CC BY
32
УДК:616.61:615.254.6-073.755.4
ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОБМЕНА ГЛУТАТИОНА В ТКАНИ ПОЧЕК ПРИ ВВЕДЕНИИ РЕНТГЕНОКОНТРАСТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
С.И. ГЛУШКОВ14, С.Н. ЖЕРЕГЕЛЯ23, А.И. КАРПИЩЕНКО24, А.Н. ЛОДЯГИН1, П.Н. ЧЕРЕМИСИНА2, А.М. АНТОНОВА1
1 Государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе»,
2Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Медицинский информационно-аналитический центр»,
3Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» МЗ РФ, 4Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет» МЗ РФ
Представлены экспериментальные данные о воздействии при введении неионного рентгеноконтраст-ного препарата в дозе LD50 на обмен глутатиона в тканях почек белых беспородных крыс. Определялась концентрация восстановленного глутатиона, сульфгидрильных групп белков и малонового диальдегида, активность глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы и каталазы. Диагноз рентгеноконтрастная нефропатия подтверждался морфологически и на основании определения лабораторных показателей нарушения функции почек - концентрации креатини-на и мочевины в сыворотке крови животных. Показано снижение активности ферментов обмена глутати-она и активация процессов перекисного окисления липидов в тканях почек лабораторных животных. Отмечается участие нарушений обмена глутатиона в патогенезе развития рентгеноконтрастных нефропатий. Ключевые слова: рентгеноконтрастные средства, рентгеноконтрастная нефропатия, омнипак, глута-тион, перекисное окислениелипидов, глутатионпероксидаза, каталаза, глутатион^трансфераза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глутатионредуктаза.
CHANGES IN INDICES OF GLUTATION METABOLISM IN KIDNEY TISSUES AFTER ADMINISTRATION OF RADIO-OPAQUE SUBSTANCES
14S.I. GLUSHKOV, 23S.N. JERЕGELYA, 24 KARPISHENKO A.I., 1 LODYAGIN A.N., 2CHERMISINA P.N., 1ANTONOVA A.M.
1 Saint Petersburg Scientific Research Centre of Emergency Care named after Djaniledze,
2 Saint Petersburg «Medical Information-Analytical Centre,
3 Saint Petersburg State Pediatric Medical Institute,
4 First Saint Petersburg State Medical University
Experimental data about the influence of non-ion radio-opaque preparation administered in dose LD50 to glutation metabolism in kidney tissues of white non-purebred rats. Reduced glutation, sulphhydril group proteins and malonic dialdehyde concentration, activity of glutationreductase, glucosae-6-phosphatdehydrogenase, glutationperoxydase, glutation S-transferase and catalases. The diagnosis of radio-opaque substance nephropathy is proved in morphologic study and based on laboratory data of kidney tests - serum creatinine and urea of animals. Results show decreased activity of glutation metabolism enzymes and activation of peroxyd oxidation of lipids in kidney tissue of laboratory animals. The involvement of glutation metabolism disturbances in pathogenesis of radio-opaque nephropathies is demonstrated.
Key words: radio-opaque substances, radio-opaque nephropathy, omnipaque, glutation, lipid peroxyd oxidation, glucosae-6-phosphatdehydrogenase, glutationperoxydase, glutation S-transferase, catalase, glutationreductase.
В течение последних лет значительно увеличилась частоты применения рентгеноконтрастных средств (РКС) при проведении урографии, ангиографии, компьютерной томографии и операционных процедур. Ежегодно в мире используется более 80 млн доз РКС, но, несмотря на использование более новых и менее нефротоксич-ных препаратов, риск рентгеноконтрастной нефропатии (РКН) остается значительным, особенно у пациентов с предшествующим нарушением функции почек. РКН стала третьей по частоте причиной острой почечной не-
достаточности (ОПН) у госпитализированных пациентов [12, 22]. Распространённость РКН в общей популяции не превышает 2%, однако в группах высокого риска (пациенты пожилого возраста, с гипертензией, сахарным диабетом, сердечной недостаточностью) распространённость РКН достигает 20-30% [16, 20, 21].
Рентгеноконтрастная нефропатия определяется как повышение уровня креатинина на 44 мкмоль/л, или на 25% по сравнению с исходным значением. Критерии острого повреждения почек (ОПП) KDIGO (Kidney Disease:
Improving Global Outcomes) являются более жесткими и позволяют диагностировать первую стадию ОПП при повышении уровня креатинина на 26 ммоль/л.
