CC BY
101PPBN ID ppbn.v8i4.981
БИОХИМИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
2448 -
ВЛИЯНИЕ ЛЕВЕТИРАЦЕТАМА НА СОДЕРЖАНИЕ МЕДИАТОРНЫХ АМИНОКИСЛОТ В СТРУКТУРАХ МОЗГА КРЫС ПРИ АУДИОГЕННОМ ЭПИЛЕПТИФОРМНОМ ПРИПАДКЕ
ЛЮДМИЛА Алексеевна МАЛИКОВА (для корреспонденции)
НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, лаборатория психофармакологии, ст. научн. сотр., канд. биол. наук; Балтийская ул., 8, Москва, 125315, Россия, (495) 601-21-53, e-mail: ludmal2006@yandex.ru
ИРИНА Борисовна ФЕДОТОВА
МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, ст. научн. сотр., канд. биол. наук; Воробьевы горы, Москва, 119899, Россия, (495) 939-44-68
ПЕТР Михайлович КЛОДТ
ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, лаборатория психофармакологии, вед. научн. сотр., канд. биол. наук; Балтийская ул., 8, Москва, 125315, Россия, (495) 601-21-53
НАТАЛЬЯ Михайловна СУРИНА
МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, аспирант; Воробьевы горы, Москва, 119899, Россия, (495) 939-44-68
ИНГА Игоревна ПОЛЕТАЕВА
МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, вед. научн. сотр., д-р биол. наук; Воробьевы горы, Москва, 119899, Россия, (495) 939-44-68
ВЛАДИМИР Сергеевич КУДРИН
ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, лаборатория психофармакологии, зав. лабораторией, канд. мед. наук; Балтийская ул., 8, Москва, 125315, Россия, (495) 601-21-53
КИРИЛЛ Сергеевич РАЕВСКИЙ
ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН гл. научн. сотр., профессор, член-корр. РАМН; Балтийская ул., 8, Москва, 125315, Россия, (495) 601-22-97
Резюме
Методом ВЭЖХ/ФД изучено содержание аспартата, глутамата, глицина, таурина и ГАМК в структурах мозга крыс Крушинского-Молодкиной (КМ) в условиях выраженного протективного эффекта нового противоэпилептического средства леветирацетама (ЛВТ). Показано, что во фронтальной коре введение ЛВТ сопровождается увеличением до значений нормы сниженных при судорогах уровней глутамата, глицина и таурина. В продолговатом мозге введение этого антиконвульсанта предотвращает вызываемое аудиогенным стрессом увеличение уровня ГАМК. Таким образом, защитное влияние ЛВТ на параметры аудиогенного эпилептиформного судорожного припадка, по-видимому, связано с корригирующим эффектом этого препарата на содержание как возбуждающих, так и тормозных нейромедиаторных аминокислот во фронтальной коре и продолговатом мозге крыс КМ.
Психофармакол. биол. наркол. 2008. Т. 8, № 3-4. С. 2448-2452
Работа поддержана грантами РФФИ № 07-04-00257а и РГНФ 0606-00351А.
Ключевые слова
леветирацетам (Кеппра); нейромедиаторные аминокислоты; аудиогенные судороги; крысы линии Крушинского-Молодкиной
© Коллектив авторов, 2008; лицензиат ООО «Архив»
ISSN 1606-8181
ВВЕДЕНИЕ
Эпилепсия — хроническое заболевание,характеризующиеся повторяющимися эпизодами неконтролируемого возбуждения отдельных нейронов мозга, патофизиологические механизмы которого до настоящего времени окончательно не установлены. Принято считать, что наиболее полно имитируют эпилепсию человека генетические модели судорожных состояний. Создание таких моделей в настоящее время рассматривается как один из наиболее перспективных путей, позволяющих не только приблизиться к пониманию механизмов, лежащих в основе эпилептогенеза, но и разработать базисные рекомендации проведения терапии фармакологическими противосудорожными средствами. В лаборатории физиологии и генетики поведения биологического факультета МГУ в результате многолетней селекции крыс Вистар была выведена инбредная линия Крушинского—Молодкиной (КМ) с генетически обусловленной эпилептиформной реакцией на звуковое раздражение. Эта линия аудиогенных животных характеризуется легкостью провокации судорог, четкостью и воспроизводимостью феномена, а также возможностью количественной оценки отдельных характеристик судорожного припадка [6].
