CC BY
89
УДК 612.017:616-001.17-085.281.9
ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНАЛОГА ИНДОЛИЦИДИНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ТЕРМИЧЕСКИХ ОЖОГАХ
© Лазаренко В.А., Ляшев Ю.Д.1, Шевченко Н.И.
Кафедра хирургических болезней ФПО, 1 кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: nickolya@yandex. га
В работе установлено, что развитие ожога сопровождается быстрым и длительным угнетением фагоцитарной активности нейтрофилов. Применение аналога индолицидина приводило к выраженному увеличению числа фагоцитирующих клеток уже на 4 сутки после нанесения ожоговой травмы. Восстановление поглотительной способности фагоцитов под влиянием пептида наблюдалось на 7-10 сутки. Указанные эффекты аналога индолицидина могут быть связаны как с прямым действием пептида на нейтрофильные гранулоциты, так и с его влиянием на иммунокомпетент-ные клетки и микроорганизмы.
Ключевые слова: аналог индолицидина, нейтрофильные гранулоциты, ожог.
EFFECT OF A SYNTHETIC ANALOGUE INDOLICIDIN ON THE PHAGOCYTIC ACTIVITY OF NEUTROPHILIC GRANULOCYTES OF THE BLOOD IN THERMAL BURNS Lazarenko V.A., Lyashev Y.D.1, Shevchenko N.I.
Department of Surgical Diseases of FPE, 1 Pathophysiology Department of Kursk State Medical University, Kursk
It has been established that experimental bum causes the rapid and prolonged suppression of the phagocytic activity of neutrophils. The use of analogue indolicidin leds to a pronounced increase in the number of phagocytic cells at 4 days after application of burn injury. Restoration of the absorptive capacity of phagocytes under the influence of the peptide were observed for 7-10 days. The indicated effects of synthetic analogue indolicidin can be explained by the direct action of the peptide on neutrophils or influence on the immune cells and microorganisms.
Keywords: indolicidin analogue, neutrophils, burn.
Течение обширных термических ожогов сопровождается дестабилизацией иммунного статуса с развитием вторичного иммунодефицита, создает благоприятные предпосылки для возникновения, развития и генерализации инфекции. Таковыми являются утрата на большой площади защитного покрова, нарушение обменных функций организма, угнетение факторов антимикробной защиты [7].
Наравне с этим многие из традиционных антибиотиков постепенно теряют свои активные качества вследствие постоянного увеличения числа бактериальных штаммов, устойчивых к используемому препарату [8], в связи с чем разработка новых активных антибактериальных соединений по-прежнему остается актуальной.
Одним из возможных путей решения проблемы является создание препаратов на основе антибиотических пептидов [9]. Изучение биоцидной активности, иммуномодулирующих, антиокси-дантных свойств и влияния на репаративную способность тканей является перспективным направлением изучения этих пептидных соединений.
Важную роль в регенерации кожи, подвергшейся термическому ожогу, играет состояние фагоцитарной системы. Она обеспечивает элиминацию продуктов распада некротизированных тканей и осуществляет первую линию защиты от
инфекции, предотвращая ее генерализацию [3]. Одним из главных участников ранних этапов развития острой травмы являются нейтрофильные гранулоциты (НГ), для которых характерно сочетание готового эффекторного потенциала и способности к его быстрой мобилизации [5].
Целью нашей работы явилось изучение влияния синтетического аналога антимикробного пептида индолицидина на фагоцитарную активность НГ крови при ожоговой травме.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на 128 крысах линии Ви-стар обоего пола массой 180-220 граммов. Восемь животных оставались интактными, остальным под эфирным наркозом выполняли ожог кожи спины Ша-ШЪ степени площадью 18% от площади тела [4]. Исследуемые животные были разделены на три группы: контрольная и две опытные по 40 особей в каждой. Крысам контрольной группы ежедневно в течение 5 суток после ожоговой травмы внутрибрюшинно вводили 0,2 мл физиологического раствора, а животным опытных групп синтетический аналог антимикробного пептида индолицидин (ООО «НПФ Верта», г. Санкт-Петербург) в дозах 100 мкг/кг и
500 мкг/кг в аналогичном объеме физиологического раствора. Указанные дозы выбраны на основе анализа данных литературы о высокой эффективности препарата в данном диапазоне доз [6]. Использованный аналог (Инд 21) - это модифицированная аминокислотой лизином молекула природного индолицидина, оказывающая более выраженное бактерицидное действие, чем исходная молекула [6].
