CC BY
25
УДК 612. 616-831
ВЛИЯНИЕ СОЧЕТАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ГИПОТЕРМИИ, ЦЕРЕБРАМИНА И ОККЛЮЗИИ СОННЫХ АРТЕРИЙ НА БАЛАНС АМИНОКИСЛОТНЫХ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ В МОЗГЕ КРЫС
© 2009 г. Э.З. Эмирбеков, Ф. Т. Айдунбеков
Дагестанский государственный университет Dagestan State University,
ул. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, 367025, Gadjiev St., 43a, Makhachkala, 367025,
[email protected] [email protected]
На модели 3-минутной окклюзии правой и 24-часовой левой сонных артерий показаны эффекты гипотермии и введения церебрамина. Установлено, что в условиях окклюзии сонных артерий (ОСА) накапливается содержание возбуждающих аминокислотных нейротранс-миттеров и истощается содержание тормозных. Более выраженные изменения нейромедиаторного баланса обнаружены в коре больших полушарий животных. Гипотермия способствует накоплению возбуждающих и тормозных аминокислотных нейротрансмиттеров в коре больших полушарий. Гипотермическое воздействие и введение церебрамина снижают влияние ОСА на содержание медиаторов.
Ключевые слова: гипотермия, мозг, окклюзия, аминокислоты.
Using the model of 3 minute occlusion of the right carotid and of 24 hour occlusion of the left carotid the effects of hypothermia and cerebramine were studies. At the carotid occlusion it was glutamate and aspartate rate increased and GABA and glycine rate decreased. The most changes of neuromediator balance was at animal brain hemisphere. At hypothermia it was increased of rate all investigated amino acid neutotransmitters at animal brain hemisphere. The hypothermia and treatment of cerebramine decrease influence of the carotid occlusion at neuromediator balance.
Keywords: hypothermia, brain, acclusia, aminoacids.
Ишемия/реперфузия мозга способствует быстрой аккумуляции повреждений структуры ДНК в результате окислительного стресса, что в дальнейшем приводит к запуску процесса гибели клетки [1]. При этом реакции, сопутствующие ишемическим/реперфузион-ным повреждениям мозга, сопровождаются гипертермией, обостряющей степень нейрональных повреждений [2]. Умеренная гипотермия на фоне или сразу после церебральной ишемии оказывает нейропротек-тивное действие за счет снижения окислительных повреждений ДНК и структурных элементов мембраны клетки [3], повышения выживаемости нейронов в результате понижения активности проапоптотических и некротических факторов [4]. Гипотермическое воздействие оказывает выраженное влияние и на нейро-медиаторные системы мозга.
На фоне нарушения мозгового кровообращения применение сочетанного действия умеренной гипотермии и препаратов ноотропного действия недостаточно
изучено, в том числе церебрамина, представляющего собой биохимически активную добавку, содержащую пептиды и микроэлементы, применяемую в клинике при недостаточности мозгового кровообращения.
Цель данного исследования - изучение влияния умеренной гипотермии и церебрамина на содержание возбуждающих и тормозных аминокислот в структурах мозга крыс, подвергнутых двусторонней окклюзии сонных артерий (ОСА) разной продолжительности.
Материалы и методы
Исследование проведено на 66 белых беспородных половозрелых крысах-самцах в возрасте 6 мес., массой 200-250 г. Животных содержали в условиях вивария при температуре +18 +20 С на стандартном рационе питания. Опыты проводили в зимние месяцы (декабрь - февраль). Животные были разделены на 8 групп:
1-я - ложнооперированные крысы (л/о), их обездвиживали введением 1,2 мл 1%-го раствора тиопен-тала на 100 г массы животного (п=8) (контроль), все хирургические процедуры проводили стерильно;
2-я - крысы, которым проводили перевязку правой сонной артерии (ПСА) на 3 мин (с последующей 24-часовой реоксигенацией) и левой сонной артерии (ЛСА) на 24 ч (п=10);
3-я - крысам перорально вводили церебрамин в течение 5 сут в (кормление 1 раз в день в утренние часы) в дозе 0,5 мг/кг с последующим проведением ложной операции (п=8);
4-я - перед перевязкой ПСА на 3 мин и ЛСА на 24 ч перорально вводили церебрамин в течение 5 сут (п=8);
5-я - после проведения ложной операции помещали в холодовую камеру с охлаждаемой водяной рубашкой, конструкция которой позволяла регулировать уровень охлаждения и непрерывно фиксировать термодатчиком ректальную температуру тела с точностью до 0,1 °С (п=8). Температура воды в водяной рубашке составляла 8 °С;
6-я - после проведения операции по перевязке сонных артерий (3 мин ПСА+24 ч ЛСА) крыс помещали в холодовую камеру (п=8);
7-я - крысам перорально вводили церебрамин в течение 5 сут. После проведения ложной операции их помещали в холодовую камеру (п=8);
8-я - перед перевязкой сонных артерий крысам перорально вводили церебрамин в течение 5 сут. После проведения операции их помещали в холодовую камеру (п=8).
