CC BY
93
УДК 541.64
ВЛИЯНИЕ СУЛЬФИДА НАТРИЯ В ПРИСУТСТВИИ ПАВ НА НАТИВНУЮ СТРУКТУРУ ПЕРЬЕВОГО КЕРАТИНА
© 2015 Е.Н. Розанова1, И.Б. Кометиани2, О.Н. Лопухина3, Е.С. Соболева4, А.А. Еськова5
1 канд. хим. наук, доцент кафедры химии
e-mail: rozanova.lena2012@yandex.ru
2 канд. биол. наук, доцент кафедры химии
e-mail: ilona. kometiani@gmail. com 3, 4 5 студенты по направлению «Химическая технология»
Курский государственный университет
Методами ИК-спектроскопии и турбидиметрии исследованы белоксодержащие композиции, полученные деструкцией пера составами на основе сульфида натрия и некоторых ПАВ. Спектры полученных полимеров регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре «ФСМ 1201». Оптические характеристики изучали на спектрофотометре «SHIMADZU».
Ключевые слова: перьевой кератин, сульфид натрия, ПАВ, ИК-спектроскопия, турбидиметрия.
Как известно, разрушению четвертичной структуры (дезагрегации) перьевого кератина способствуют следующие факторы: введение детергентов, изменение рН, повышение температуры и т.д.
Процесс нарушения конформации полипептидных цепей, вторичной и третичной структуры без разрыва пептидных связей, называемый денатурацией, также вызывается аналогичными воздействиями: повышением температуры растворов белка выше 60°С; рН<3-4 или рН>10; ультразвуковой обработкой; ультрафиолетовым излучением; введением органических растворителей; добавлением солей тяжелых металлов; введением детергентов и т. д.
Процесс денатурации способствует разворачиванию укладки цепей полипептидов. В ходе этого процесса утрачиваются свойства, характерные для нативного кератина. Денатурация принадлежит к группе гетерогенных процессов, именно поэтому перемешивание системы является важной и неотъемлемой операцией. При денатурации становятся доступны функциональные группы, ранее находящиеся в положении скрытых в нативном состоянии молекул. Следовательно, для того чтобы получить растворимый перьевой кератин, следует применять воздействия, вызывающие процесс денатурации.
В предыдущих работах такой подход был опробован с использованием сульфита натрия в присутствии медноаммиачного комплекса и ПАВ [Розанова и соавт. 2014а.; Розанова и соавт. 2014б].
Нами был выбран способ восстановительной деструкции дисульфидных связей в структуре кератина [А.с. СССР №102175, 1955]. Предлагаемый метод получения растворимой или пластичной модификации кератина основан на взаимодействии кератина с восстанавливающим агентом сульфидом натрия. В результате такой обработки дисульфидные связи в структуре цистиновых групп разрываются с
последующим присоединением по месту освободившихся валентностей натрия и выходом в качестве побочного продукта дисульфида натрия и образованием растворимой модификации кератина - кератеината натрия (1):
Я-Б-Б-Я + 2^8 ^ Я-БКа + Яг БК + №282 (1)
При доступе кислорода воздуха возможно окисление продуктов реакции до органических серосодержащих кислот (сульфоновые, сульфеновые, сульфиновые кислоты) (2).
Я-8Н ^ Я-БОН ^ Я-802Н ^ Я-БОзН (2)
сульфеновые сульфиновые сульфоновые кислоты кислоты кислоты
Поверхностно-активные вещества оказывают различное влияние на белки в зависимости от своей природы. Анионные ПАВ могут образовывать ассоциаты с белками при рН выше их изоэлектрической точки, когда белок заряжен отрицательно. Осаждение положительно заряженного белка при связывании анионных ПАВ -обычное свойство таких систем; при более высоких концентрациях ПАВ вновь происходит растворение осадка. Связывание белком ионных ПАВ, как правило, приводит к нарушению третичной структуры молекул белка. Анионные ПАВ оказывают на белки более сильное денатурирующее воздействие, чем катионные ПАВ. Напротив, неионные ПАВ не влияют на третичную структуру белка [Холмберг 2007].
Состав, применяемый в исследованиях для деструкции пера, включал сульфид натрия без ПАВ и в их присутствии. Из анионных ПАВ были использованы Иуёо1 №1003, Сульфонол АВС, Техароп №70, додецилсульфат натрия, детское и хозяйственное мыло; из неионных - Р1ап1аеаг, 0С-20; в качестве катионактивного ПАВ был использован Катамин АВ (моночетвертичное аммониевое основание). Также был опробован Афилан, который представляет собой смесь анионных и неионных ПАВ.