Однако известно, что несмотря на значительные достижения в лечении, 20—30 % больных эпилепсией остаются резистентными к проводимой фармакотерапии [2, 3].
Принимая во внимание, что целью фармакотерапии эпилепсии является снижение «патологической» возбудимости нейронов, создание противоэпилепти-ческих средств (ПЭС) проводилось в двух принципиальных направлениях: потенциирование тормозных процессов (главным образом, в системе ГАМК) и угнетение процессов возбуждения (на уровне глутама-тергической передачи). Леветирацетам (Б-альфа-этил-2-оксо-1-пирролидин ацетамид) является ПЭС нового поколения. Механизм его противоэпилептичес-кого действия окончательно не установлен, но доказано, что он принципиально отличается от других анти-конвульсантов. В экспериментах с использованием классических скрининговых тестов максимального электрошока и коразоловых судорог у мышей и крыс ЛВТ, в отличие от других ПЭС, оказался не эффективен, тогда как на различных моделях киндлинга и аудио-генных судорог его противосудорожный эффект был очень значительным [5, 9, 14]. В клинических условиях ЛВТ оказался одним из наиболее эффективных (для лечения как генерализованных, так и парциальных припадков, в том числе и при монотерапии) представителей ПЭС нового поколения [2, 10].
Нами ранее было показано, что наиболее выраженное защитное влияние на развитие аудиогенного эпилептиформного приступа у крыс КМ имеет доза ЛВТ 80 мг/кг, введенная внутрибрюшинно (в/б) за 90 мин до звукового стимулирования [4]. Целью настоящей работы было изучение содержания нейро-медиаторных аминокислот аспартата, глутамата, глицина, таурина и ГАМК в структурах мозга крыс КМ в условиях выраженного противосудорожного эффекта ЛВТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В эксперименте были использованы 24 крысы-самца линии КМ массой 220—250 г в возрасте
4—5 месяцев. Животных содержали в стандартных условиях вивария биологического факультета МГУ со свободным доступом к воде и пище. Крысы получали комбикорм фирмы «Лабораторкорм» (Россия). При выполнении работы соблюдались правила проведения исследований с использованием экспериментальных животных. Водный раствор ЛВТ (Keppra, USB S.A. Pharma Sector, Бельгия) или воду вводили в/б за 90 мин до звуковой стимуляции или декапита-ции. Животные были разделены на 4 группы, по
5—7 особей.
• Норма (вода);
• ЛВТ (UCB, Бельгия), 80 мг/кг;
• Контроль (звуковая стимуляция, вода);
• Звуковая стимуляция, ЛВТ, 80 мг/кг.
Доза препарата и условия его введения были выбраны исходя из полученных нами ранее данных о максимальном противосудорожном влиянии ЛВТ на развитие аудиогенного приступа у крыс этой линии [4]. Стимуляция проводилась в звукопоглощающей камере электрическим звонком (интенсивность звука 100 дБ) до момента возникновения клонической фазы судорог или в течение 90 с. Для биохимических исследований структуры мозга (фронтальную кору, гипоталамус, стриатум и продолговатый мозг) извлекали на льду и замораживали в жидком азоте. Ткань размельчали в гомогенизаторе в 20 объемах 0,1Н НС1О4. Содержание аспартата, глутамата, глицина, таурина и ГАМК определяли модифицированным методом [17], используя ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией, на хроматографе Agilent 1100 (США) с аналитической колонкой HYPERSIL ODS, 4,6 • 250 мм, 5 мкм (длина волны возбуждения — 230 нм, длина волны испускания — 392 нм).
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Microsoft Excel с использованием t-критерия Стьюдента.
