CC BY
22
УДК 612.616-831
ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ И ЦЕРЕБРАМИНА НА СОДЕРЖАНИЕ МОНОАМИНОВ В МОЗГЕ И КРОВИ КРЫС ПРИ ОККЛЮЗИИ СОННЫХ АРТЕРИЙ
© 2009 г. Э.З. Эмирбеков, Ф. Т. Айдунбеков
Дагестанский государственный университет, Dagestan State University,
ул. Гаджиева, 37, г. Махачкала, Р. Дагестан, 367025, GadjievSt., 37, Makhachkala, Dagestan, 367025,
dgu@dgu.ru dgu@dgu.ru
На модели 3-минутной окклюзии правой сонной артерии и 24-часовой левой показаны эффекты гипотермии и введения цереб-рамина. Установлено, что в условиях гипотермии происходит накопление норадреналина и снижение содержания дофамина в мозге. Введение церебрамина способствует сходным с гипотермическим воздействием изменениям содержания норадреналина, серотонина в коре больших полушарий. В условиях предварительного введения церебрамина перед окклюзией сонных артерий и последующего воздействия гипотермии происходят минимальные сдвиги в балансе нейромедиаторов.
Ключевые слова: гипотермия, мозг, окклюзия, церебрамин.
Using the model of 3-minute occlusion of the right carotid and of 24-hour occlusion of the left carotid the effects of hypothermia and ce-rebramine were studies. At hypothermia it was increase of norepinephrine rate and decrease of dopamine rate in the brain. At treatment of e it was analogy changes at rate the norepinephrine and serotonin at hemisphere of brain. At treatment of cerebramine before carotid occlusion and hypothermia it was minimal changes at neuromediator balance.
Keywords: hypothermia, brain, occlusion, cerebramin.
Исследуется вопрос изменения температуры мозга в зависимости от интенсивности мозгового кровообращения, решение которого может привести к выявлению критерия устойчивости организма к нарушению мозгового кровообращения [1 - 5].
В экспериментальных и клинических испытаниях важна разработка комбинированной патофизиологически значимой терапии с количественной оценкой обратимости повреждений вещества мозга, обусловленных инсультом [6]. Поэтому применение сочетан-ного действия умеренной гипотермии и препаратов ноотропного действия на фоне нарушения мозгового кровообращения является актуальным для решения вопроса эффективности снижения последствий ише-мического / реперфузионного повреждения мозга.
В связи с этим цель данного исследования - изучение влияния умеренной гипотермии и церебрамина на содержание медиаторов в структурах мозга и крови крыс, подвергнутых двусторонней окклюзии сонных артерий (ОСА) разной продолжительности.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на 64 белых беспородных половозрелых крысах в возрасте 6 месяцев, массой 200-250 г, содержащихся в стандартных условиях вивария.
Проведены следующие серии экспериментов:
1-я группа - ложнооперированные крысы, которых обездвиживали введением 1,2 мл 1%-го раствора тио-пентала на 100 г массы животного (n=8) (контроль), все хирургические процедуры проводили стерильно.
2-я группа - животные, которым проводили перевязку правой сонной артерии (ПСА) на 3 мин (с последующей 24-часовой реоксигенацией) и левой сонной артерии (ЛСА) на 24 ч (n=8).
3-я группа - животные, которым перорально вводили церебрамин в течение 5 сут в (кормление 1 раз в сут в утренние часы) в дозе 0,5 мг/кг с последующим проведением ложной операции (п = 8).
4-я группа - животные, которым перед перевязкой ПСА на 3 мин и ЛСА на 24 ч перорально вводили церебрамин в течение 5 сут (п = 8).
5-я группа - животные, которых после проведения ложной операции помещали в холодовую камеру с охлаждаемой водяной рубашкой, конструкция которой позволяла регулировать уровень охлаждения и фиксировать термодатчиком ректальную температуру тела с точностью до 0,1 °С (п = 8). Температура воды в водяной рубашке составляла 8 °С.
6-я группа - животные, которых после проведения операции по перевязке сонных артерий (3 мин ПСА+24 ч ЛСА) помещали в холодовую камеру (п = 8).
7-я группа - животные, которым перорально вводили церебрамин в течение 5 сут. После проведения ложной операции крыс помещали в холодовую камеру (п = 8).
8-я группа - животные, которым перед перевязкой сонных артерий перорально вводили церебрамин в течение 5 сут. После проведения операции крыс помещали в холодовую камеру (п = 8). Животных 5-8 групп после проведения операций выдерживали в холодовой камере, пока ректальная температура крысы опускалась до 30 °С (умеренная гипотермия). После гипотермии животных помещали в клетки, где они находились в условиях комнатной температуры (20 °С).