Животных контрольной и опытных групп выводили из эксперимента на 1, 4, 7, 10 и 14-е сутки и изучали уровень фагоцитарной активности НГ по общепринятой методике [2] в нашей модификации, для чего в лунку иммунологического планшета с 0,5 мл гепаринизированной крови добавляли бактериальную взвесь Staphylococcus aureus (109 микробных тел в 1 мл) из расчета 10 микробов на 1 гранулоцит. Кровь, смешанную с бактериями, инкубировали 30 минут в термостате при температуре 3700С, встряхивая каждые 10 минут. Приготовленные мазки фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. При микроскопии препаратов определяли следующие показатели, характеризующие актив-
ность фагоцитов: фагоцитарный индекс (ФИ) -число активно фагоцитирующих НГ из 100 клеток; фагоцитарное число (ФЧ) - среднее число микробных тел, захваченных одним фагоцитирующим НГ; опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ) -среднее количество поглощенных микробных тел в расчете на 100 НГ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ^критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ полученных результатов показал, что нанесение ожоговой травмы приводило к выраженному падению фагоцитарной активности НГ периферической крови по сравнению с интакт-ными животными, что проявлялось снижением всех исследованных показателей (таблица 1). ФИ у контрольных животных оставался низким на протяжении всего эксперимента. ФЧ и ОФИ также уменьшались, восстанавливаясь к 14 суткам после нанесения ожога.
Таблица 1
Фагоцитарная активность НГ крови крыс контрольной и опытных групп в различные сроки после ожоговой травмы
Срок эксперимента Исследуемый показатель Контрольная группа Опытные группы
Аналог индолицидина, 100 мкг/кг Аналог индолицидина, 500 мкг/кг
1 сутки ФИ 18,0±1,1 23,6±2,1 24,4±3,2
ФЧ 1,1±0,02 1,2±0,1 1,3±0,1
ОФИ 19,5±0,9 28,6±3,7* 31,4±3,4**
4 сутки ФИ 23,2±3,8 30,0±1,8 41,2±3,7**
ФЧ 1,4±0,1 1,3±0,08 1,5±0,08
ОФИ 32,8±6,4 39,9±2,8 61,2±5,5**
7 сутки ФИ 22,0±1,1 41,6±1,2** 38,8±3,3**
ФЧ 1,5±0,1 1,9±0,06** 2,4±0,1**
ОФИ 32,6±4,1 79,6±1,9** 94,3±10,8**
10 сутки ФИ 26,3±1,3 38,6±1,9** 39,8±1,7**
ФЧ 1,9±0,2 2,2±0,1 2,4±0,1*
ОФИ 48,8±4,3 82,3±5,6** 96,2±7,8**
14 сутки ФИ 30,4±3,7 38,8±1,6 40,0±1,3*
ФЧ 2,3±0,1 2,7±0,1** 2,8±0,2*
ОФИ 69,3±9,5 106,6±6,8* 112,1±7,9**
Интактная группа ФИ 39,5±1,1
ФЧ 2,6±0,2
ОФИ 104,6±8,6
Примечание: * - p< 0,05; ** - p< 0,01 в сравнении с контрольной группой.
Иную динамику изменения фагоцитарной активности НГ наблюдали в опытных группах. Уже на четвертые сутки после ожоговой травмы ФИ и ОФИ увеличивались по сравнению с данными показателями в эти сроки у контрольных животных. К седьмым суткам отмечено значительное повышение всех показателей в опытных группах, и ФИ и ОФИ не отличались достоверно от аналогичных значений у интактных крыс. Установлено, что применение пептида в дозе 500 мкг/кг оказывало более выраженное стимулирующее влияние по сравнению с низкой дозой, что проявлялось статистически достоверным повышением ФИ на четвертые сутки эксперимента, а ФЧ на седьмые.
Полученные результаты подтверждают данные литературы о быстром и длительном угнетении врожденного иммунитета при ожоговой болезни. В работе установлено, что фагоцитарная активность НГ периферической крови снижалась на протяжении всего периода эксперимента, что проявлялось уменьшением всех изучаемых показателей в контрольной группе: ФИ, ФЧ и ОФИ.