2449
2450
GABA
ASP 140т
ASP
TAU *#
GLU *#
GLY *#
- норма контроль ■ЛВТ+звук
GABA *#
140 120
TAU
GLU #
- норма контроль ■ЛВТ+звук
Рис. 1
Содержание медиаторных аминокислот во фронтальной коре крыс Крушинского-Молодкиной при введении леветирацетама (%): за 100 % принято содержание аминокислот в норме (мкмоль/г ткани, М ± m): аспартат — 1,018 ± 0,002; глутамат — 21,572 ± 0,132; глицин — 1,084 ± 0,008; таурин — 53,312 ± 0,074; ГАМК — 1,872 ± 0,194; значимость отличий: * — достоверность различий по сравнению с нормой при р < 0, 05; * — достоверность различий по сравнению с контролем при р < 0,05 (t-критерий Стьюдента)
Рис. 2
Содержание медиаторных аминокислот в продолговатом мозге крыс Крушинского-Молодкиной при введении леветирацетама (%): за 100 % принято содержание аминокислот в норме (мкмоль/г ткани, М ± т): аспартат —1,140 ± 0,002; глутамат — 8,398 ± 0,054; глицин — 4,926 ± 0,026; таурин — 20,010 ± 0,274; ГАМК — 1,928 ± 0, 004; значимость отличий: * — достоверность различий по сравнению с нормой при р < 0,05;
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Показано, что введение ЛВТ без звуковой стимуляции крысам КМ не изменяло уровень нейромеди-аторных аминокислот ни в одной из изученных структур (данные представлены на рис. 1 и 2 и обозначены «норма»). Результаты экспериментов по изучению содержания аминокислот в условиях звуковой стимуляции также представлены на рисунке (контроль). Так, во фронтальной коре (рис. 1) звуковой стресс у не получавших ЛВТ крыс сопровождался изменением уровней всех изученных аминокислот за исключением аспартата. В этой структуре при судорожном припадке концентрации аминокислот снижались почти до 60 % по сравнению с нормой. В продолговатом мозге (рис. 2) изменения касались только ГАМК, содержание которой возрастало до 122,4 %. Увеличение уровня глутамата в этой структуре не было достоверным (при р < 0,05). В двух других структурах — стриатуме и гипоталамусе — статистически значимые (р < 0,05) изменения концентраций аминокислот обнаружены не были.
При сравнении уровней аминокислот в условиях звукового стресса на фоне ЛВТ и без препарата различия были обнаружены только в коре и продолговатом мозге, т. е. в тех же структурах, в которых были выявлены изменения при действии звукового стимула. Так, во фронтальной коре введение ЛВТ сопровождалось увеличением практически до значений нормы сниженных при судорогах уровней глу-тамата, глицина и таурина. В продолговатом мозге различались уровни только ГАМК и глутамата, при этом введение ЛВТ также предотвращало вызываемое аудиогенным стрессом увеличение содержания этих медиаторов. Обнаруженное нами во фронтальной коре и в продолговатом мозге нормализующее влияние ЛВТ на содержание аминокислот распространяется как на возбуждающие (глутамат), так и на тормозные (ГАМК, глицин, таурин) аминокислоты.
Различий в содержании аминокислот в условиях аудиогенных судорог на фоне ЛВТ и без него в стри-атуме и гипоталамусе не выявлено.
Полученные нами результаты в целом согласуются с данными других авторов, изучавших влия-
ние аудиогенных припадков на содержание нейро-медиаторных аминокислот в структурах мозга животных разных линий [12, 18]. Известно, что основной механизм противоэпилептического действия многих ПЭС, в том числе и нового поколения, связан с воздействием на систему аминокислотных нейромедиаторов. Так, вигабатрин ингибирует активность ГАМК-трансаминазы, тиагабин увеличивает содержание ГАМК в ткани мозга, ламотрид-жин подавляет избыточное высвобождение глутаминовой кислоты и ингибирует деполяризацию, вызванную глутаматом, топирамат потенцирует ГАМК-ергическую и угнетает глутаматерги-ческую нейротрансмиссию [1, 7]. В отличие от них, ЛВТ не связывается с рецепторами ни возбуждающих, ни тормозных нейромедиаторов, в том числе и с рецепторами аминокислот, не влияет на функционирование натриевых или Т-типа кальциевых каналов, не воздействует на активность ГАМК-трансаминазы и глутаматдекарбоксилазы [9, 19]. Установлено, что основным механизмом противоэпилептического действия ЛВТ является связывание с белком мембран синаптических пузырьков SV2A [13].
