Использование турбидиметрического метода для определения размеров молекул белка и комплексов меди с кератином, полученных деструкцией пера составами на основе сульфита натрия Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

УДК 541.64

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРОВ МОЛЕКУЛ БЕЛКА И КОМПЛЕКСОВ МЕДИ С КЕРАТИНОМ, ПОЛУЧЕННЫХ ДЕСТРУКЦИЕЙ ПЕРА СОСТАВАМИ НА ОСНОВЕ СУЛЬФИТА НАТРИЯ

© 2014 Е.Н. Розанова1, Е.В. Грехнева2, О.Н. Лопухина3,

Е.С. Соболева4, А.А. Еськова5

1 канд. хим. наук, доц. каф. химии

e-mail: rozanova. lena2012@yandex.ru

2 канд. хим. наук, доц. каф. химии

e-mail:grekhnyovaev@yandex. ru

3, 4 5 студенты по направлению «Химическая технология», каф. химии Курский государственный университет

Турбидиметрическим методом исследованы белоксодержащие композиции, в том числе комплексы белка с медью, полученные деструкцией пера составами на основе сульфита натрия в присутствии Cu2+ и некоторых ПАВ. Оптические характеристики изучали на спектрофотометре «UV-1800» фирмы SHIMADZU. Размер частиц в сухих образцах определяли на электронном микроскопе «Quanta 650 FEG».

Ключевые слова: турбидиметрический метод, белковые молекулы, комплексы белка с медью, сульфит натрия, ПАВ.

Перо в основном состоит из белка кератина, который представлен смесью регулярной и беспорядочной конформации белка: для внутренней части это 41 % а-спирали, 38 % Р-слоя, 21 % аморфной структуры; для внешней части соответственно 50 % а-спирали, 20 % Р-листа, 30 % - беспорядочные структуры [Patent US WO2005065301 A2. 2005].

В основе применяемого способа получения растворимой формы перьевого кератина лежит процесс, представленный в патенте [Patent US 7148327 B2. 2006]. В отличие от предлагаемых в этом патенте обработок, использовались приемы физических методов интенсификации химических процессов для сокращения длительности процесса и увеличения выхода растворимого белка.

Состав, применяемый для деструкции пера, включает сульфит натрия, медноаммиачный комплекс с добавлением серной кислоты, без ПАВ и в их присутствии. Использовались анионные и неионные ПАВ: из анионных - Glydol №1003, Сульфонол АВС, Texapon №70; из неионных - Plantacar, ОС-20 [Розанова, Кометиани, Еськова, Лопухина, Соболева 2014а].

Очищенное и измельченное кератинсодержащее сырье подвергалось обработке реагентами и физическим воздействиям (нагрев, механическое перемешивание, обработка ультразвуком) в разной последовательности. Под влиянием

деструктирующих факторов в условиях эксперимента кератин из нерастворимой формы переводили в растворимую форму с промежуточным образованием комплекса белка с медью.

В предыдущих исследованиях этих систем на электронном микроскопе были определены форма и размеры частиц комплексов белка с медью, высушенных при

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ

естественных условиях [Розанова, Кометиани, Еськова, , Лопухина, Соболева 20146]. Для белка определение размера частиц на электронном микроскопе весьма затруднительно, так как надо оттенять, замораживать образец, но и это не дает гарантированно точные результаты.

Как известно, под воздействием деструктирующих факторов в растворах белков происходят обратимые конформационные переходы:

а-спираль^-статистический клубок^Р-структура

i

глобула

Переходы спираль - клубок происходят в растворах при нагревании, при изменении рН и концентрации солей. Это влечет за собой изменение характеристической вязкости, оптической плотности, коэффициента седиментации и других гидродинамических и оптических свойств растворов белков [Геллер, Геллер, Чиртулов 1996].

Предположения о величине и форме белковых молекул ранее основывались в основном на результатах ультрацентрифугирования, диффузии и др. Для сухих образцов современные методы исследования (электронная микроскопия и рентгеноструктурный анализ высокого разрешения) позволяют точнее установить форму и пространственную конфигурацию белковых молекул. Для определения размеров частиц в растворах применяют оптические методы, основанные на рассеянии света (опалесценции). По чувствительности они практически такие же, как электронная микроскопия. Например, в клинической диагностике используют турбидиметрический метод для определения белка в моче.

