CC BY
23
к исходным данным. Заметная разница наблюдалась у птиц IV гр.: количество эритроцитов равнялось 3,18+0,12- 1012/л (Р<0,01), что было на 11,1% ниже показателей у перепелов интактной группы. Содержание лейкоцитов было выше на 14,2%, из них количество псевдоэозинофилов на 44,5%, эозинофилов — на 56,2% выше показателей в интактной гр. Это указывает на длительный воспалительный процесс, происходящий в организме.
У птиц V гр. показатели достоверно отличались от VI интактной. У них визуально наблюдались бледность гребешка и конечностей, отмечалась раздражительность.
На 14-е сут. после лечения у птиц I, II и III опытных гр. гематологические показатели достигли физиологической нормы. Они были свободны от паразитов, об этом свидетельствуют данные, полученные при копроскопическом исследовании перепелов опытных групп, которые были свободны от кишечных паразитов. Показатели у перепелов I и II опытных гр., которым вводили препарат «С-16», были не достоверны относительно показателей в VI интактной гр. Препарат альбендаозол 10% также показал хорошие результаты, но процентное соотношение псевдоэозинофилов отличалось от интактной гр. и было выше на 32% (Р<0,01).
На 30-е сутки после начала эксперимента у перепелов четырёх опытных групп гематологические показатели были в пределах физиологической нормы, сами птицы были активные, отклонений в поведении, приёме корма и воды не наблюдалось, яйценоскость была регулярной. У птиц V гр. (фоновый показатель) были выраженная анемия гребней, взъерошенный перьевой покров, раздражительность. Гематологические показатели относительно интактной группы достоверно различались и заметно отличались от показателей птиц опытных групп. Наблюдалась эритроцитопения — 1,72+0,10- 1012/л, что было на 53,7% (Р<0,001) ниже показателей у перепелов интактной группы, выраженный лейкоцитоз — 57,23+2,18-109/л — выше на 55,4% (Р<0,001). Уровень гемоглобина снизился до 84,20+4,38 г/л (46%), белые кровяные тельца в лейкоформуле также достоверно различались относительно интактной группы, что свидетельствует о сильном воспалительном процессе в организме.
Выводы: 1. У перепелов, искусственно зараженных нематодой Ascaridia galli, после лечения препаратами «С-16», альбендазолом и фенбенда-золом гематологические показатели полностью восстанавливаются до физиологической нормы на 14-е сут., что говорит о хорошей переносимости птицами этих антигельминтиков.
2. В крови у перепелов, заражённых нематодой Ascaridia galli, отмечается эритропения, гипогемо-глобинэмия и лейкоцитоз. Анализ лейкоцитарной формулы показывает, что у птиц выявлена эози-нофилия, лимфоцитопения, которые связаны с патогенным действием гельминтов и возможным последующим развитием вторичной инфекции.
Литература
1. Садовников Н.В. Общие и специальные методы исследования крови птиц промышленных кроссов / Н.В. Садовников, Н.Д. Придыбайло, Н.А. Верещак, А.С. Заслонов // Екатеринбург-СПб., 2009. С. 8-15.
2. Галкина И.В. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / И.В. Галкина, Н.Б. Мельникова, Е.В. Тудрий, В.И. Галкин, О.Е. Жильцова, О.В. Жукова, С.Н. Егорова // Фармация. 2009. № 4. С. 35-38.
3. Зеленская С.А., Гизатуллин Р.Р., Лутфуллина Н.А. Изучение острой токсичности лекарственного средства «С-16» // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. М., 2017. С. 179-180.
4. Зеленская С.А., Лутфуллин М.Х. Острая токсичность и кумулятивные свойства лекарственной субстанции «С-16» на белых мышах // Современные проблемы общей и частной паразитологии: Матер. II междунар. паразит. симпоз. СПб., 2017. С. 115-119.