Эти же авторы на модели аудиогенной эпилепсии у мышей показали, что величина противосудо-рожного эффекта производных ЛВТ прямо пропорциональна их способности связываться с данным белком. Связывания ЛВТ и его производных не происходит во фракциях мембран или очищенных си-наптических пузырьков мозга мышей, лишенных указанного белка. Предполагается, что белок SV2A может участвовать в регулировании кальций-зависимого экзоцитоза синаптческих везикул, возможно, за счет взаимодействия с пресинаптическим белком синаптотагмином [9, 13]. К1^аа^ Н. [15] рассматривает ЛВТ как первый препарат нового класса ПЭС, который не только подавляют судороги, но и защищает нейроны от патологических изменений, приводящих к развитию эпилептических припадков. Антиэпилептогенное и нейропротектив-ное действие этого антиконвульсанта получило подтверждение в ряде исследований [8, 10, 11]. Вопрос о том, может ли обнаруженная в данной работе нормализация уровней нейромедиаторных аминокислот в структурах мозга крыс КМ (в том числе снижение уровня глутамата во фронтальной коре) обусловливать нейропротективный эффект ЛВТ, требует дополнительных исследований.
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что защитное влияние ЛВТ на параметры эпилептиформного припадка сопровождается нормализацией во фронтальной коре и
продолговатом мозге крыс линии КМ измененных аудиогенным стрессом уровней как возбуждающих, так и тормозных нейромедиаторных аминокислот.
ЛИТЕРАТУРА
2451
1. Бадалян О.Л., Бурд С.Г., Савенков А.А. и др. Оптимизация фармакотерапии эпилепсии. Возможности применения габапентина. // Неврология. 2006. Т. 14, № 9. С. 710-713.
2. Калинин В.В. Препарат леветирацетам (кеппра) в эпилептологии. // Ж. неврол. и психиат. 2007. Т. 107, № 3. С. 74-77.
3. Карлов В.А., Власов П.Н. Эффективность кеп-пры в составе комплексной терапии при фармако-резистентной эпилепсии у взрослых. // Ж. неврол. и психиат. 2005. № 7. С. 40-44.
4. Маликова Л.А., Федотова И.Б., Полетаева И.И., Раевский К.С. Противосудорожное действие левети-рацетама при аудиогенных эпилептиформных припадках у крыс Крушинского-Молодкиной. // Экс-перим. и клин. фармакол. 2007. Т. 70, № 6. С. 3-5.
5. Раевский К.С., Маликова Л.А., Калинин В.А. Ней-рональные и нейрохимические механизмы действия нового антиэпилептического препарата леветирацетама. // Эксперим. и клин. фармакол. 2007. Т. 70, № 2. С. 70-74.
6. Семиохина А.Ф., Федотова И.Б., Полетаева И.И. Крысы линии Крушинского-Молодкиной: исследования аудиогенной эпилепсии, сосудистой патологии и поведения. // Ж. высш. нерв. деят. 2006. Т. 56, № 3. С. 298-316.
7. Энциклопедия лекарств. Ежегодный сборник. М.: «РЛС-2007», 2006.
8. Hanon E., Klitgaard H. Neuroprotective properties of the novel antiepileptic drug levetiracetam in the rat middle cerebral artery occlusion model of focal cerebral ischemia. // Seizure. 2001. Vol. 10, N 4. P. 287-293.
9. De Smedt T., Raedt R., Vonck K., Boon P. Levetiracetam: the profile of a novel anticonvulsant drug-part I: preclinical data. // CNS Drug Rev. 2007. Vol. 13, N 1. P. 43-56.