Через 24 ч после операций животных декапитиро-вали. Кровь собирали в центрифужные пробирки с 3,2%-м оксалатом натрия в соотношении 1:9, мозг извлекали на холоде, выделяли кору и стволовые структуры.
Во всех сериях эксперимента в крови и тканях мозга определяли содержание биогенных аминов - норад-реналина, дофамина (ДА) и серотонина с применением обращенно-фазного варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на установке «Li-quochrom» (Венгрия) с колонкой фирмы «Serva» (l=20 см, d=5 мм). Использовали систему из двух элюентных растворов: элюент А - 0,02М К2НРО4 (рН=3,3), элюент В - метанол-вода (6:4). Элюенты освобождали от газов вакуумированием и фильтрацией через мембранные фильтры Миллипор (размер пор 0,05 мкм). Разделение вели в линейном градиенте от 0 до 100 % элюента В за 35 мин. Объем смесительной камеры - 5 мл, скорость протока - 1,5 мл/мин, максимальное давление -1,52^ 107 Па. В качестве детектора использовали флюоресцентный спектрофотометр «Hitachi F-4010» (Япония) со встроенным процессором, с помощью которого производили расчет концентраций моноаминов в образцах, используя стандартные растворы норадренали-на гидрохлорида, серотонина креатининсульфата и ДА гидрохлорида фирмы «Serva» с 3,4-дигидро-бензил-аминов гидрохлоридом в качестве внутреннего стандарта. Количество моноаминов выражали в мкг на 1 г сырой ткани или мкг на 1 мл крови [7].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 5.5. Данные представлены в виде M±S.E.M. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента. Для проверки нормальности распределения данных использовали коэффициент Колмогорова-Смирнова.
При двустороннем нарушении мозгового кровообращения на фоне введения церебрамина (4-я группа) показано более выраженное изменение баланса моноаминов в структурах мозга. В корковых и стволовых структурах наблюдалось повышение уровня норадре-налина на 76 (р<0,01) и 39 % (р<0,05), снижение содержания серотонина на 58 (р<0,05) и 51 % (р<0,05) на фоне однонаправленного изменения уровня 5-ОТ в крови животных (45 %, р<0,05). Концентрация ДА значимо изменялась лишь в коре больших полушарий (34 %, р<0,05).
Действие умеренной гипотермии (5-я группа) вызывало снижение содержания ДА в крови на 41 % (р<0,05), в коре больших полушарий - на 74 (р<0,05) и ССМ - на 37 % (р<0,05). Повышение уровня норад-реналина наблюдалось в коре больших полушарий на 99 % (р<0,01), в ССМ - на 173 (р<0,05). При этом наиболее значимые изменения в концентрации серо-тонина наблюдались лишь в коре больших полушарий (43 %, р<0,05).
Действие гипотермии на фоне ОСА (6-я группа) приводило к снижению уровня норадреналина в крови на 38 % (р<0,05) при выраженном повышении уровня амина в коре больших полушарий на 422 % (р<0,001), в ССМ - на 75 % (р<0,05). Изменение концентрации ДА носило обратный характер: происхо-
Таблица 1
Содержание моноаминов в крови, мкг/л крови, коре больших полушарий и ССМ, мкг/г сырого веса ткани, крыс при ОСА и умеренной гипотермии (М±т, п=8)
Результаты исследования
При двустороннем нарушении мозгового кровообращения (2-я группа) наблюдалось выраженное снижение содержания ДА в крови (61 %, р<0,01) и в структурах мозга: в коре больших полушарий - на 62 % (р<0,01) в стволовых структурах - на 70 (р<0,01). Однако при снижении концентрации ДА - предшественника норадреналина в коре и стволовых структурах мозга (ССМ), происходил рост уровня норадреналина на 62 % (р<0,01) и 79 (р<0,01) соответственно, при этом в крови содержание норадерналина снижалось на 39 % (р<0,05). Концентрация серотонина в крови увеличивалась на 103 % (р<0,01), в ССМ снижалась на 26 (р<0,05) без значительных изменений в коре головного мозга крыс (табл. 1).
При добавлении в рацион питания церебра-мина (3 -я группа) происходило выраженное увеличение концентрации норадреналина во всех исследованных тканях животных: в крови - на 98 % (р<0,01), в коре больших полушарий - на 405 (р<0,001), в ССМ - на 141 % (р<0,01). Кроме того, в стволовых структурах мозга наблюдалось повышение уровня ДА на 93 % (р<0,01) - в коре больших полушарий, на 102 (р<0,01) - в ССМ. Содержание серотонина (5-ОТ) несколько снижалось в тканях мозга животных: в коре - на 34 % (р<0,05), в ССМ - на 39 (р<0,05) (табл. 2).