Гипотермию моделировали путем помещения животных в холодовую камеру до снижения ректальной температуры до 30 С (умеренная гипотермия). После гипотермии животных помещали в клетки, где они находились при комнатной температуре (20 С).
Через 24 ч после операций животных декапитирова-ли. Мозг извлекали на холоде и выделяли кору и стволовые структуры (гипокамп, гипоталамус, таламус).
В структурах мозга животных определяли содержание аминокислот: глицина, аспарагиновой, глута-миновой и у-аминомаслянной кислот (ГАМК) методом низковольтного электрофореза на бумаге [5]. Для этого 10 % гомогенат структур мозга, приготовленный на 0,4 N HCЮ4, центрифугировали 10-15 мин при 3-6 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость переносили в тигли и выпаривали досуха на кипящей водяной бане. Осадок промывали 2 раза в 2 мл дистиллированной воды. Сухой отмытый осадок растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды и по 0,02 мл наносили на фореграмму. Электрофорез проводили в 0,2 N №-ацетатном буфере рН=4,6 при напряжении в 300 В и силе тока 12 мA в течение 2 ч. После окончания форе-за фореграмму высушивали на воздухе. Высохшие окрашивали 1%-м раствором нингидрина в ацетоне и помещали в сушильный шкаф, прогретый до 80 °С для развития окраски. Для количественного определения аминокислот пятна на фореграмме, соответствующие аминокислотам, вырезали, измельчали и заливали 4 мл 50%-м этилового спирта. Колориметри-ровали при длине волны 557 нм против спирта. В качестве стандарта использовали синтетические амино-
кислоты фирмы «Serva». Количество аминокислот выражали в мкмоль на 1 г сырой ткани.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 5.5. Данные представлены в виде M±S.E.M. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стью-дента. Для проверки нормальности распределения данных использовали коэффициент Колмогорова-Смирнова.
Результаты и обсуждение
К аминокислотам, выполняющим в мозге млекопитающих нейротрансмитерную функцию, относят ГАМК, глутаминовую и аспарагиновую кислоты, глицин, таурин и пролин [6]. При этом аминокисло-тергические синапсы составляют основной фонд (до 80 %) синаптических контактов мозга. При этом большинство тормозных и возбуждающих процессов в мозге происходят при участии ГАМК, а также глу-тамата и аспартата. За исключением глутамата и ас-партата остальные аминокислоты (ГАМК, глицин, таурин, пролин) проявляют функции тормозных ней-ромедиаторов. Известно, что около 30-40 % синаптических контактов ЦНС имеют ГАМК-ергическую природу, тогда как глутамат- и аспартатергические синапсы составляют 20-25 % от общего числа синаптических контактов ЦНС [7, 8].
В результате проведенного исследования показано, что при окклюзии сонных артерий (ОСА) (2-я группа) происходило достоверное повышение концентрации возбуждающих нейромедиаторных аминокислот: аспарагиновой и глутаминовой как в коре больших полушарий (на 85 и 36 % соответственно), так и в стволовых структурах мозга (ССМ) крыс (на 32 и 23 %) по сравнению с контрольными значениями. Одновременно отмечалось выраженное снижение содержания тормозных нейротрансмиттеров - ГАМК на 32 % (р<0,05) в коре больших полушарий и на 63 % (р<0,05) в ССМ, а также уровня глицина в ССМ на 45 % (р<0,05) относительно 1-й группы крыс (таблица).
Это соответствует данным литературы, согласно которым в условиях ишемии/реперфузии в мозге запускается каскад реакций, сопровождаемых накоплением возбуждающих аминокислот и истощением тормозных стресс-лимитирующих нейромедиаторов
[9, 10].