Критерии ОПП не были изучены применительно к РКН, но рекомендованы для определения ОПП независимо от этиологии. В случае РКН определение ОПП основывается на изменении уровня креатинина, так как критерий олигурии (диурез менее 0,5 мл/ч/кг массы тела в течение более 6 ч) не распространяется на многие случаи РКН, а проведение инфузионной терапии с профилактической целью до и после процедуры увеличивает объем мочи.
Обычное течение РКН проявляется преходящим бессимптомным повышением уровня креатинина в течение 24-48 часов после внутрисосудистого введения йодсо-держащего РКС, достигает максимума через 3-5 дней, возвращается к исходному уровню через 7-10 дней, но может сохраняться до 3-х недель [9].
Для диагноза РКН необходимо исключение других причин ОПП, так как небольшое увеличение уровня креатинина выявляется у 8-35% госпитализированных пациентов и в отсутствие контрастного исследования [5, 24].
Экспериментальные исследования зарубежных авторов показали, что в развитии РКН определенную роль играет повышенное образование свободных радикалов, которые оказывают повреждающее действие на эпителиальные клетки канальцев [14, 18]. Важная роль в поддержании клеточного гомеостаза, в том числе и защите клетки от повреждающего воздействия свободных радикалов, принадлежит обмену глутатиона, а его нарушения могут принимать участие в реализации цитоток-сических эффектов действия ряда ксенобиотиков.
Таким образом, поиск средств для профилактики развития РКН невозможен без глубокого детального изучения патогенеза поражения почечной ткани, а роль нарушений обмена глутатиона в формировании цито-токсического эффекта от введения высоких доз РКС требует более детального изучения [3, 4].
Цель. Изучение функционального состояния обмена глутатиона в тканях почек лабораторных животных при введении неионного рентгеноконтрастного препарата в среднесмертельной дозе.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проводилось на 80 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Экспериментальную РКН у животных вызывали путем внутрибрюшинно-го введения омнипака-350 в среднесмертельной дозе. Омнипак-350 (йогексол) - водный раствор 1М, 1М-бис (2,3-дигидроксип-ропил)-5-[1М-(2,3-дигидроксипропил) ацетамид 2,4,6-трииодизоталамида («Nicomed», Норвегия)]. Определение LD50 препарата проводили с использованием «табличного экспресс-метода», ее численные значения составили 20 г/кг массы животного. Животных забивали через 1, 3 и 5 суток после однократного вну-трибрюшинного введения препарата. Диагноз РКН подтверждался морфологически и на основании определения креатинина в сыворотке крови.
20 контрольным животным, в те же сроки внутри-брюшинно вводили физиологический раствор в объеме, соответствующем объему вводимого препарата. После
затравки до момента забоя животные опытных групп содержались в тех же условиях, что и животные контрольных групп.
В ткани почек экспериментальных животных определяли показатели обмена глутатиона: концентрацию восстановленного глутатиона (ВГ), сульфгидрильных групп (СГ) белков, активность глутатионредуктазы (ГР), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), глутатион-пероксидазы (ГП), глутатион-Б-трансферазы (ГТ) и ка-талазы. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА), а также определяли показатели нарушения функции почек (концентрация креатинина и мочевины).
Концентрацию ВГ определяли методом G.L. Ellman [13], содержание СГ - по методике G. Bellomo [10], МДА -по методу М. Uchiyama [25]. Определение активности ферментов обмена глутатиона проводили в цитозоль-ной фракции, полученной после центрифугирования го-могенатов тканей в течение 1-го часа при 150 тыс. g на ультрацентрифуге L8-M («Весктап», США). Активность ГР определяли по методу I. Garlberg [11], Г-6-Ф-ДГ - по A. Kornberg [19], ГП - по методу А.Н. Гавриловой [2], ката-лазы - по М.А. Королюку [5], глутатион-Б-трансферазы - методом W.H. Habig [10]. Расчет активности ферментов производили на 1 г белка. Концентрацию белка определяли методом Лоури в модификации G.L. Peterson [24]. Концентрацию креатинина и мочевины определяли на автоматическом биохимическом анализаторе «Synchron» («Весктап-Coulter», США).
Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statistica 10,0. В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стьюдента. Приведенные в тексте и таблицах значения представлены в виде Хср±тх.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показателем развития РКН у лабораторных животных явилось достоверное повышение к 3-м суткам концентрации мочевины в 1,8 раза и креатинина в 1,5 раза в сыворотке крови (табл. 1).
Таблица 1. Концентрация мочевины и креатинина (ммоль/л) в сыворотке крови крыс после введения омнипака в дозе 20 г/кг
Группа Срок исследования, сут Мочевина Креатинин
Крысы, получавшие омнипак, LD50 1-е 2,19±0,83 27,01±2,65
3-и 3,95±0,31* 39,19±3,69*
5-е 2,39±0,45 29,31±1,01
Контроль 2,17±0,19 26,40±4,34
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем.