Серия 1 Норадреналин | Дофамин | Серотонин
Кровь
Контроль, л/о (1-я группа) 0,181±0,012 0,297±0,019 1,905±0,106
ОСА (2-я группа) 0,110±0,008* 0,115±0,010** 3,861±0,203**
Гипотермия, л/о (5-я группа) 0,157±0,011 0,175±0,010* 1,708±0,078
ОСА + +гипотермия (6-я группа) 0,112±0,09* 1,015±0,051*** 1,837±0,088
Кора больших полушарий
Контроль, л/о (1-я группа) 0,217±0,015 1,255±0,074 0,604±0,034
ОСА (2-я группа) 0,352±0,022** 0,478±0,027** 0,583±0,029
Гипотермия, л/о (5-я группа) 0,432±0,024** 0,325±0,017** 0,346±0,019*
ОСА + +гипотермия (6-я группа) 1,132±0,083*** 2,269±0,142* 0,333±0,021*
Стволовые структуры
Контроль, л/о (1-я группа) 0,385±0,021 1,279±0,080 0,871±0,058
ОСА (2-я группа) 0,690±0,058** 0,384±0,027** 0,640±0,038*
Гипотермия, л/о (5-я группа) 1,049±0,050** 0,804±0,050* 0,986±0,058
ОСА + +гипотермия (6-я группа) 0,672±0,037* 0,318±0,015* 0,526±0,035*
Примечание. Достоверные различия по сравнению с контрольной группой: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
Таблица 2
Содержание моноаминов в крови, мкг/л, и структурах мозга, мкг/г сырого веса ткани, крыс при ОСА и гипотермии в условиях предварительного введения церебрамина (М±т; п=8)
Серия | Норадреналин | Дофамин | Серотонин
Кровь
Контроль, л/о 0,181±0,012 0,297±0,019 1,905±0,106
Церебрамин (3-я гр.) 0,358±0,020** 0,353±0,018 2,123±0,101
Церебрамин+ +ОСА (4-я группа) 0,146±0,010 # 0,301±0,015 # 1,048±0,050*#
Церебрамин + +гипотермия (7-я группа) 0,248±0,021*$ 0,273±0,017$ 1,911±0,097
Церебрамин+ ОСА + +гипотермия (8-я гр.) 0,418±0,017**# $ 0,240±0,013 $ 2,124±0,112 #
Кора больших полушарий
Контроль, л/о 0,217±0,015 1,255±0,074 0,604±0,034
Церебрамин (3-я группа) 1,095±0,068*** 2,426±0,152** 0,397±0,027*
Церебрамин+ОСА (4-я гр.) 0,381±0,027** 0,837±0,049 # 0,257±0,016* #
Церебрамин+ +гипотермия (7-я гр.) 0,322±0,027* 1,187±0,117 # 0,795±0,0418 #
Церебрамин+ОСА+ +гипотермия (8-я гр.) 0,352±0,021 * 0,821±0,048*# $ 0,389±0,028*#
Стволовые структуры
Контроль, л/о 0,385±0,021 1,279±0,080 0,871±0,058
Церебрамин (3-я гр.) 0,929±0,062** 2,587±0,199** 0,528±0,033*
Церебрамин+ОСА (4-я группа) 0,536±0,034* 1,215±0,068 # 0,429±0,023* #
Церебрамин + Гипотермия (7-я гр.) 0,427±0,033 $ 1,496±0,026 $ 0,787±0,043
Церебрамин+ОСА+ +гипотермия (8-я гр.) 0,322±0,019 # $ 2,892±0,138** # $ 0,665±0,042 $
Примечание. Достоверные различия по сравнению с контрольной группой: * - р<0,05; ** - р<0,01;*** - р<0,001; # - достоверные различия по сравнению с показателями 2-й группы р<0,05; $ - достоверные различия по сравнению с показателями 5-й группы р<0,05
дило повышение уровня амина в крови на 242 % (р<0,001) и снижение на 75 (р<0,05) в стволовых структурах, хотя в коре больших полушарий отмечено повышение концентрации ДА на 81 % (р<0,05) относительно уровня в контрольной группе. Наблюдалось снижение содержания серотонина во всех тканях животного, при этом более значимое изменение установлено в структурах мозга: на 45 % (р<0,05) - в коре больших полушарий, на 40 % (р<0,05) - в ССМ.
В коре больших полушарий крыс 7-й группы наблюдалось некоторое увеличение уровня норадрена-лина (48 %, р<0,05) и снижение содержания серото-нина (32 %, р<0,05) по сравнению с контрольными значениями. Однако по отношению к показателям 5-й группы происходило увеличение содержания ДА (265 %, р<0,05) и серотонина (130 %, р<0,01). В ССМ достоверных изменений относительно контрольной группы в содержании исследованных моноаминов отмечено не было. Однако по сравнению с 5-й группой уровень норадреналина был ниже на 59 %
(р<0,05), а содержание ДА, напротив, выше на 86 % (р<0,05).
