступа к культуральному пластику. При микроскопическом наблюдении в течение нескольких дней стало ясно, что оба типа клеток прикрепляются к пластику в свободных от геля местах и сохраняют нормальную структуру и жизнеспособность по МТТ-тесту. Таким образом, можно полагать, что изучаемый материал не обладает выраженной цитотоксичностью, однако клетки не в состоянии использовать его как непосредственный субстрат для роста. Со временем такие неприкрепившиеся клетки погибают от анойкиса (апоптоз от невозможности прикрепиться).
Для определения влияния гелевого материала на пролиферацию клеток сначала высаживали клетки в лунки, а затем добавляли «Индост-гель + ». В этих условиях клетки достаточно хорошо росли под гелем. Их количество после недели культивирования было сходным с контролем, что позволяет утверждать об отсутствии отрицательного влияния материала на пролиферацию.
При исследовании индукции дифференцировки в культуре положительный результат был получен после исключения аскорбата из состава индуцирующей среды и снижении количества добавляемого гелевого материала. В этом случае на 21-е сут. культивирования активность ЩФ в опыте была существенно выше (р<0,05), чем в контроле. Показателем стимулирования остеогенной дифференцировки было также более высокое отложение минерализованного матрикса. В тот же срок культивирования гелевый материал подвергается контракции в результате объединения клетками мелких частиц в более крупные образования с тем, чтобы компактизовать и изолировать гель. Похожее действие производят фибробласты при добавлении к ним гранул коллагена. По биологическому смыслу это действие in vivo направлено на очистку раны.
В.Н. Никандров, О.Н. Жук
Компоненты перицеллюлярного протеолиза
в биотехнологии клеток нервной ткани
Институт физиологии НАН Беларуси,
Минск, Республика Беларусь
V.N. Nikandrov, O.N. Juk
The components of pericellular proteolysis
biotechnology in cells of nervous tissue
Обобщены результаты собственных исследований роли плазминогена и стрептокиназы в жизнедеятельности клеток нервной ткани в органотипических, диссоциированных культурах чувствительных и симпатических ганглиев, неокортекса, а также перевиваемых линий глиомы С6, нейробластомы IMR-32 и феохро-моцитомы РС12.
В дефицитной по белкам сыворотки крови питательной среде плазминоген и стрептокиназа стимулировали жизнеспособность клеток, и в концентрации
Ю-7—1 Q-ю |\/| защищали клетки чувствительных, симпатических ганглиев, неокортекса и перевиваемых линий от повреждающего действия Н202 (0,0001 М), NH4CI (0,01 М), глутамата, АТР (0,001 М) в анионной форме и охлаждения. Даже кратковременная экспозиция (20 мин) клеток глиомы С6 или феохромоцито-мы РС12 с этими белками в концентрации 10~9 М вела к резким изменениям перицеллюлярного или внутриклеточного АТР- или Са2+-активируемого протеолиза. В присутствии изучаемых белков активировались биосинтетические процессы в клетках нервной ткани, изменялась их энзиматическая активность.
Исследуемые белки в ряде случаев ускоряли созревание культур ткани, улучшали адгезивность, обеспечивали высокую жизнеспособность, увеличивали количество отростков и их арборизацию. Электронная микроскопия выявила характер структурных перестроек клеток нервной ткани, отражающих нейротрофические свойства плазминогена или стрептокиназы. Стрептокиназа способна регулировать водно-элетролитный баланс клетки.
Обсуждается значение полученной совокупности результатов в фундаментальном и прикладном аспектах, включая проблемы биотехнологии нервной ткани.
А.В. Новицкая, А.А. Смикодуб, М.П. Демчук,
И.В. Архипенко
Фетальные стволовые клетки в лечении метаболического синдрома
Центр эмбриональных тканей «ЭмСелл»
Киев, Украина infocenter@emcell.com
A.V. Novytska, А.А. Smikodub, М.P. Demchuk, I.V. Arkhipenko Fetal Stem Cells in Metabolic Syndrome
Под наблюдением находились 12 пациентов (7 мужчин и 5 женщин, средний возраст 58,0+6,3 лет) с клиническими проявлениями метаболического синдрома. У всех пациентов была гипертония I-II степени, нарушения углеводного обмена: нарушение толерантности к глюкозе — 8 пациентов и сахарный диабет (СД) 2 типа легкой степени (утренняя гипергликемия, аг-люкозурия) с гиперинсулинемией и повышением уровня +
циентов имели место нарушения липидного обмена: повышение уровня холестерина, триглицеридов, повышенная концентрация липопротеидов низкой плотности (ЛНП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), снижение концентрации липопротеидов высокой плотности (ЛВП) и абдоминальное ожирение ++
+
Всем пациентам проведена трансплантация фетальных гемопоэтических и негемопоэтических стволовых клеток (СК) мезенхимального и эндодермального происхождения, полученных из ростковых зон внутренних органов трупов фетусов человека 4—8 нед. гестации.
После введения пациенты наблюдались на протяжении 1—5 лет. Через 1—2 мес. после трансплантации отмечали постепенное снижение артериального давления с дальнейшей его стабилизацией в течение последующих 2—3 месяцев — 135—140/80—90 мм рт. ст. на фоне снижения дозы гипотензивных препаратов у 83% пациентов. Тест на толерантность к глюкозе, проведенный через 7—9 мес. после лечения, показал улучшение углеводного обмена у пациентов с нару-
шением толерантности к глюкозе (уровень гликемии через 2 ч после употребления глюкозы составил
+
чиналось снижение утренних показателей сахара крови у пациентов с СД 2 типа, нормализация наступала через 5-7 мес. В течение 2—3 мес. после введения СК постепенно снижалась концентрация С-пептида, а его нормализация наступала через 6—9 мес. Нормализация липидного профиля отмечалась через 9—12 мес. после лечения у 75% пациентов на фоне снижения показателей триглицеридов, холестерина, ЛНП, ЛОНП и ЛВП.
