CC BY
25
© Коллектив авторов, 2007 УДК: б1б.37 - 002:б1б.127
ВЛИЯНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНОГО ОСТРЫМ ПАНКРЕАТИТОМ НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ЭРИТРОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ПАНКРЕАТИТОМ
П.С. Филипенко, Г.С. Ивченко, Г.В. Потапов Ставропольская государственная медицинская академия
Острый панкреатит (ОП) сопровождается повышенным «уклонением» ферментов из поджелудочной железы в кровь и снижением активности основного ингибитора сериновых протеиназ a1 - антитрипсина [10]. Вследствие этого сыворотка крови становится токсичной для форменных элементов крови, в том числе эритроцитов. Другой возможной причиной повреждения эритроцитов может быть интенсификация свободнорадикальных процессов, связанная с генерацией нейтрофильными лейкоцитами в очагах воспаления активных форм кислорода (HOCl, HOJ, HOBr) и со снижением активности антиоксидантной защиты эритроцитов, результатом чего является возрастание их чувствительности к перекисным процессам [9]. Роль сыворотки крови в этих процессах неясна. В связи с этим нами была поставлена задача изучить в опытах in vitro влияние сыворотки крови больных острым панкреатитом на антиоксидантную активность и перекисное окисление липидов (ПОЛ) эритроцитов и эритроцитарных мембран больных острым панкреатитом.
Материал и методы. Использовали кровь 21 здорового донора (контрольная группа) и 93 больных ОП. Исследовали отмытые 0,9% раствором NaCl эритроциты и очищенные мембраны эритроцитов. Активацию ПОЛ вызывали инкубацией эритроцитов и мембран эритроцитов здоровых людей с 0,5 мл плазмы крови больного ОП (диастаза 2480 ед.). Плазму с образцами эритроцитов инкубировали 30 мин. при 37°С. Мембраны выделяли методом дифференцированного центрифугирования при 35 000 g. Липиды экстрагировали смесью гексан-изопропанол (2:1) [7] с добавлением в экстрагируемую смесь 102М ионола для предотвращения спонтанной индукции ПОЛ. Содержание диеновой конъюгации (ДК) определяли по методу И.А. Волчегорского и соавт. (1989) [2], малонового диальдегида (МДА) по методу И.Д. Стальной [б]. Активность каталазы (КА) определяли кинетически по поглощению Н2О2 в УФ-об-ласти [4], активность глюкозо-б-фосфатдегндрогеназы (Г-б-ФДГ), глутатионредуктазы (ГР), глутатионперок-сидазы (ГП) по Ф.Е. Путилиной (1982) [5]. Результаты
исследования обработаны методом корреляционного и вариационного анализа при р не < 95%.
Результаты и обсуждение. В остром периоде ОП в эритроцитах наблюдалось увеличение ДК и статистически незначимое повышение МДА. Это могло быть связано либо с меньшим накоплением МДА в эритроцитах или с утилизацией первичных продуктов ПОЛ на стадии зарождения цепей. Высказанное предположение подтверждено обратной корреляцией между названными показателями (г = 0,817, р<0,01).
Изменение системы, сопряженной с окислением восстановленного глутатиона, сопровождалось торможением активности Г-6-ФДГ и ростом ГР и ГП. Максимальное увеличение активности среди исследованных ферментов отмечено для каталазы (4,6 раза). Ее активность при ОП прямо коррелировала с изменениями ДК (г = 0,876), МДА (г = 0,942), ГП (г = 0,976), ГР (г = 0,891) и обратное Г-6-ФДГ (г = 0,831). Аналогичное повышение активности КА, ГР, ГП, СОД отмечено при инкубации изолированных альвеолярных макрофагов, отмытых эритроцитов в атмосфере 95% кислорода под обычным давлением. Активация антиокислительных ферментов в этом случае является первой реакцией организма на увеличение интенсивности ПОЛ [1]. Наиболее чувствительным индикатором процесса следует считать КА [3].