Очищенное и измельченное кератинсодержащее сырье подвергалось обработке реагентами и физическим воздействиям (нагрев, механическое перемешивание, обработка ультразвуком) в разной последовательности. Под влиянием деструктирующих факторов в условиях эксперимента кератин из нерастворимой формы переводили в растворимую форму.
В условиях эксперимента нами были получены образцы с различной степенью содержания в них растворимой формы кератина. Из рисунка 1 видно, что наибольший эффект был достигнут в составах с использованием ПАВ с торговыми наименованиями Иуёо1 №1003 (91,09%) и додецилсульфат натрия (90,40%). Наименьшее влияние оказали катионактивный ПАВ - Катамин АБ (40,70%) и неионогенный 0С-20 (56,59%).
Изучение продуктов дезагрегации нативного перьевого кератина под действием сульфида натрия показало, что превышение определенных соотношений между сульфидом и нативным перьевым кератином приводит к более глубокой деструкции кератина. При этом разрушается не только третичная и частично вторичная, но также и первичная структура белка в результате гидролиза с образованием олигопептидов с низкой молекулярной массой и аминокислот, что, в свою очередь, ведет к низкому выходу белка. Добавление ПАВ в реакционную систему также способствует увеличению выхода белка, наибольшее влияние оказывает присутствие анионных ПАВ, а наименьшее - катионактивный ПАВ Катамин АБ.
Рис. 1. Выход растворимого кератина пера для составов с применением сульфида натрия и некоторых ПАВ: по оси ординат выход растворимого кератина, %
Исследование содержания белка в образцах показало, что использованный нами сульфидный метод при определенных условиях приводит к разрушению структуры белка до более мелких полипептидов, пептидов и даже аминокислот, что существенно снижает выход высокомолекулярного белка (рис. 2).
Рис. 2. Выход высокомолекулярного белка для составов с использованием сульфида натрия и ПАВ: по оси ординат выход высокомолекулярного белка, %
По расчетным величинам диаметра статистического клубка, приведенным на рисунке 3, были определены массы частиц (рис. 4) по методике, представленной в предыдущих исследованиях [Розанова и соавт. 2014в]. В результате предварительной оценки можно предположить, что в изученных растворах кератина находятся частицы, у которых размеры и масса соответствуют порядку величин, установленных для больших комплексов (характеристический размер сферы ~100 нм, молекулярная масса ~107 - 1012) [Кантор, Шиммел 1984].
Рис. 3. Результаты определения по турбидиметрическому методу размера частиц растворимого перьевого кератина: по оси ординат - размер части ё, нм
Рис. 4. Результаты вычислений массы частиц перьевого кератина по турбидиметрическому методу: по оси ординат - масса частиц, 108 Ба
По полученным данным можно сделать вывод, что воздействие катионного ПАВ Катамин АБ способствует глубокому разрыву исходного кератина пухоперового сырья с образованием более мелких частиц в сравнении с действием остальных ПАВ.
Хроматография на бумаге с нингидрином показала наличие аминокислот в фугатах исследуемых образцов. Это подтверждает то, что при выбранном нами методе деструкции пухоперового сырья происходит разрушение не только третичной и вторичной, но также первичной структуры белка с образованием олигопептидов с низкой молекулярной массой и аминокислот.
Для выявления изменений в структуре перьевого кератина, происходящих под действием деструктирующих реагентов (сульфида натрия и ПАВ) в условиях ультразвуковой диспергации, были сняты ИК-спектры немодифицированного перьевого кератина и полученных образцов.
Полученные ИК-спектры были интерпретированы по положению отдельных максимумов поглощения. Вначале был проанализирован ИК-спектр пера в его нативной конформации, расшифровка которого приводится в таблице 1.
При анализе полученного ИК - спектра деструктированного перьевого кератина в сравнении с ИК-спектром пера наблюдается появление новой полосы поглощения в диапазоне 995-1225 см-1, соответствующей колебаниям 8=0 группы органических кислот.