Известно, что молекулы белков, находящиеся в растворах в виде клубка, стремятся к сферической форме, размер сферы связан с величиной молекулярной массы. Например, малые белки имеют характерный размер сферы - диаметр ~4 нм, молекулярная масса ~104 ^ 105, субъединицы - аминокислотные остатки, число субъединиц 102 ^ 103 (или 103 ^ 104). Большие белки могут иметь характерный размер сферы - диаметр ~7 нм, молекулярную массу ~105 ^ 107, субъединицы - ковалентные цепочки, число субъединиц ~10 ^ 102. Малые комплексы соответственно обладают характерным размером сферы - диаметр ~20 нм, молекулярной массой ~105 ^ 107, субъединицами - ковалентными цепочками, число субъединиц ~10 ^ 102. Большие комплексы имеют характерный размер сферы - диаметр —100 нм, молекулярную массу ~107 ^ 1012, субъединицы - области (фрагменты, компоненты), число субъединиц —10 ^ 102 [Кантор, Шиммел 1984].

Размер и форма макромолекулы влияет на ее движение в растворе, а в промышленных условиях при переработке растворов высокомолекулярных соединений размеры клубков макромолекул в растворах очень важны в плане гомогенизации, очистки, фильтрования биополимеров. Известно, что в растворах практически все молекулы белка после воздействия деструктирующих факторов приобретают форму статистического клубка.

По данным электронной микроскопии для кератинсодержащих композиций [Розанова, Кометиани, Еськова, Лопухина, Соболева 2014б], размер частиц больше, чем рекомендуемый при использовании закона Рэлея, частицы неоднородны по размеру. В связи с этим был выбран турбидиметрический метод для определения размеров частиц систем, не подчиняющихся закону Рэлея, расчеты проводили с использованием уравнения Геллера.

В исследовании использовался спектрофотометр «UV-1800» фирмы SHIMADZU, который позволяет измерять оптическую плотность растворов в широком диапазоне длин волн. Как известно, при определении концентрации белка в растворе по

Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 4

Розанова Е. Н., Грехнева Е. В,, Лопухина О. Н., Соболева Е. С., Еськова А. А, Использование турбидиметрического метода для определения размеров молекул

белка и комплексов меди

с кератином, полученных деструкцией пера составами на основе сульфита натрия

оптической плотности используют диапазон длин волн в коротковолновой части спектра (260 нм и 280 нм), в турбидиметрическом методе используют диапазон видимой части спектра (400-800 нм). Поэтому при использовании турбидиметрического метода для определения размеров частиц в содержащих кератин растворах был выбран интервал длин волн от 240 нм до 800 нм.

Объектами исследования являлись разбавленные растворы полученных комплексов белка с медью в присутствии ПАВ, комплексов, разрушенных избытком серной кислоты, а также растворы белка после промывки и центрифугирования. Отдельные результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Результаты расчета размеров частиц комплексов перьевого кератина с медью

по турбидиметрическому методу

Расчетные величины Комплексы перьевого кератина с медью

без ПАВ неионного ПАВ Plantacar неионного ПАВ ОС-20 анионного ПАВ Glydol №1003 анионного ПАВ Сульфонол АВС анионного ПАВ Texapon №70

n 2,49 2,45 2,56 3,51 2,67 2,63

z 7,19 7,30 6,81 2,80 6,43 6,6

d, нм 301,36 305,14 284,65 117,04 268,77 275,88

Таблица 2

Результаты расчета размеров частиц разрушенных комплексов перьевого кератина с медью и растворимого перьевого кератина по турбидиметрическому методу

Расчетные величины Разрушенные комплексы перьевого кератина с медью Перьевой кератин

без ПАВ неионного ПАВ Plantacar неионного ПАВ ОС-20 без ПАВ анионного ПАВ Glydol №1003 анионного ПАВ Сульфоно л АВС анионного ПАВ Texapon №70

n 1,62 2,48 2,49 3,14 2,70 3,57 2,5 2,63 3,48

z 10,75 7,20 7,19 4,59 6,30 2,80 7,1 6,60 3,30

d, нм 513,5 4 278,60 300,54 191,86 300,96 108,34 296,78 275,88 137,34

Если сопоставить эти величины с размерами частиц на электронных снимках, приведенных на рисунках 1-6, то можно говорить о том, что исходная структура пера разрушена, потому что исходное волокно пера имеет однородный макроскопический диаметр - приблизительно 5 мкм [Patent US WO2005065301 A2. 2005]. В растворе комплексов белка с медью диаметр статистического клубка в среднем на 30 % меньше размеров частиц в сухом виде (рис. 1-6), предположительно вследствие сшивки под действием кислорода воздуха.