5. Пат. 2629316 Рос. Федерация: МПК51 А61К 31/00 31/66 36/185 33/02 33/14 Средство для лечения нематодозов и эймериозов в ветеринарии / И.В. Галкина, Д.И. Бахтияров, Р.И. Шангараев, С.А. Зеленская, Р.Р. Гиззатуллин, Н.А. Лутфуллина, М.Х. Лутфуллин, В.И. Галкин; заявитель и патентообладатель ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (ФГАОУ ВО КФУ) (RU). № 2017108570; заявл. 14.03.2017; опубл. 28.08.2017, Бюл. № 25. 4 с.
6. Бессарабов Б.Ф. Гематологические показатели и здоровье птиц / Б.Ф. Бессарабов, С. Алексеева, Л. Клетиков [и др.] // Животноводство России. 2009. № 3. С. 17-18.
7. Битюков И.П., Лысов В.Ф., Сафронов Н.А. Практикум по физиологии сельскохозяйственных животных. М.: Агро-промиздат, 2009. 256 с.
8. Болотников И.А., Соловьев Ю.В. Гематология птиц. Л.: Наука, 1980. 116 с.
9. Кондрахин И.П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: справочник / И.П. Кондрахин,
A.В. Архипов, В.И. Левченко, Г.А. Таланов, Л.А. Фролова,
B.Э. Новикова / Под ред. И.П. Кондрахина. М.: КолоС, 2004. 520 с.
10. Галкина И.В. Синтез и апробация новых антигельмин-тиков / И.В. Галкина, М.Х. Лутфуллин, С.Н. Егорова, Р.Ф. Мавлиханов, Н.А. Лутфуллина, А.М. Идрисов, Н.В. Воробьева, Р.И. Хамидуллин, Л.М. Юсупова, Л.В. Спатлова, В.И. Галкин // Российский паразитологи-ческий журнал. 2010. № 2. С. 99-105.
Функциональная активность синтетического производного индолицидина
Т.М. Пашкова, к.б.н, ФГБОУ ВО Оренбургский ГАУ
Проблема антимикробной резистентности (АМР) в настоящее время приобрела критическое значение для гуманной и ветеринарной медицины. Доказа-
тельством этому являются ежегодные сообщения о выявлении новых случаев устойчивости бактерий [1]. Масштаб проблемы иллюстрирует и решение глав государств, входящих в ООН, координировать усилия по сдерживанию распространения АМР [2].
Сложившаяся ситуация заставляет учёных держать в поле зрения вопрос об изыскании новых антимикробных средств, способных обеспечить эффективную борьбу с лекарственно-устойчивыми микроорганизмами. К числу таких альтернатив относятся антимикробные пептиды (АМП) — важный молекулярный механизм врождённого иммунитета.
Описано более четырёх тысяч разнообразных эндогенных пептидных антибиотиков [3, 4], но только недавно интерес к этим молекулам перешёл из плоскости фундаментальных исследований в клиническую область, поскольку их способность быстро убивать клетки-мишени, необычайно широкий спектр действия и активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, делают эти молекулы крайне перспективными для разработки лекарственных препаратов.
Среди более 4 тыс. описанных в настоящее время эндогенных антимикробных пептидов особое внимание привлекает индолицидин — катионный антимикробный пептид, выделенный из нейтро-фильных гранулоцитов быка. Интерес к данному соединению обусловлен не только широким спектром его биологической активности, включающей антимикробное [5], иммуномодулирующее [6] действия, стимуляцию регенерации тканей [7], но и уникальной химической структурой, обеспечивающей значительный антимикробный эффект.
Однако побочным эффектом действия ин-долицидина является высокая цитотоксическая активность, которая ограничивает его прямое использование в ветеринарной и медицинской практике и заставляет модифицировать молекулу таким образом, чтобы сохранить её высокий антимикробный потенциал, минимизировав побочные эффекты [8].
Всё вышеизложенное предопределило цель настоящего исследования — изучить функциональные свойства нового синтетического производного индолицидина.
Материал и методы исследования. В работе исследованы функциональные свойства производного индолицидина (Ind-58), полученного путём химического синтеза коллегами из федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства. Ind-58 характеризуется более низкой по сравнению с природной молекулой индолицидина побочной токсической активностью в отношении эритроцитов [9].