Применение аналога индолицидина приводило к выраженному увеличению числа фагоцитирующих НГ уже на 4 сутки после нанесения ожоговой травмы по сравнению с контрольной группой. При этом не установлено в этот период повышения поглотительной способности клеток. Указанные изменения, по-видимому, связаны с повышением под влиянием аналога индолициди-на содержания молодых НГ в периферической крови, которые в функциональном отношении менее полноценны [5], что и обусловливает падение ФИ. С другой стороны это можно объяснить также повреждающим действием токсинов, им-муносупрессивных факторов и стрессорных гормонов на гранулоциты и их предшественники [3].
Установленный в работе стимулирующий эффект Инд 21 на фагоцитарную активность НГ, по-видимому, объясняется особенностями бактерицидного действия антимикробных пептидов, а именно, быстрым повреждением мембран микроорганизмов с последующим повышением их проницаемости [10, 11]. Такие клетки активно поглощаются НГ. Помимо быстрого и выраженного бактерицидного эффекта природный индолици-дин и его аналоги оказывают иммуномодулирующее действие [1], что, учитывая тесную кооперацию иммунокомпетентных клеток и нейтрофи-лов в развитии защитных реакций, также способствует активации фагоцитарной функции НГ.
В работе установлено, что влияние исследуемого пептида более выражено при его применении в дозе 500 мкг/кг. Известно, что индолицидин обладает низкой устойчивостью к действию пептидаз [12]. Синтетический аналог, использованный в работе, имеет больший период полураспада
по сравнению с природным пептидом, однако введение большей дозы приводит к увеличению времени действия препарата, что, вероятно, и обусловливает ее более выраженный эффект.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артамонов А.Ю., Шанин С.Н., Орлов Д.С., Шамова О.В., Колодкин Н.И., Рыбакина Е.Г. Иммуномодулирующая активность антимикробных пептидов индолицилина и его структурных аналогов // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 1. - С.101-104.
2. Галанкин В.Н., Юнусходжаев Э.Х., Токмаков А.М. Способ определения фагоцитарной активности полиморфноядерных нейтро-филов // Архив патологии. - 1987. - Т. 49, № 6. - С. 77-79.
3. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете // СПб. : Наука. - 2006. - 261 с.
4. Лазаренко В.А., Моновцов И.А., Квачахия Л.Л. Регенерация кожи и костной ткани у мышей с экспериментальными травмами при иммунокоррекции риботаном // Курск. науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». -2004. - № 2-3. - С. 50-55.
5. Пинегин Б.В., Маянский А.Н. Нейтрофилы: структура и функции // Иммунология. -2007. - № 6. - С. 374-382.
6. Смирнова М.П., Афонин В.Г., Шпень В.М., Тяготин Ю.В., Колодкин Н.И. Взаимосвязь структура - активность в ряду аналогов антибактериального пептида индолицидина. I. Синтез и биологическая активность аналогов с увеличением амфипатичностью и повышенным общим положительным зарядом молекулы. // Биоорганическая химия. - 2004. - Т. 30, № 5. - С. 458-465.
7. Усов В.В., Обыдейникова Т.Н., Тарасов А.Е., Горшеев А.Н. Оценка иммунного статуса у тяжелообожженных // Тихоокеанский мед. журнал. - 2008. - № 1. - С. 53-55.
8. Cassell G.H. Emergent antibiotic resistance: health risks and economic impact // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1997. - V. 18, № 4. -P. 271-274.
9. Guani-Guerra E., Santos-Mendoza T., Lugo-reyes S.O., Teran L.M. Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease // Clin. Immunol. -2010. - Vol. 135, № 1. - P. 1-11.
10. Lee D.G., Kim H.K., Kim S.A., Park Y., Park S.C., Jang S.H., Halm K.S. Fungicidal effect of indolicidin and its interaction with phospholipid membranes // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2003. - Vol. 305, № 2. - P. 305-310.
11. Orlov D.S., Nguyen T., Lehrer R.I. Potassium release, a useful tool for studying antimicrobial peptides // J. Microbiol Methods. - 2002. - Vol. 49, № 3. - P. 325-328.
12. Rozek A., Powers J.P., Friedrich C.L., Hancock R.E. Structurebased design of an indolicidin peptide analogue with increased protease stability // Biochemistry. - 2003. - Vol. 42, № 4. -P. 14130-14138.