Работы проводились с соблюдением международных норм биоэтики, в соответствии с Законом Украины «О трансплантации органов и других анатомических материалов человека» № 1007 — XIV от 16.07.1999 г.
М.М. Одинак, Г.Н. Бисага, А.В. Новицкий,
В.В. Тыренко, Д.Г. Полынцев, П.В. Кругляков,
А.А. Билибина, М.С. Фоминых, А.Д. Соболев Клиническая эффективность аутогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при рассеянном склерозе и боковом амиотрофическом склерозе
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия bisaga@yandex.ru
М.М. Odinak, G.N. Bisaga, A.V. Novitsky, V.V. Tyrenko,
D.G. Polintsev, P.V. Krugljakov, A.A. Bilibina, M.S. Fominykh,
A.D. Sobolev
Clinical efficacy of autologous multipotent mesenchymal stem cells transplantation in multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis
Трансплантация стволовых клеток признана наиболее перспективным направлением терапии прогрессирующих и дегенеративных заболеваний центральной нервной системы.
Обследовано 12 пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС; 5 женщин, 7 мужчин, возраст 41—63 года, длительность заболевания 18—57 мес., степень тяжести 32—20 баллов шкалы ALSSS) и 8 пациентов с рассеянным склерозом (PC; 3 женщины,
5 мужчин, возраст 24—47 лет, длительность заболевания 4—14 лет, тип течения - 3 с рецидивирующе-ремиттирующим, 3 с вторично-прогрессирующим, 1 с прогрессирующе-ремиттирующим, 1 с первично-прогрессирующим, степень тяжести 3,543,5 баллов шкалы EDSS). Мультипотентные мезенхимальные стромаль-ные клетки (ММСК) были получены из красного костного мозга этих пациентов. Рост ММСК, иммунофенотип и кариотип, стерильность, отсутствие примеси гемопоэтических клеток, хромосомных аберраций и признаков старения контролировали в процессе выращивания.
Обратное введение ММСК проводили в соответствии с разработанным протоколом путем короткой внутривенной инфузии в дозе 2,0x108/кг массы тела, кратностью 1 раз в 30 сут. Длительность терапии составляла от 1 до 22 мес.
Повторные внутривенные трансфузии ММСК все больные перенесли хорошо, какие-либо значимые побочные эффекты как в раннем, так и в отдаленном периоде терапии не выявлены. Легкий побочный эффект в виде невысокой транзиторной гипертермии в течение 8—10 часов наблюдали у 2 пациентов после
одного из введений; умеренная головная боль в течение 3—4 ч отмечена у 2 пациентов с БАС; повышение общей утомляемости в течение 2 сут. после каждого введения наблюдали у 2 пациентов с PC.
У 6 больных с БАС в процессе лечения отмечали стабилизацию состояния, отсутствие прогрессирования и регресс отдельных симптомов заболевания в течение 4—10 мес. В последующем эффективность лечения снижалась, несмотря на продолжение лечения, и общее состояние и неврологический статус постепенно вновь начинали ухудшаться. У остальных 6 пациентов с БАС эффект от лечения отсутствовал с самого начала.
Выбор пациентов с PC по этическим аспектам осуществляли с учетом эффективности предшествующей терапии: 6 пациентов были резистентны ко всем (или большинству) видам терапии, обычно применяемой при PC (препараты ПИТРС (копаксон, бетаферон), кортикостероиды, плазмаферез). У 2 пациентов была отмечена невосприимчивость ко всем видам лечения, включая эскалацию терапии с проведением высоко-дозной иммуносупрессивной терапии с последующей аутотрансплантацией стволовых кроветворных клеток. Положительный ответ на лечение ММСК у высокорезистентных к лечению больных с PC наблюдали в 4 из
6 случаев. В целом у 6 из 8 больных с PC наблюдали улучшение состояния с снижением степени тяжести PC на 0,5—1,0 балла по шкале EDSS.
Полученные результаты свидетельствуют о безопасности разработанного протокола лечения и значимой клинической эффективности данного варианта клеточной терапии (в 50% у больных БАС и 75% у больных PC) у некурабельных или труднокурабельных больных с БАС и PC, что позволяет рассчитывать на продолжение исследования и включение в него новых пациентов.
Г.В. Павлова, А.В. Ревищин
Влияние трансгенных нейротрофических
факторов на развитие нейральной ткани
ГУ Институт биологии гена РАН,
Москва, Россия G. Pavlova, A. Revishchin
Influence of neurotrophic factors transfected into Drosophila cells on the development of mammalian neural tissue
Исследованы возможности использования эмбриональных нервных клеток, экспрессирующих трансгенные нейротрофические факторы, для управления дифференцировкой и развитием нервной ткани млекопитающих. Для этой цели проводили эксперименты по сокультивированию эмбриональных спинальных ганглиев крысы с трансгенными эмбриональными клетками дрозофилы, в геном которых введены гены нейротрофических факторов: NGF — фактора роста нервов, GDNF — глия производного нейротрофического фактора, BDNF — мозг-производного нейротрофического фактора. Наблюдали направленное прорастание волокон из спинального ганглия к трансгенной ткани, которое начиналось уже через 1-2 ч кокультивации. Показано, что присутствие трансгенных нейротрофических факторов NGF, GDNF и BDNF стимулирует прорастание отростков нервных клеток спинальных ганглиев.
В экспериментах по исследованию влияния гиперэкспрессии нейротрофических факторов на образование