Известно, что большая часть антиокислительных ферментов локализована в растворимой фазе клетки, в то время как процесс ПОЛ затрагивает в основном структурированные липиды мембранных образований [8]. Представлялось целесообразным выяснить возможность участия ферментов в регуляции ПОЛ на мембране эритроцитов. Работая с очищенными мембранами эритроцитов, мы обнаружили, что в некоторых образцах мембран больных ОП, в отличие от интакт-ных эритроцитов, имело место достоверное накопление МДА после их контакта с плазмой крови больного ОП. Мы предположили, что определенное значение в торможении пероксидации могла иметь КА, поскольку активность фермента, связанного с мембраной, изменялась в широких пределах - от 6,50 до 75,78 ммоль Н2О2
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА, № 1, 2007
на мг белка за 1 минуту.
В то же время в интактных эритроцитах активность КА не изменилась в широких пределах после контакта с плазмой крови больного ОП. Наличие двух максимумов активности КА со средними значениями 74,121±4,276 и 17,715±0,972 мкмоль Н2О2 на мг белка в мембранах послужило основанием для выделения двух типов мембран: с высоким (тип I) и низким (тип II) значением активности КА. Мембраны I типа были у 39 больных, а II типа у 54 больных. Активность Г-6-ФДГ в мембранах I типа была на 21 % ниже (р<0,05), а в мембранах II типа на 19% выше (р<0,018), чем в интактных мембранах эритроцитов. При изучении активности ГП, ГР отмечена более высокая активность ферментов в мембранах II типа, чем первого (р<0,01). Таким образом, мембраны эритроцитов отличались не только по активности КА, но и по скорости включения антиокислительных ферментов в процесс детоксикации органических продуктов ПОЛ.
Изучение природы связи КА и других антиокислительных ферментов с мембраной эритроцитов показало, что при выделении ферментов количество отмывок не влияет на активность КА, Г-6-ФДГ, ГП, ГР. Мы предположили, что на активность ферментов, возможно, оказывает влияние их физико-химическое взаимодействие с мембраной, обусловленное глубиной погружения гидрофобной части фермента в липидный бислой. После обработки мембран 0,6 М раствором ионного детергента КО связанной с мембраной активности КА оставалось всего 10% от ее первоначальной величины (р<0,01), ГП- 100%, ГР-80% (р<0,05), Г-6-ФДГ-7% (р<0,01). Экстракция же связанных с мембраной ферментов 1% тритоном Х-100 приводила к солюбилизации 90% ферментов. Учитывая то обстоятельство, что КО солюбилизирует поверхностно расположенные и удерживаемые на мембране за счет ионных взаимодействий белки, а тритон Х-100 модифицирует липидный бислой мембраны и вычленяет значительно больше, чем КО, гидрофобных белков из липидов, можно предположить, что КА и Г-6-ФДГ, в отличие от ГР и ГП, относятся к периферическим белкам эритроцитарной мембраны. Ферменты сорбируются и удерживаются на ней с помощью ионных взаимодействий; активность же ферментов определяется, вероятно, особенностями мембраны. Выводы
1. В эритроцитах здоровых людей в присутствии плазмы крови больного ОП процесс ПОЛ обрывается на стадии зарождения цепей (ДК), а у больных острым панкреатитом принимает цепной свободнорадикальный характер с образованием МДА.
2. На уровне эритроцитарных мембран происходит более существенная активация процесса ПОЛ, степень которого зависит от структуры мембраны и первоначальной активности, связанных с мембраной ферментов.
3. КА и Г-6-ФДГ связаны с мембранами эритроцитов лабильно, а ГП и ГР более жестко.
4. В мембранах с высокой активностью КА анти-окислительный процесс осуществляет каталазная реакция. В мембранах с низкой каталазной активностью это происходит за счет ферментов окислительно-восстановительного перехода глутатиона.
5. Низкая активность ГП при высокой активности КА служит показателем резистентности эритроцитов к повреждающему действию плазмы крови больного ОП,
в то время как низкая активность при высокой ГП указывает на низкую резистентность мембран к переокис-лению.
Литература
1. Арчаков, А.И. Модификация белков активным кислородом и их распад / А.И. Арчаков, Н.М. Мохосев // Биохимия. - 1989. - Т. 54, вып. 2. - С. 179-186.