По данным гистологического исследования воздействие РКС на почки лабораторных животных характеризовалось развитием острого некроза канальцев. В 1-е
сутки отмечалась субтотальная баллонная гидропиче-ская дистрофия, в большинстве случаев переходящая в колликвационый некроз с отсутствием лейкоцитарной инфильтрации. К 3-м суткам повреждения достигали максимума: развивался субтотальный некроз почечной паренхимы. И только на 5-е сутки у выживших животных происходило частичное разрешение патологического процесса, при этом сохранялась дискомплексация эпителиальной выстилки канальцев, субтотальная зернистая дистрофия.
В связи с тем, что обмену глутатиона присущи признаки саморегулирующейся биохимической системы [6,7], степень ее нарушения (в том числе и декомпенсацию ее функциональных возможностей) следует оценивать, исходя из активности входящих в нее ферментов. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что нарушения обмена системы глутатиона, являющейся естественной системой цитопротектции, оказыва-
ются активно задействованными в патогенезе развития РКН.
Активность тиол-зависимых ферментов обмена глутатиона, таких как глутатионредуктаза, глутатион-Б-трансфераза и глутатионпероксидаза, на протяжении всего эксперимента достоверно (р<0,05) снижалась и к 5-м суткам для ГР составляла 38,5% от контроля, для ГТ -38%, для ГП - 51%, (табл. 2, 3). Еще более выраженным было снижение активности другого фермента антиокси-дантной защиты - каталазы, которая на 3-и сутки была ниже (р<0,05), чем у контрольных животных в 4,4 раза.
Нарушение активности ферментов антиоксидантной защиты (ГП, ГТ и каталазы) в условиях применения РКС приводило к активации свободнорадикальных процессов. Подтверждением этого факта может служить увеличение содержания МДА в тканях почек животных, которое на 3-и сутки достоверно превышало уровень контроля в 1,5 раза (табл. 4).
Таблица 2. Активность ГТ, ГП и каталазы в тканях почек крыс после введения омнипака в дозе 20 г/кг
Группа Срок исследования, сут ГТ, мкмоль/мин-г белка ГП, ммоль/мин-г белка Каталаза, мкмоль/ мин-г белка
Крысы, получавшие омнипак, LD50 1-е 196,0±23,1 3,15±0,36 428,1±117,8
3-и 136,8±21,1* 2,16±0,35* 138,9±23,8*
5-е 96,8±7,4* 1,83±0,21* 334,6±59,1*
Контроль 254,8±26,2 3,61±0,30 606,5±70,4
Примечание. То же, что и к табл. 1.
Таблица 3. Активность ГР и Г-6-ФДГ в тканях почек крыс после введения омнипака в дозе 20 г/кг
Группа Срок исследования, сутки ГР, мкмоль/мин-г белка Г-6-ФДГ, ммоль/мин-г белка
Крысы, получавшие омни- 1-е 190,4±27,6 15,23±5,87*
пак, LD50 3-и 106,7±15,4 34,94±8,80
5-е 59,3±5,7* 23,98±5,23*
Контроль 154,1±21,7 55,79±9,45
Примечание. То же, что и к табл. 1.
Таблица 4. Концентрация ВГ, СГ белков и МДА в тканях почек крыс после введения омнипака в дозе 20 г/кг
Группа Срок исследования, сут ВГ, ммоль/г ткани СГ, мкмоль/г ткани МДА, нмоль/г ткани
Крысы, получавшие омнипак, LD50 1-е 7,37±0,35 17,3±1,2 178,2±8,6
3-и 6,82±0,14 19,6±1,2* 230,8±18,4*
5-е 6,93±0,16 21,5±2,3* 179,1±6,5
Контроль 7,44±0,30 14,5±1,6 156,6±9,2
Примечание. То же, что и к табл. 1.
Снижение активности ГР в тканях почек животных, получавших РКС, сопровождалось нарушением активности второго фермента, принимающего участие в процессах восстановления глутатиона из окисленной формы, - Г-6-ФДГ (табл. 3). На протяжении всего периода исследования наблюдалось достоверное снижение его активности. В 1-е сутки активность Г-6-ФДГ составила 27% (р<0,05) от нормы, а к 5-м суткам увеличилась лишь до 43%.
Таким образом, в условиях воздействия РКС происходят нарушения в обоих важных звеньях обмена глутатиона. При этом повреждаются как ферменты, на-
рабатывающие ВГ (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и глутатионредуктаза), так и ферменты, утилизирующие данное соединение при обезвреживании свободных радикалов и органических гидроперекисей (глутатионпероксидаза, глутатион-Б-трансфераза и каталаза).