10. De Smedt T., Raedt R., Vonck K., Boon P. Levetiracetam: part II, the clinical profile of a novel anticonvulsant drug. // CNS Drug Rev. 2007. Vol. 13, N 1. P. 57-78.
11. Dedeurwaerdere S., Vonck K., De Herdt V., et al. Neuromodulation with levetiracetam and vagus nerve stimulation in experimental animal models of epilepsy. // Acta Neurol. Belg. 2006. Vol. 106, N 2. P. 91-97.
12. Dufour F, Nalecz K.A., Nalecz M.J., Nehlig A. Modulation of absence seizures by branched-chain amino acids: correlation with brain amino acid concentrations. // Neurosci. Res. 2001. Vol. 40, N 3. P. 255-263.
13. Lynch B.A., Lambeng N., Nocka, et al. The synaptic vesicle protein SV2A is the binding site for the
2452
antiepileptic drug levetiracetam. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101, N 26. P. 9861-9866.
14. Klitgaard H., Matagne A., Gobert J., Wulfert E. Evidence for a unique profile of levetiracetam in rodent models of seizures and epilepsy. // Eur.J. Pharmacol. 1998. Vol. 353 (2-3). P. 191-206.
15. Klitgaard H. Levetiracetam: the preclinical profile of a new class of antiepileptic drugs? // Epilepsia. 2001. Vol. 42, N 4. P. 13-18
16. Meurs A., Clinckers R., Ebinger G., et al. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. // Epilepsy Res. 2008. Vol. 78, N 1. P. 50-59.
17. Pearson S.J., et al. Electrochemical detection of human brain transmitter amino acids by highperformance liquid chromatography of stable o-phtalaldehyde-sulphite derivatives. // J. Neuronal. Transm. 1991. Vol. 86. P. 151-157.
18. Popova L.D. The influence of kynurenic acid on the content of excitatory and inhibitory mediators in rats with different levels of seizure susceptibility. // Ukr. Biokhim Zh. 2006. Vol. 78, N 5. P. 120-126.
19. Sills G.J., Leach J.P., Fraser C.M., et al. Neurochemical studies with the novel anticonvulsant
levetiracetam in mouse brain. // Eur.J. Pharmacol. 1997. Vol. 325, N 1. P. 35-40.
Malikova LA1, Fedotova IB2, Klodt PM1, Surina NM2, Poletaeva II2, Kudrin VS1, Rayevsky KS1
Effects of Levetiracetam on the Content of Neurotransmitter Amino Acids in the Brain of Rats with the Audiogenic Epileptiform Siezures
Citation: Psychopharmacol Biol Narcol. 2008; 8(3-4): 2448-2452
1 Zakusov Institute of Pharmacology RAMS; Moscow, 125315, Russia
2 Biology Department, Lomonosov State University; Moscow, 119899, Russia
SUMMARY: Background: The anticonvulsant action of novel antiepileptic drug levetiracetam (LVT) on the content of aspartate, glutamate, glycine, taurine and GABA in brain structures of Krushinsky-Molodkina (KM) rats were studied using HPLC/FD techniques. The treatment with LVT anticipated decrease of levels of glutamate, glycine and taurine produced by seizure attack. In medulla oblongata LVT prevented the elevation of GABA level induced by the audiogenic stress. Thus, the anticonvulsant action of LVT against audiogenic seizures is likely to be related to the normalizing effect upon the levels of both excitatory and inhibitory neurotransmitter amino acid in the frontal cortex and medulla oblongata of KM rats.
KEY WORDS: Levetiracetam (Keppra); Neurotransmitter amino acids; Audiogenic seizures; Krushinsky-Molodkina (KM) rats strain
Correspondence to: Ludmila A. Malikova
Zakusov Institute of Pharmacology Russian Academy of Medical Sciences; Moscow, 125315, Russia e-mail: ludmal2006@yandex.ru
Epub 2009 Feb 15. Russian © PPBN
http://www.psychopharmacology.ru/index.php/PPBN/article/view/981 http://www.elibrary.ru