Пероральное введение церебра-мина в рацион питания животных способствовало повышению концентрации норадреналина (131 %, р<0,01) в крови крыс 8-й группы. Относительно же показателей 2-й и 5-й групп уровень норадреналина 8-й группы животных был выше, соответственно, на 280 (р<0,01) и 166 % (р<0,01).
При этом изменений в содержании ДА и серотонина в крови крыс 8-й группы относительно контрольной группы не отмечалось.
В коре больших полушарий содержание норадреналина было повышенным (62 %, р<0,05) по сравнению с группой контроля и достоверно не различалось с содержанием норадреналина 2-й группы крыс. Концентрация ДА снижалась относительно контроля на 35 % (р<0,05), но по сравнению с показателями 2-й и 5-й групп животных содержание ДА было выше, соответственно, на 72 (р<0,05) и 153 % (р<0,01).
В ССМ животных 8-й группы наблюдалось повышение уровня ДА на 126 % (р<0,01), тогда как содержание норадреналина и се-ротонина не изменялось относительно контрольных значений. По сравнению со 2-й и 5-й группами в ССМ крыс 8-й группы происходило снижение уровня норадренали-на, соответственно, на 53 (р<0,05) и 69 % (р<0,05), а также значительное повышение уровня ДА, соответственно, на 653 (р<0,001) и 260 % (р<0,01).
Таким образом, нарушение медиаторного баланса в условиях ОСА частично корректируется воздействием гипотермии и церебрамина через медиаторные системы мозга. -
При этом умеренная гипотермия представляет собой генерализованную реакцию организма, сопровождающуюся, согласно данным [5], изменением в основных сигнальных процессах, включающихся в развитие ишемического повреждения мозга: энергетических, высвобождении глутамата, мобилизации ионов кальция, интенсификации свободнорадикальных и воспалительных процессов, проницаемости гемато-энцефалического барьера. Гипотермическое воздействие снижает проявление аноксической деполяризации и уровень апоптотических и некротических процессов.
Тем не менее сочетанное влияние этих двух корректирующих факторов при нарушении мозгового кровообращения животных, на наш взгляд, не являет-
ся оптимальным, поскольку в данной постановке эксперимента в мозге экспериментальных крыс происходит снижение содержания серотонина. Изменение уровня остальных нейромедиаторов не обнаружено.
Это согласуется с данными литературы, согласно которым сочетанное влияние гипотермии и фармакологических агентов не дает ожидаемого положительного эффекта на выживаемость нейронов после ише-мических/реперфузионных повреждений мозга.
Выводы
1. В условиях умеренной гипотермии происходит накопление норадреналина и снижение содержания ДА в структурах мозга. Введение церебрамина способствует сходным с гипотермическим воздействием изменениям содержания норадреналина, серотонина в коре больших полушарий.
2. В условиях предварительного введения церебрамина перед ОСА и последующего воздействия гипотермии происходят минимальные сдвиги в балансе нейромедиаторов.
Литература
1. Lyeth B.G., Jiang J.Y., Liu S. Behavioral protection by moderate hypothermia initiated after experimental traumatic brain injury // J. Neurotrauma. 1993. Vol. 10, № 1. Р. 57-64.
2. No long-term benefit from hypothermia after severe traumatic brain injury with secondary insult in rats / C.L. Robertson [et al.] // Crit. Care. Med. 2000. Vol. 28, № 9. Р. 3218-3223.
3. Acute systemic administration of interleukin-10 suppresses the beneficial effects of moderate hypothermia following traumatic brain injury in rats / A.E. Kline [et al.] // Brain Res. 2002. Vol. 937, № 1, 2. Р. 22-31.
4. Transforming growth factor beta 1 increases bad phosphorylation and protects neurons against damage / Y. Zhu [et al.] // Neurosci. 2002. Vol. 22, № 10. P. 3898-3909.
5. How the body controls brain temperature: the temperature shielding effect of cerebral blood flow / Y. Zhu [et al.] // J. Appl. Physiol. 2006. Vol. 101, № 5. Р. 1481-1488.
6. Фишер М., Шебитз В. Обзор подходов к терапии острого инсульта: прошлое, настоящее, будущее // Журн. неврологии и психиатрии (Инсульт). 2000. № 1. С. 21-33.
7. Krstulovic A.M., Povwell A.M. Use of native fluorescence measurements and stopped-flow scanning technique in the high-performance liquid chromatographic analysis of catecho-lamines and related compounds // J. of Chromatography. 1979. Vol. 171. P. 345.
Поступила в редакцию_3 апреля 2008 г.