ВГ не принимает непосредственного участия в метаболизме РКС в качестве конъюгирующего агента, а его уровень не всегда является интегральным показателем обмена глутатиона. Исследование обмена глутатиона в тканях почек животных, получавших омнипак, выявило отсутствие достоверного снижения концентрации ВГ на протяжении всего эксперимента (табл. 4). Однако
установлено, что существенным сдвигам в условиях развития РКН подвергается не содержание восстановленной формы глутатиона, а интенсивность его обмена в тканях, что проявляется снижением восстановления глутатиона и глутатион-зависимых энзимов антирадикальной защиты.
Возможно, пусковым механизмом воздействия РКС на метаболические процессы в тканях почек явилась способность влиять на состояние тиол-дисульфидного равновесия. На это указывает достоверное повышение содержания сульфгидрильных групп, которое достигало максимума на 5-е сутки исследования, превысив в 1,5 раза (р<0,05) контрольные значения (табл. 4).
Таким образом, можно предположить, что метаболиты йодсодержащих рентгеноконтрастных препаратов плохо подвергаются конъюгации и активно блокируют сульфгидрильные группы различных ферментов, в том числе принимающих участие в восстановлении глутатиона из окисленной формы (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы), что ведет к функциональному дефициту содержания ВГ в клетке [10, 11]. В дальнейшем снижения уровня ВГ не происходит, так как заблокированными оказываются и ферменты, его утилизирующие, при осуществлении антирадикальной защиты клетки (глутатионпероксидаза и глутатион-Б-трансфераза). Более выраженному инги-бирующему влиянию подвергается каталаза. Уменьшение активности антиоксидантных ферментов, в основе котороой лежит снижение интенсивности обмена глутатиона, приводит к дисбалансу про- и антиоксидантных систем клетки, что становится причиной повреждения мембранных структур и гибели клеток [1,8].
Таким образом, полученные данные об изменениях обмена глутатиона в тканях почек лабораторных животных позволяют уточнить механизмы патогенеза развития нефропатии на фоне применения неионных РКС, связанные с реализацией цитотоксических эффектов действия и с нарушениями состояния естественной системы цитопротекции. Это подтверждает правомерность существования цитотоксической гипотезы развития РКН.
Комплексное изучение обмена глутатиона в условиях развития РКН позволило выявить наличие пусковых механизмов реализации цитотоксических эффектов, связанных с прямым повреждением или снижением активности ряда ферментов обмена глутатиона, а также расширило наши представления о патогенезе развития РКН, что дает возможность поиска новых средств для профилактики и лечения данной патологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белевитин А.Б. и др. Лабораторно-диагностиче-ские критерии оценки эффективности токсико-модифицирующего действия препарата глуток-сим при химиотерапии лимфосаркомы Плисса в эксперименте. Вестн Рос. воен-мед акад 2009; 28: 28-34.1
2. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Хмара Н.Ф. Измерение диеновых конъюгатов в плазме крови по УФ-поглощению гептановых и изопропанольных экстрактов. Лаб дело 1988; 2: 60-64.
3. Карпищенко А.И. и др. Динамика глутатионре-дуктазной активности тканей почек в условиях развития ренгеноконтрастных нефропатий. Вестн Рос. воен-мед акад 2007; 1 (17), 1: 370.
4. Карпищенко А.И. и др. Изменения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности при формировании ренгеноконтрастных нефропатий. Вестн Рос. воен-мед акад 2007; 1 (17); 1: 370.
5. Королюк М.А. Метод определения активности ка-талазы. Лаб дело 1988; 1: 16-19.
6. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона. Успехи соврем биологии 1990; 110 (1 (4): 20-37.
7. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона. Успехи биол химии 1990; 31: 157-179.
8. American Heart Association. Heart Dis. Stroke Stat 2006; Update: 35.
9. Barrett B.J., Parfrey P.S. Preventing nephropathy induced by contrast medium. New Engl Med 2006; 354: 379-86.
10. Bellomo G., Thor H., Orrenius S. Modulation of cellular glutathione and protein thiol status during qui-none metabolism. Meth Enzymol 1990; 186: 627-35.
11. Carlberg I., Mannervik B. Glutathione reductase. Meth Enzymol 1985; 113: 484-90.
12. Dangas G. et al. Contrast-induced nephropathy after percutaneous coronary interventions in relation to chronic kidney disease and hemodynamic variables. Amer Cardiol 2005; 95: 13-9.