2. Волчегорский, И.Н. Сопоставление различных подходов к опредлению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-пропропанольных экстрактах крови // Вопр. мед. химии. - 1989. - № 1. - С. 127-131.
3. Ивченко, Г.С. Зависимость изменения активности свободнорадикальных процессов от сроков развития острого панкреатита: Дис. ... к-та мед. наук / Г.С. Ивченко. - Ставрополь, 2006. - 135 с.
4. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова и др. // Лаб. дело. - 1988.
- № 1. - С. 16-19.
5. Путилина Ф.Е. // Методы биохимических исследований / под ред. М.П. Прохоровой. Л., 1982. - С. 181 - 183.
6. Стальная, И.Д. // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Орехович. - М., 1977. - С. 63-64.
7. Таранова, Н.П. Микрометод определения общих липидов в лимфоцитах и другом биологическом материале / Н.П. Таранова, Л.В. Говорова // Вопр. мед. химии. - 1987. - №2.
- с. 132-136.
8. Филипенко, П.С. Механизмы повреждения и защиты поджелудочной железы при остром панкреатите : Дис. ... д-ра мед. наук / П.С. Филипенко. - Ставрополь, 1996. - 335 с.
9. Esierhauer, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynon-enal, malonaldehyde and related aldehydes / H. Esierhauer, R.J. Schaur, H. Zollner // Free Radic. Biol. Med. - 1991.
- Vol. 11. - P. 81-128.
10. Wefers, H. Oxidation of glutathione by the superoxide radical to the disulfide and the sulfonate yielding singlete oxygen / H. Wefers, H. Sies // Eur. J. Biochem. - 1983. - Vol. 137, № l-2. - P. 29-36.
ВЛИЯНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНОГО ОСТРЫМ ПАНКРЕАТИТОМ НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ЭРИТРОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ПАНКРЕАТИТОМ
П.С.ФИЛИПЕНКО, Г. С. ИВЧЕНКО, Г.В. ПОТАПОВ
Исследованы продукты перекисного окисления липидов (диеновая конъюгация ненасыщенных жирных кислот и малоновый диальдегид) и ферменты антиокислительной системы (каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза и глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназа) в отмытых 0,9% раствором ШС1 эритроцитах и эрит-роцитарных мембранах 21 донора и 93 больных ОП. Установлено, что в эритроцитах в присутствии плазмы крови больного острым панкреатитом активизируются процессы перекисного окисления липидов, возрастает активность антиокисли-тельных ферментов. На уровне мембран происходит более существенная активация процесса, степень которой зависит от структуры мембраны и первоначальной активности, связанных с мембраной ферментов. Каталаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа связаны с мембраной эритроцитов лабильно, а глутатионпероксидаза и глутатионредук-таза более жестко.
Ключевые слова: острый панкреатит, свободнорадикальные процессы, антиокислительные ферменты
EFFECT OF BLOOD SERUM IN ACUTE PANCREATITIS UPON THE FREE RADICAL PROCESSES I N RED CELLS OF HEALTHY VOLUNTEERS AND PATIENTS
FILIPENKO P.S., IVCHENKO G.S., POTAPOV G.V.
Lipid peroxidation products (diene conjugation of nonsaturated fat acids and malonic dialdehyde) and enzymes of antioxidizing system (catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase and glucose 6-phosphate dehydrogenase) were studied in swept by 0,9 % NaCl solution red cells and erythrocytic membranes of 21 donors and 93 patients with acute pancreatitis (AP). Lipid peroxidation processes and antioxidizing enzymes in blood cells were evidently activated by plasma of acute pancreatitis patients. More essential activation of the above process was observed in cell’s membranes and depended on the membrane structure and initial activity of the membrane-bound enzymes. Cata-lase and glucose 6-phosphate dehydrogenase binding with erythrocytic membranes was labile, while glutathione peroxidase connection with glutathione reductase was more stable.
Key words: an acute pancreatitis, free radical processes, anti-oxidizing enzymes