Таблица 1
Полосы поглощения в ИК-спектре нативного перьевого кератина
и их расшифровка
Волновое число, см-1 Отнесение полос
510-540 Б-Б валентные колебания, слабая узкая полоса (не имеет практического значения)
667 (710-570) 0^1 валентные колебания, слабая широкая, практического значения не имеет
720-730 маятниковые колебания (СН2)п-фрагментов с п > 4
800-915 Б-Ыб деформационные колебания, слабая, практического значения не имеет
1080 1160 0-№1 валентные колебания
1236 амид III
1375-1460 асимметричные и симметричные деформационные колебания связи С-Н в СН2- и СН3-группах
1400 а-0Ы3 б
1450 СЫ2 б
1453 Б (- 0Ы2) б
1536 деформация связи №Ы (полоса амид II )
1646 растяжение связи 0=0 (полоса амид I)
1680-1720 валентные колебания С=О в карбоксильной группе, частично другие С=О
2920 2851 валентные колебания СН2, СН3 групп
2927 2963 валентные С-Н
3084 амид Б
3305 амид А, - К- Ы растяжение
3207 3342 3353 3443 валентные МЫ2 и КЫ (при образовании водородных связей низкие волновые числа) и уширение полосы
3420-3380 ассоциированные группы КЫ2, две полосы, вид спектра усложняется при перекрывании с -0Ы
3460-3420 3330-3070 свободная группа КЫ2, одна полоса ассоциированные группы КЫ2, одна полоса
3300-3500 валентные колебания ОН групп, связанные водородными связями
В таблице 2 приводится отнесение полос серосодержащих функциональных групп, полосы поглощения которых также присутствуют в ИК-спектре деструктированного кератина.
Это дает возможность рассуждать о степени разрушения дисульфидных мостиков, так как полосы поглощения, связанные с колебаниями групп С-Б (710-
570 см-1) и 8-8 (510-540 см-1), малоинтенсивны и для идентификации практического значения не имеют.
Таблица 2
Отнесение полос серосодержащих функциональных групп
Волновое число, см-1 Отнесение полос
870-690 8-0 полоса переменной интенсивности
980-1225 S=0st валентные сильная, иногда несколько полос
1030-1070 1140-1250 Я-803 -
~1030 ~980 Я-802 -
~1090 валентные колебания S=0st в Сульфиновые кислоты Я-802Н
1140-1125 валентные колебания S=0st в Эфиры сульфиновых кислот Я-802 Я
1260-1150 1080-1010 700-600 валентные колебания S=0st в Сульфокислоты Я-803Н
1420-1330 1200-1145 валентные колебания S=0st в Сульфонаты Я-0-802 Я
1355-1340 1165-1150 Я-802-0Н 0-Ш Н - связанная ~2900 ~ 2400 Гидратированная форма: ~ 2800-1650, широкая полоса
При анализе полученных ИК-спектров образцов было выявлено, что различия проявляются в неодинаковой интенсивности характеристических полос поглощения, в некотором их сдвиге, уширении или сужении, что может быть связано с изменениями, возникающими при диспергировании, на уровне межмолекулярных взаимодействий кератина пера и деструктирующих агентов.
Библиографический список
Берлин А.А. А.с. № 102175. Способ получения растворимой или пластичной модификации кератина. Заяв. 07.06.1955 г.
Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Т. 1-3: пер. с англ. М.: Мир, 1984
Розанова Е.Н. Получение растворимой формы белка перьевого кератина с помощью сульфита натрия в присутствии Cu2+ и различных ПАВ / Е.Н. Розанова, И.Б. Кометиани, А.А. Еськова, О.Н. Лопухина, Е.С. Соболева // 21 век: фундаментальная наука и технологии: сб. материалов IV Междунар. науч.-практич. конф., 16-17 июня 2014 г. North Charleston, USA, 2014а. С. 187-189.
Розанова Е.Н. Влияние ПАВ на морфологию комплексов меди и кератина, полученных деструкцией пера составами на основе сульфита натрия / Е. Н. Розанова, И.Б. Кометиани, А.А. Еськова, О.Н. Лопухина, Е.С. Соболева // Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014б. № 3(3). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/003-004.pdf (дата обращения: 13.03.2015).
Розанова Е.Н., Использование турбидиметрического метода для определения размеров молекул белка и комплексов меди с кератином, полученных деструкцией пера составами на основе сульфита натрия / Е.Н. Розанова, Е.В. Грехнева, О.Н. Лопухина, Е.С. Соболева, А.А. Еськова // Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014в. № 4(4). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/004-006.pdf (дата обращения: 13.03.2015).
Холмберг К. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах /
К. Холмберг, Б. Йёнссон, Б. Кронберг, Б. Линдман; пер. с англ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. 528 с.