13. llman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem. Biophys 1959; 82 (1): 70-7.
14. Fishbane S. et al. N-acetylcysteine in the prevention of radiocontrast-induced nephropathy. J Amer Soc Nephrol 2004; 15: 251-60.
15. Fliser D., Laville M., Covic A. et al. European Renal Best Practice (ERBP) position statement on the Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Clinical Practice Guidelines on Acute Kidney Injury: Part 1: definitions, conservative management and contrast-induced nephropathy. The adhoc working group of ERBP. Nephrol Dial Transplant 2012; 27 (12): 4263-72.
16. Goldenberg I., Matetzky S. Nephropathy induced by contrast media: pathogenesis, risk factors and preventive strategies. CMAJ 2005; 172: 1461-71.
17. Habig W.H., W.B. Jakoby Assay for differentiation of glutathione S-transferases. Meth Enzymol 1981; 77: 398-405.
18. Heyman S.N. et al. N-acetylcysteine ameliorates renal microcirculation: studies in rats. Kidney Int 2003; 63: 634-41.
19. Kornberg A. et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase - 6-phosphogluconicdehydrogenase. Meth Enzymol 1955; 1: 323-7.
20. Maeder M. et al. Contrast nephropathy; review focusing on prevention. J Amer Coll Cardiol 2004; 44: 1763-71.
21. Marenzi G. et al. Contrast-induced nephropathy in patients undergoing primary angioplasty for acute myocardial infarction. J Amer Coll Cardiol 2004; 44: 1780-5.
22. Nash K., Hafeez A, Hou S. Hospital-acquired renal insufficiency. Amer Kidney Dis 2002; 39: 930-6.
23. Newhouse J.H., Kho D., Rao Q.A., Starren J. Frequency of serum creatinine changes in the absence of iodin-ated contrast material: implications for studies of contrast nephrotoxicity. Amer J Roentgenol 2008; 191 (2): 376-82.
24. Peterson G.L. Simplification of protein assay method of Lowry et al - which is more generally applicable. Anal Biochem 1977; 83 (2): 346-56.
25. Uchiyama M., Michara M. Determination of malonal-dehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal Biochem 1978; 86 (1): 271-8.
РЕНТГЕНКОНТРАСТ МОДДАЛАРНИ ЮБОРГАНДА БУЙРАК ТУКИМАСИДА ГЛУТАТИОН АЛМАШИНУВИ кУрсаткичлари
С.И. Глушков1,4, С.Н. Жерегеля2^, А.И. Карпищенко2,4, А.Н. Лодягин1, П.Н. Черемисина2, А.М. Антонова1
1 И.И. Джанелидзе номидаги Санкт-Петербург тез тиббий ёрдам ИТИ,
2 Санкт-Петербург ша*ар тиббиёт ахборот-та^лил маркази,
3 Санкт-Петербург давлат педиатрия тиббиёт университета, 4 Биринчи Санкт-Петербург давлат тиббиёт университет
Ок наслсиз каламушларнинг буйраги тукимасида глататион алмашинувига ионсиз рентгенконтраст моддани LD50 дозада юборгандаги таъсири тажрибада урганилган. Тикланган глутатион, оксилларнинг сульфгидрил гуру^и ва малондиальдегиднинг концентрацияси *амда глататионредуктаза, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа, глутатионпе-роксидаза, глататион-Б-трансфераза ва каталазанинг фаоллиги аникланган. Рентгенконтрастли нефропатия диагно-зи морфологик текширувлар оркали ва буйрак фаолияти бузилишини курсатувчи лаборатор та^лиллар, яьни жони-ворларнинг кон зардобидаги креатинин ва мочевинанинг микдори буйича тасдикланган. Лаборатор жониворларнинг буйраги тукимасида глататион алмашинуви ферментларининг фаоллиги пасайиши ва перекисли оксидпаниш жара-ёнларининг кучайиши курсатилган. Рентгенконтраст нефропатиялар ривожланиши патогенезида глататион алмаши-нувининг бузилиши катнашиши кайд килинган.
Калит сузлар: рентгеноконтраст моддалар, рентгеноконтрастли нефропатия, омнипак, глутатион, ли-пидларнинг перекисли оксидланиши, глутатионпероксидаза, каталаза, глутатион-Б-трансфераза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глутатионредуктаза.
Контакт: Алексей Николаевич Лодягин,
д.м.н., руководитель отдела клинической токсикологии,
Санкт-Петербургский НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе.
Россия, Санкт-Петербург, Будапештская, 3
Тел.: 8 (812) 384-46-20.
E-mail: alodyagin@mail.ru.