Добавление в рацион питания церебрамина (3-я группа) приводило к накоплению ГАМК в ССМ (+28 %; р<0,05) и особенно в коре больших полушарий мозга животных (+41 %; р<0,05). При этом наблюдалось увеличение концентрации аспартата в коре больших полушарий на 65 % (р<0,05) и в ССМ на 25 (р<0,05) по сравнению с контролем. Подобные изменения в балансе тормозных и возбуждающих аминокислот характерны для препаратов ноотропного ряда [11].
Предварительное пероральное введение церебра-мина (4-я группа) перед ОСА способствовало снижению ишемического/реперфузионного влияния на баланс аминокислотных нейромедиаторов животных: все показатели соответствовали контрольному уровню. Относительно 2-й группы в коре больших полу-
шарий наблюдалось существенное снижение уровней аспартата (на 44 %; р<0,05) и глутамата (на 26 %;
р<0,05), а также значительное повышение содержания ГАМК в коре больших полушарий (72 %; р<0,05) и в ССМ (200 %; р<0,01).
Содержание нейромедиаторных аминокислот в структурах мозга крыс, мкмоль/г сырого веса ткани; М±8.Е.М.
Структура мозга Группа Аспартат Глутамат ГАМК Глицин
Кора больших полушарий Контроль 2,38±0,09 7,94±0,21 2,11±0,06 0,43±0,06
ОСА 4,40±0,10* 10,83±0,16* 1,43±0,08* 0,41±0,04
Церебрамин л/о 3,93±0,12* 7,53±0,19 2,98±0,09* 0,64±0,06*
Церебрамин+ОСА 2,47±0,11# 8,04±0,17# 2,46±0,11# 0,49±0,04
Гипотермия л/о 3,79±0,07* 10,15±0,19* 4,90±0,11* 0,94±0,05*
ОСА+гипотермия 3,36±0,06*# 8,58±0,22# 3,86±0,06*# 0,86±0,08*#
Церебрамин+гипотермия 3,70±0,12* 8,04±0,14 2,87±0,09*$ 0,48±0,05$
Церебрамин+ОСА+гипотермия 2,45±0,10#$ 8,23±0,18# 2,32±0,05#$ 0,70±0,04*#$
ССМ Контроль 2,13±0,14 6,85±0,21 2,89±0,17 0,58±0,09
ОСА 2,80±0,11* 8,44±0,31 1,06±0,09* 0,32±0,06*
Церебрамин л/о 2,67±0,13* 6,95±0,19 3,70±0,12* 0,54±0,07
Церебрамин+ОСА 2,24±0,06 7,01±0,22 3,18±0,14# 0,59±0,08#
Гипотермия л/о 1,45±0,10* 9,16±0,17* 3,08±0,14 0,63±0,12
ОСА+гипотермия 2,65±0,11*$ 7,92±0,25 4,51±0,24*#$ 0,85±0,10*#$
Церебрамин +гипотермия 1,98±0,11 7,10±0,18$ 3,11±0,07 0,61±0,07
Церебрамин+ОСА+гипотермия 2,30±0,10$ 7,42±0,15 3,17±0,21# 0,60±0,09#
Примечание. Достоверные различия по сравнению: *- с контрольной группой (р<0,05); # - животными 2-й группы (р<0,05); $ - животными 5-й группы (р<0,05).
Такой эффект на медиаторный баланс церебрами-на на фоне ОСА можно объяснить тем, что данный ноотроп значительно снижает проявления окислительного стресса при нарушении мозгового кровообращения, что было ранее продемонстрировано результатами, полученными в нашей лаборатории [12].
Умеренная гипотермия (5-я группа) способствовала значительному повышению концентрации всех исследованных аминокислот в коре головного мозга животных. Это соответствует повышенному фону возбуждения в коре и отражает как активные информационные процессы в ЦНС, так и усиление общего метаболизма и транспорта в нервных клетках.
Однако сочетанное действие ОСА и гипотермии (6-я группа) несколько снижало уровень исследованных нейротрансмиттеров в коре больших полушарий мозга, хотя оставалось высоким содержание ГАМК (+46 %; р<0,05) и особенно аспартата (+83 %; р<0,05) в ССМ относительно показателей 5-й группы.