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ

а) б)

Рис. 1. Размеры частиц растворимого (а) и разрушенного (б) комплекса перьевого кератина с медью в отсутствие ПАВ

а) б)

Рис. 2. Размеры частиц растворимого (а) и разрушенного (б) комплекса перьевого кератина с медью в присутствии неионного ПАВ Plantacar

а)

б)

Рис. 3. Размеры частиц растворимого (а) и разрушенного (б) комплекса перьевого кератина с медью в присутствии неионного ПАВ ОС-20

Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 4

Розанова Е. Н., Грехнева Е. В,, Лопухина О. Н., Соболева Е. С., Еськова А. А, Использование турбидиметрического метода для определения размеров молекул

белка и комплексов меди

с кератином, полученных деструкцией пера составами на основе сульфита натрия

а) б)

Рис. 4. Размеры частиц растворимого (а) и разрушенного (б) комплекса перьевого кератина с медью в пристутствии анионного ПАВ Glydol №1003

а) б)

Рис. 5. Размеры частиц растворимого (а) и разрушенного (б) комплекса перьевого кератина с медью в присутствии анионного ПАВ Сульфонол АВС

а)

б)

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ

Рис. 6. Размеры частиц растворимого (а) и разрушенного (б) присутствии анионного ПАВ Texapon №70

комплекса в

Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 4

Розанова Е. Н., Грехнева Е. В,, Лопухина О. Н., Соболева Е. С., Еськова А. А, Использование турбидиметрического метода для определения размеров молекул

белка и комплексов меди

с кератином, полученных деструкцией пера составами на основе сульфита натрия

Известно, что в макромолекулярном статистическом клубке собственно макромолекула занимает 1-3 % объема. Это можно использовать при оценке усредненной величины массы частиц (в Da) полученных белоксодержащих составов. По расчетным величинам диаметра статистического клубка, приведенным в таблицах 1 и 2, были определены массы частиц. В результате предварительной оценки можно предположить, что в изученных растворах комплексов кератина с медью и растворах кератина находятся частицы, у которых размеры и масса в несколько раз превышает установленные для больших комплексов (характеристический размер диаметр сферы ~100 нм, молекулярная масса ~107 ^ 1012) [Кантор, Шиммел 1984].

Библиографический список

Patent US WO200506530I A2. Polymer composites containing keratin. Barone Justin R., Shmidt Walter F. 21.07.2005/

Patent US 7148327 B2. Production of soluble keratin derivaties. Robert James Kelly, Gillian Helen Worth, Alisa Dawn Roddick-Lanzilotta. Keratec Limited. 12.12. 2006.

Розанова Е.Н., Кометиани И.Б. Еськова А.А. ,Лопухина О.Н., Соболева Е.С. Получение растворимой формы белка перьевого кератина с помощью сульфита натрия в присутствии Cu2+ и различных ПАВ // «21 век: фундаментальная наука и технологии»: материалы IV Междунар. науч.-практич. конф. М., 2014. С. 187-189.

Розанова Е.Н., Кометиани И.Б. Еськова А.А. Лопухина О.Н., Соболева Е.С. Влияние ПАВ на морфологию комплексов меди и кератина, полученных деструкцией пера составами на основе сульфита натрия // Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 3. URL:

auditorium.kursksu.ru/pdf/003-004.pdf (дата обращения: 21.11.2014).

Геллер Б.Э., Геллер А.А., Чиртулов В.Г. Практическое руководство по физикохимии волокнообразующих полимеров. М.: Химия, 1996. 432 с.

Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: пер. с англ. М.: Мир, 1984, Т. 1-3.