Антимикробные свойства Ind-58 оценивали в отношении тест-культур коллекции: Escherichia coli MG1655, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus cereus ATCC 14893, Staphylococcus aureus FDA 209 P методом микротитрования в бульоне [10]. За минимальную ингибирующую концентрацию принимали концентрацию пептида, полностью предотвращающую формирование колоний.
Антилизоцимную активность (АЛА) определяли по методике О.В. Бухарина с соавторами (1999) [11].
Влияние различных концентраций АМП на антилизоцимную активность микроорганизмов определяли в отношении вышеперечисленных культур, предварительно соинкубированных в течение часа с синтетическим производным индолицидина в минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и 1/4 минимальной ингибирующей концентрации.
Полученные в ходе исследования численные материалы были обработаны статистически. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивалась по ^критерию Стьюдента [12].
Результаты исследования. Как показало наше исследование, 1иё-58 обладал антимикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов с минимальными бактерицидными концентрациями на уровне нескольких десятков микрограмм на миллилитр (табл.).
Антимикробная активность синтетического производного индолицидина — Ind-58
Тест-культура MИК, мкг/мл
Грам-отрицательные E. coli MG1655 P. aeruginosa ATCC 27853 12,5 >100
Грам-положительные B. cereus ATCC 14893 S. aureus FDA 209 P 6,25 6,25
В сравнительном аспекте наиболее выраженное антимикробное действие Ind-58 демонстрировал в отношении S. aureus и B. cereus.
В серии экспериментов установлено одно-направленно ингибирующее действие Ind-58 на антилизоцимную активность микроорганизмов.
Индолицидин-58 в обеих изученных концентрациях оказывал максимальный подавляющий эффект (более 70%) в отношении выраженности антилизоцимного признака B. cereus по сравнению с исходным уровнем АЛА (р<0,001).
Ингибирующее действие у синтетического производного индолицидина выявлено в отношении АЛА кишечной палочки в МИК и 1/4 МИК: снижение уровня изучаемого признака по сравнению с исходным на 57% (р<0,05) и 73% (Р<0,01) соответственно.
Умеренное снижение антилизоцимного признака с амплитудой от 14 до 21% регистрировали после соинкубирования клонов золотистого стафилококка с Ind-58 в 1/4 МИК и МИК соответственно.
Способность деградировать лизоцим у клонов P. aeruginosa ATCC 27853 под воздействием синтетического производного индолицидина в МИК и 1/4 МИК снижалась на 26% (рис.).
Таким образом, анализ динамики антилизоцим-ной активности микроорганизмов под влиянием синтетического производного индолицидина по-
1,8 1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
Рис. - Влияние 1п^58 на антилизоцимную активность микроорганизмов
Примечание: * — достоверность различий выраженности антилизоцимной активности микроорганизмов в контроле и после соинкубирования с синтетическим производным индолицидина - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001
казал однозначное значимое снижение изучаемого показателя.
Преимущества АМП по сравнению с конвенци-альными антибиотиками микробного происхождения делают их крайне перспективными базовыми соединениями для разработки лекарственных препаратов. Однако, поскольку эндогенные антимикробные пептиды могут оказывать цитотоксическое действие на клетки высших эукариот, их прямое использование в ветеринарной и медицинской практике ограничено [13]. Изучение взаимосвязи структура — биологическая активность в ряду химически модифицированных аналогов эндогенных АМП позволяет установить структурные требования к молекуле с высоким терапевтическим индексом. Последующее изучение функциональной активности полученных производных открывает широкие перспективы для выявления и внедрения в практику активных антимикробных соединений.
Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии у синтетического производного Ыё-58 антимикробной активности в отношении различных представителей грамположительных и грамотрицательных форм бактерий, причём значения МИК у синтетического АМП были ниже, чем у природной молекулы индолицидина [14]. Известно, что суммарный заряд Ыё-58 при рН 7,0 равен +4, в то время как у природной молекулы эндогенного антибиотика - +3. Принимая во внимание данные литературы [15], согласно которым увеличение общего положительного заряда молекулы способствует усилению антимикробных свойств, полученные нами результаты представляются верными.