Пероральное введение церебрамина перед гипотермией (7-я группа) изменяло преимущественно состояние нейромедиаторного пула изученных аминокислот в коре головного мозга животных. Так, уровень аспарагиновой кислоты увеличивался на 56 % (р<0,05), а содержание ГАМК - на 36 % (р<0,05) относительно показателей контрольной группы. При этом в ССМ наблюдалось повышение уровня аспартата (37 %; р<0,05) и снижение содержания глутамино-вой кислоты (23 %; р<0,05) относительно уровня 5-й группы.
Введение церебрамина перед сочетанным действием ОСА и гипотермии способствовало снижению уровня возбуждающих аминокислот в исследованных структурах мозга и значительно повышало концентрацию ГАМК: в коре больших полушарий на 326 %
(р<0,01), а в ССМ - на 199 % (р<0,01) относительно 5-й группы животных. При сравнении с контрольной группой крыс состояние нейромедиаторного баланса аминокислотных трансмиттеров 8-й группы животных не различалось.
Таким образом, результаты проведенного исследования убедительно доказали необходимость сочетан-ного применения гипотермии и препарата, обладающего ноотропным действием, при нарушении мозгового кровообращения.
Выводы
1. В условиях ОСА происходит нарушение нейромедиаторного баланса в структурах мозга: накапливается содержание возбуждающих аминокислотных нейротрансмиттеров и истощается содержание тормозных. Более выраженные изменения нейромедиа-торного пула обнаружены в коре больших полушарий животных.
2. Гипотермия способствует накоплению возбуждающих и тормозных аминокислотных нейротранс-миттеров в коре больших полушарий.
3. Как гипотермическое воздействие, так и введение церебрамина оказывают корректирующее влияние на нейромедиаторный пул в условиях ОСА, но наиболее благоприятный эффект на состояние баланса аминокислотных медиаторов отмечается при их сочетанном действии.
Литература
1. Impaired DNA Repair Via the Base-excision Repair Pathway After Focal Ischemic Brain Injury: a Protein Phospho-rylation-dependent Mechanism Reversed by hypothermic
Neuroprotection / Y. Luo [et al.] // Front Biosci. 2007. Vol. 12. P. 1852-1862.
2. Noor R., Wang C.X., Shuaib A. Hyperthermia Masks the
Neuroprotective Effects of Tissue Plasminogen Activator // Stroke. 2005. Vol. 36. P. 665-669.
3. Mild Hypothermia Diminishes Oxidative DNA Damage and
Pro-death Signaling Events After Cerebral Ischemia: a Mechanism for Neuroprotection / X. Ji [et al.] // Front Biosci. 2007. Vol. 12. P. 1737-1747.
4. Post-ischemic Mild Hypothermia Inhibits Apoptosis in the
Penumbral Region by reducing neuronal Nitric Oxide Syn-thase Activity and Thereby Preventing Endothelin-1-induced Hydroxyl Radical Formation / A. Van Hemelrijck [et al.] // Eur. J. Neurosci. 2005. Vol. 22, № 6. P. 13271337.
5. Камышников В.С. Справочник по клинико-
биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М., 2004. 920 с.
6. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д. Биохимия
мозга. СПб., 1999. 328 с.
7. Нейрохимия / И.П. Ашмарин [и др.]. 1996. 470 с.
Поступила в редакцию
8. Дамбинова С.А. Нейрохимические корреляты функцио-
нальных состояний мозга человека // Успехи функциональной нейрохимии. СПб., 2003. С. 20-32.
9. Striatal Outflow of Adenosine, excitatory Amimo Acid,
Gamma-aminobutyric Acid, and Taurine in Awake Freely Moving Rats After Middle Cerebral Artery Occlusion: Correlations with Neurological Deficit and Histopathological Damage / A. Melani [et al.] // Stroke. 1999. Vol. 30. P. 2448-2454.
10. Hui S., Guann-Juh C., Harvey B.K. Inosine Reduces
Ischemic Brain Injury in Rats // Stroke. 2005. Vol. 36. P. 654-659.
11. Соотношение нейромедиаторных аминокислот при
сравнительном анализе стресспротекторных эффектов дельта сон-индуцирующего пептида и пирацетама. / А.М. Менджерицкий [и др.] // Вопросы мед. химии. 1995. № 5. С.16-19.
12. Влияние церебрамина на свободнорадикальные процес-
сы и энергетический обмен в модели двусторонней окклюзии сонных артерий у крыс. / Э.З. Эмирбеков [и др.] // Изв. вузов Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2006. Приложение. № 12. Ростов н/Д, С. 70-73.
3 апреля 2008 г.