Для сохранения возбудителя от антимикробных факторов сыворотки крови или фагоцитов бактериальная клетка способна продуцировать секрети-руемые субстанции, направленные на разрушение
механизмов клеточной и гуморальной защиты и обеспечивающие длительную персистенцию в организме хозяина. Подавление препаратами персистентных свойств возбудителя затрудняет его паразитирование в макроорганизме и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий [11], поэтому на следующем этапе нашей работы мы попытались оценить влияние Ind-58 на антилизоцимную активность микроорганизмов.
Полученные в исследованиях in vitro данные позволили установить, что под влиянием синтетического АМП происходит снижение способности микроорганизмов деградировать лизоцим, что может быть связано с нарушением работы бактериального генома [9].
Таким образом, полученные результаты открывают перспективу для дальнейшего изучения функциональной активности индолицидина-5 8 с целью создания нового антимикробного препарата, эффективного в отношении патогенных микроорганизмов, способных длительно персистировать в организме хозяина. Выводы:
1. Индолицидин (Ind-58) обладает антимикробной активностью в отношении всех изученных микроорганизмов, причём наиболее выраженное антимикробное действие демонстрирует в отношении S. aureus и B. cereus.
2. Установлено однонаправленно подавляющее действие Ind-58 на антилизоцимную активность всех изученных микроорганизмов. Максимальный ингибирующий эффект отмечен в отношении выраженности АЛА B. cereus.
3. Перспективным является дальнейшее исследование индолицидина-58 для создания нового антимикробного препарата, пригодного для борьбы с персистирующей бактериальной инфекцией.
Литература
1. Antibiotic resistance: Italian awareness survey / A. Prigitano [et al.] // J. Infect. Public Health. 2018. Vol. 11(1). P. 30-34. doi: 10.1016/j.jiph.2017.02.010.
2. Venter H., Henningsen M.L., Begg S.L. Antimicrobial resistance in healthcare, agriculture and the environment: the biochemistry behind the headlines // Essays Biochem. 2017. Vol. 61(1). P. 1-10.
3. Сычёва М.В. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к образованию биоплёнок / М.В. Сычёва, О.Л. Карташова, Е.В. Шейда, И.В. Валышева // Вестник КрасГАУ. 2011. № 1. С. 130-132.
4. Vieira M.E., Linhares M.B. Isolation, characterization and mechanism of action of an antimicrobial peptide from Lecythis pisonis seeds with inhibitory activity against Candida albicans // Acta Biochim. Biophys. Sin. 2015. Vol. 47. No. 9. P. 716-729.
5. An integrated study on antimicrobial activity and ecotoxicity of quantum dots and quantum dots coated with the antimicrobial peptide indolicidin / E. Galdiero [et al.] // Int. J. Nanomedicine. 2016. Vol. 11. P. 211-4199.
6. Артамонов А.Ю. Иммуномодулирующая активность антимикробных пептидов индолицидина и его структурных аналогов / А.Ю. Артамонов [и др.] // Медицинская иммунология. 2009. № 1. С. 101-104.
7. Лазаренко В.А., Ляшев Ю.Д., Шевченко Н.И. Эффекты синтетического аналога индолицидина на регенерацию кожи при локальной холодной травме // Научные ведомости Белгородского государственного университета. 2015. № 4 (201). С. 77-84.
8. Пантелеев П.В. Строение и биологические функции р-шпилечных антимикробных пептидов / П.В. Пантелеев [и др.] // Айа Naturae. 2015. Т. 7. № 1 (24). С. 39-50.
9. Antimicrobial activity of the indolicidinderived novel synthetic peptide In-58 / A.S. Vasilchenko [et al.] // J. Pept. Sci. 2017. Vol. 23. P. 855-863.
10. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R.E.W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances // Nature protocols. 2008. Vol. 3(2). P. 163-175.
11. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий: монография / О.В. Бухарин. М.: Медицина, 1999. 366 с.
12. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьёв. Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. 180 с.
13. Antimicrobial activity of novel synthetic peptides derived from indolicidin and ranalexin against Streptococcus pneumoniae / H.M. Jindal [et al.] // PLoS One. 2015. Vol. 10. No. 6. doi: 10.1371/journal. pone. 0128532.
14. In vitro activities ofmembrane-active peptides against gram-positive and gram-negative aerobic bacteria / A. Giacometti [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. Vol. 42(12). P. 3320-3324.
15. Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides // Biopolymers. 2000. No. 55(1). P. 4-30.
Относительная масса селезёнки малой лесной мыши (Sylvaemus uralensis Pallas, 1811) как морфофизиологический критерий состояния системы крови и иммунитета в зоне влияния газоперерабатывающего завода*
Д.А. Боков, н.с, С.Г. Топурия, соискатель, ФГБОУ ВО Оренбургский ГМУ
Проблема увеличения абсолютной и относительной массы селезёнки самцов и самок всех возрастов у мелких млекопитающихиз естественных местообитаний продолжает дискутироваться в литературе [1—3].Остаются неясными причины, механизмы, экологическое и физиологическое значение данного феномена. Селезёнка у грызунов является жизненно важным органом. Спленэктомия у лабораторных животных (крыс, мышей) всегда приводит к быстрой гибели оперированных животных [4—6]. Это связано, вероятно, с нормальной постнатальной кроветворной активностью в органе, что является важным механизмом поддержания тканевого гомеостаза системы крови в целом, наряду с медуллярным гемопоэзом. Кроме того, следует отметить реактивную лабильность тканевых элементов селезёнки (ретикулярной стромы, лимфоидной и миелоидной тканей), изменчивость их клеточного состава (как количественно, так и качественно). Такие перестройки, как правило, соответствуют индукции компенсаторно-пластических процессов, способствующих адаптации системы крови и иммунитета к высоким уровням антигенной нагрузки и интенсификации метаболизма [7—9]. Селезёнка обладает достаточно высоким регенераторным потенциалом у лабораторных животных. При этом показан феномен спленозарезидуальной селезёночной ткани и формирование спленоидов, или добавочных селезёнок, в сальнике [6].
Как правило, изменения структуры селезёнки обусловлены этапом онтогенеза, иммунопатологией или повреждением кроветворения. Возрастные изменения характеризуются нарастанием инволютивных процессов: редукцией лимфоидной
ткани и микроциркуляторного русла, увеличением объёма стромы [4, 8]. Патологические процессы выражаются в последовательности деструктивных и компенсаторных процессов, итоговой декомпенсацией функций [5, 7].
Биология селезёнки у животных из естественных местообитаний остаётся недостаточно изученной. Большой практический интерес представляет критериальное значение лиенальной морфодина-мики при высоком напряжении средовых условий вследствие трансформации биогеоценозов или более масштабных экосистем. Повышенный радиационный фон, возрастание токсикогенного потенциала разных средовых объектов (водных, почвы, воздуха), деградация растительных сообществ и другие проблемы техногенного прессинга на живые объекты требуют верификации механизмов адаптации мелких млекопитающих и способов оценки эффективности достигаемых параметров приспособления. Физиология гомеостатически значимых для организма системы крови и иммунитета нуждается в дальнейшем изучении. Здесь актуально выяснение их адаптивного потенциала и установление его конкретных параметров, как имеющих прогностическое значение.
Цель исследования — установить величину индекса селезёнки малой лесной мыши в зоне влияния Оренбургского газзавода как статистически значимого индикатора средового напряжения на техногенно преобразованной территории; гистологически верифицировать соответствующие изменения лимфоидной и миелоидной тканей селезёнки в обоснование новых условий миело-поэза и иммуногенеза.
Материал и методы исследования. Выборки самцов и самок малой лесной мыши для исследования формировали из элементарных популяций,
* Работа поддержана грантом правительства Оренбургской области. Постановление № 472-п от 26.06.2017 г.)
